参乌益肾片成分检测方法及指纹图谱构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分析化学领域，特别涉及参乌益肾片成分检测方法及指纹图谱构建方 法。
【背景技术】
[0002] 肾脏的生理功能主要是排泄代谢产物及调节水、电解质和酸碱平衡，分泌多种活 性物质，维持机体内环境稳定，以保证机体的正常生理功能。肾炎是由免疫介导的、炎症介 质（如补体、细胞因子、活性氧等)参与的，最后导致肾固有组织发生炎性改变，引起不同程 度肾功能减退的一组肾脏疾病，可由多种病因引起。在慢性过程中也有非免疫、非炎症机制 参与。肾炎的主要表现:乏力、腰部疼痛、纳差、肉眼血尿、水肿、高血压、肾功能异常、尿量减 少(部分患者少尿）、充血性心力衰竭等。一旦罹患肾炎将会给患者带来极大的痛苦。
[0003] 参乌益肾片是由制何首乌、菟丝子、太子参、麸炒苍术和枸杞子等12味药组成的成 方制剂，补益肾元，健运脾肾，活血和络，渗湿泄浊。适用于慢性肾炎、慢性肾盂肾炎、糖尿病 肾病、高血压性肾损害等原因所致的慢性肾功能衰竭气阴两虚兼湿浊证患者。参乌益肾片 中的主要成分有萜类、酚酸类及蒽醌类等成分。
[0004] 随着我国中药制剂的快速发展，中药制剂的质量管理问题也受到了人们的广泛关 注，其质量的优劣会直接影响到医疗质量和患者生命安危。影响中药制剂质量的因素主要 包括：
[0005] 1、原药材的质量
[0006] 中药材的质量好坏是直接影响中药制剂临床疗效的关键原因之一，由于目前中药 材的来源较为复杂，且品种繁多，许多药材市场常常以次充好从中取得大量的经济利益。此 外，现今我国药材市场对野生药材的供应相对缺乏再加上受到国家对野生自然资源采集的 限制许多地方采取用种植的药材来代替这种家种的药材会严重影响药剂的质量，使药材的 质量下降，特别是过量使用化肥，大幅度提升家中药材的产量，从而导致这与野生药材的气 味发生了改变，从而影响了中药的疗效。
[0007] 2、生产过程
[0008] 在中药制剂的每一个环节中从投料到制剂的制备都需要投料人员认真仔细的按 照工艺中的处方核查所投的药味及数量，如果少投或者多投都会影响到产品的整体质量。 此外，还要注意中药制剂的粉碎、浓缩、干燥、精制和提取等方面的工序，这对中药成品的成 分含量具有较大的影响作用。因此，在工艺设计时应根据药材的性质进行综合性的思考，选 择最优的制备条件和最佳工艺，并做好工序中的质量监督工作，从而保障中药制剂的质量。
[0009] 3、工艺用水、洁净区环境、工艺卫生
[0010] 在制剂时，工艺用水也是重要的一个步骤，如果工艺卫生和洁净区环境存在不合 格的情况，那将会直接引发微生物的滋生和污染，从而导致生产的制剂出现不合格的产品。
[0011] 4、包装材料及现代包装技术
[0012] 现今制剂的包装材料也是影响制剂质量的关键，例如塑料具有透气性和吸附性， 它既能保证液体药物的溶媒挥发，也会使其含挥发成分的药物性能改变，加速药物的分解， 使用劣质的保障袋，也会使有害的物质渗入制剂当中，此外，由于中药制剂具有剂型多、品 种繁杂和生产量小等特点，因此，就会出现因包装袋质量差而导致液体剂外漏、液体发生霉 变、药液与包装之间发生反应、固体制剂因为受潮变质等问题的出现，这严重影响制剂的质 量。
[0013] 因此，为了更好地对药品质量进行控制，保证其临床疗效，需建立全面评价该制剂 质量的方法。目前关于参乌益肾片的质量控制方法尚无明确报道，因此提供一种参乌益肾 片的质量控制方法具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0014] 有鉴于此，本发明提供了参乌益肾片成分检测方法及指纹图谱构建方法。本发明 得到分离度、重现性均较好的参乌益肾片指纹图谱，标示出13个共有峰，各批次样品相似度 在0.96以上;通过对照品比对，确定了3个成分，分别为二苯乙烯苷（2,3,5,4'_四羟基二苯 乙烯-2-〇-i3_D-葡萄糖苷）、芍药苷、芍药内酯苷，并对其进行定量分析。本发明对参乌益肾 片指纹图谱和3个指标成分进行分析，快速、简便、准确，可作为全面评价该制剂质量的有效 方法之一〇
[0015] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0016] 本发明提供了一种参乌益肾片成分检测方法，取参乌益肾片供试品溶液以及标准 品溶液进行HPLC检测，HPLC检测的色谱条件为：
[0017] 采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A相、酸的水溶液为流动相B相，梯度洗脱程序为： 0~15111；[11，8%~20%乙臆；15~30111；[11，20%~30%乙臆；30~50111；[11，30%~90%乙臆；50~ 60min，90% 乙臆；
[0018] 根据HPLC检测结果，获得参乌益肾片成分及其含量。
[0019] 作为优选，HPLC检测的波长为210nm~250nm和/或320nm。
[0020] 在本发明提供的一些实施例中，检测波长为210~250nm时，色谱峰较全面且各色 谱峰分离较好，适宜指纹图谱的建立。作为优选，检测波长为230nm。
[0021] 在本发明提供的一些实施例中，在测定参乌益肾片中有效成分含量时，选择210~ 250nm检测芍药苷、芍药内酯苷的含量，选择320nm检测二苯乙烯苷的含量。作为优选，检测 芍药苷、芍药内酯苷的含量的检测波长为230nm。
[0022] 在本发明提供的一些实施例中，酸为磷酸、甲酸、冰乙酸或三氟乙酸中的一种或两 者以上的混合物。
[0023]作为优选，酸为磷酸。
[0024]在本发明提供的一些实施例中，在酸的水溶液中，酸的体积百分数为0.1%~ 0.5%〇
[0025]在本发明提供的一些