一种使用gc-ms法测定茶叶中生物碱的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于茶叶的理化检验技术领域，具体说是一种使用GC-MS法测定茶叶中生 物碱的方法，是涉及茶叶中烟碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、新烟碱和可替宁的测定技术。
【背景技术】
[0002] 烟草生物碱是烟草极为重要的一类化学成分。烟碱、降烟碱、假木贼碱、新烟草碱 是主要生物碱，通常称除烟碱之外的其他生物碱为"次要生物碱"。烟草属茄科烟属，可分为 3个亚属，即普通烟草、黄花烟草和碧冬烟草，共14组66种，在同一个种内，烟草主要生物碱 含量相对稳定，但不同种间生物碱含量差异极大。其中，50-60%的种以烟碱为主要生物碱， 烟碱占总生物碱比例在80%以上，包括有栽培利用价值的普通烟草和黄花烟草。30-40%的种 以降烟碱占优势，这些种具有烟碱转甲基酶活性，烟碱在去甲基酶作用下大量转化为降烟 碱，如在拟穗状烟草中，其占总生物碱含量比高达92.7%。假木贼碱在5个种中为主要生物 碱，最高含量比可达86.7%(粉蓝烟草），而新烟草碱通常在每个种中含量都不是绝对高，只 在少数种中含量相对较高。
[0003] 烟草中含有数十种次要生物碱，如降烟碱、新烟草碱、假木贼碱、麦斯明、可替宁、 2,3'_二啦啶、3,3'_二啦啶、二烯烟碱、N-甲基假木贼碱、二烯降烟碱等，其中降烟碱、新烟 草碱和假木贼碱的含量相对较高，研究也最多。次要生物碱在烟草中广泛分布，但在其它植 物类含量甚少。仅有极少文献报道一些其他茄科类植物中也可能含有次要生物碱，如白夜 丁香(Cestrum diurnum)不但含有烟碱，还含有降烟碱、可替宁和麦斯明，夜丁香(Cestrum nocturnum)含有烟碱和降烟碱，一些茄科澳洲毒茄属植物也含有烟碱和降烟碱，其中有一 种灌木树叶Duboisia hopwoodii，还被当地土著居民用来制作嚼烟。但其他前科类植物中 含有的次要生物碱种类与烟草有差异。茶叶作为人们日常生活中的常用食品，对于其中所 含生物碱的测定很有意义，但目前已公开的测定方法很少，曾有文献报道茶叶中有烟碱的 检出，但方法较为繁琐。
[0004] 《YC/T 383-2010烟草及烟草制品烟碱、降烟碱、新烟碱、麦斯明和假木贼碱的测 定气相色谱-质谱联用法》针对烟草产品开发了检测方法，但是烟碱在烟草中的含量达到 3%的含量，远远高于茶叶中的含量UOyg/kg)，因此该方法不能直接用于茶叶的生物碱含量 检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的正是基于上述现有技术状况，而提供一种使用GC-MS法测定茶叶中 烟碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、新烟碱和可替宁的方法。利用本发明提供的测定方法，能 快速、高效、环保地检测茶叶中烟碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、新烟碱和可替宁的含量。
[0006] 本发明正是在上述综合文献报道的基础上，建立了茶叶中烟碱及次要生物碱的检 测方法，并应用建立的方法检测了茶叶中烟碱及次要生物碱含量，发现茶叶中不仅有烟碱 的检出，同时也有其他次要生物碱的检出。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 一种使用GC-MS法测定茶叶中生物碱的方法，包括烟碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、新 烟碱和可替宁的测定，具体包括以下步骤： 1)萃取溶液的配制:配制浓度为0.01%三乙胺的甲基叔丁基醚溶液为萃取溶液，具体配 制方法为：准确移取50ul的三乙胺溶液到500mL的容量瓶中，加入甲基叔丁基醚定容至刻 度，配置成浓度为0.01%三乙胺/甲基叔丁基醚溶液。
[0008] 2)样品的处理:称取2 g茶叶末放入50 mL离心管中，然后加入1.0~6.OmLIO%的氢 氧化钠溶液，静置10 min，取10 mL步骤1)所配的萃取溶液到离心管中，并加入200 yL的 内标溶液，于旋祸混合器上以2000 rpm速度振荡1 min;取1.0 mL上清液于内含150 mg无水 硫酸镁，50 mg PSA吸附剂，50 mg C18E吸附剂的2 mL净化离心管中，于旋祸混合器上以 2000 rpm振荡2 min，以5000 rpm离心3 min，取上清液过0.22 μπι有机相滤膜后，进GC-MS检 测； 所述内标为2-甲基喹啉，内标溶液浓度为800 yg/mL，用萃取溶液配制。
[0009] 3)标准工作溶液制备： 用萃取溶液配制六个不同浓度的均含有200yL内标溶液的烟碱系列标准溶液（因烟碱 会降解为降烟碱和麦斯明，所以要单独配制），浓度范围：1.144-57.2 yg/mL， 用萃取溶液配制六个不同浓度的均含有200yL内标溶液的降烟碱系列标准溶液，浓度 范围：1.456-72.8yg/mL， 用萃取溶液配制六个不同浓度的均含有200yL内标溶液的麦思明、可替宁、假木贼碱、 和新烟碱的混合标样系列标准溶液，各成分浓度范围：麦思明：〇. 792-39.6yg/mL，可替宁： 1.264-63.2yg/mL,假木贼碱：1.376-68.8yg/mL,新烟碱:0.88-44yg/mL; 标准工作溶液的具体配制方法如下： ①标准储备液的配制： 烟碱储备液:准确称取约15. Omg烟碱，置于25mL的棕色容量瓶中，用0.01%三乙胺/甲基 叔丁基醚溶液(即萃取溶液)稀释定容至刻度，该溶液在4°C~8°C条件下避光保存； 降烟碱储备液:准确称取约15. Omg降烟碱，置于25mL的棕色容量瓶中，用0.01%三乙胺/ 甲基叔丁基醚溶液(即萃取溶液)稀释定容至刻度，该溶液在4°C~8°C条件下避光保存； 麦斯明储备液:准确称取约10.Omg麦斯明，置于25mL的棕色容量瓶中，用0.01%三乙胺/ 甲基叔丁基醚溶液(即萃取溶液)稀释定容至刻度，该溶液在4°C~8°C条件下避光保存。 [0010]假木贼碱和新烟碱混标储备液:准确称取约15. Omg假木贼碱、10.0 mg新烟碱置于 25mL的棕色容量瓶中，用0.01%三乙胺/甲基叔丁基醚溶液（即萃取溶液)稀释定容至刻度， 该溶液在4°C~8°C条件下避光保存； 可替宁储备液:准确称取约15. Omg可替宁，置于25mL的棕色容量瓶中，用0.01%三乙胺/ 甲基叔丁基醚溶液(即萃取溶液)稀释定容至刻度，该溶液在4°C~8°C条件下避光保存。 [0011]②系列标准工作溶液： 烟碱工作标准溶液:分别移取20yL、50yL、100yL、250yL、500yL、lmL的烟碱储备液于不 同的10mL棕色容量瓶中，再准确加入200yL内标溶液，用0.01%三乙胺/甲基叔丁基醚溶液稀 释定容至刻度，得到六个不同浓度的烟碱系列标准溶液。
[0012] 降烟碱工作标准溶液:分别移取20yL、50yL、100yL、250yL、500yL、lmL的降烟碱储 备液于不同的lOmL棕色容量瓶中，再准确加入200yL内标溶液，用0.01%三乙胺/甲基叔丁基 醚溶液稀释定容至刻度，得到六个不同浓度的降烟碱系列标准溶液。
[0013] 麦斯明、可替宁、假木贼碱和新烟碱的混和标样工作标准溶液:分别移取20μL、50μ L、lOOyL、250yL、500yL、lmL的麦斯明、可替宁、假木贼碱和新烟碱混标储备液于不同的10mL 棕色容量瓶中，再准确加入200yL内标溶液，用0.01%三乙胺/甲基叔丁基醚溶液稀释定容至 刻度，得到六个不同浓度的麦斯明、可替宁、假木贼碱和新烟碱的混和标样系列标准溶液。
[0014] 4)气相色谱/质谱联用法测定:利用气相色谱/质谱联用仪对标准工作溶液和样品 处理液进行检测，气相色谱/质谱联用仪条件如下： 色谱柱:恪融石英毛细管柱，30m X 0.25mm X 0.25μηι，固定相:35%-苯基-甲基聚娃氧 烷;载气:氦气，载气流速：1. 〇 mL/min;进样口温度:250°C;进样量3yL，分流进样，分流比5: 1;采用程序升温方式:初始温度：l〇〇°C;初始时间：3min;以8°C/min速率由100°C升至260 °C，保持lOmin，总运行时间：33min; 检测器：质谱检测器;溶剂延迟:8min;电离电压：70ev;离子源温度：230°C ;传输线温 度：280°C;扫描离子范围：33~400amu;质谱扫描方式:选择离子监测（SHO。各化合物定量 及定性离子参见表1。
[0015] 表1质谱检测器检测生物碱的保留时间及定量定性离子
5)测定方法：以目标物的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线;对制 备好的样品进行测定，测得检出目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，分别得到样品中的烟 碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、新烟碱和可替宁的含量。
[0016] 与现有技术相比本发明克服了现有技术样品处理方法的不足，优化了仪器检测条 件，本发明具有如下效果： (1) 检测时间短:采用本发明测定茶叶中烟碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、新烟碱、麦思 明和可替宁周期仅需要33分钟左右； (2) 本发明具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。
[0017]①本发明方法的标准曲线和检獅艮： 采用气相色谱-质谱联用仪测定烟碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、新烟碱和可替宁的标 准系列溶液，得到6种化合物和内标的积分峰面积，分别用6种化合物的积分面积与内标峰 面积的比值作为纵坐标，各化合物的浓度与内标浓度比值作为横坐标，分别建立6种化合物 的校正曲线。定量采用2-甲基喹啉作为内标。对校正数据进行线性回归，R 2应不小于0.99。 测定样品时，根据样品中的峰面积计算萃取液中6种化合物的浓度(yg/mL)。
[0018] 表2茶叶中烟碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、新烟碱和可替宁的标准曲线和检测限
注:检出限以3倍信噪比（S/N = 3)计算。
[0019] ②本发明方法的重复性和加标回收率： 表3方法的回收率与重复性（n=3)
对样品进行高、中、低不同浓度水平的标准溶液加标回收率试验，每个样品分别测定3 次，计算本方法各种茶叶中烟碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、新烟碱和可替宁的回收率及加 标后测定值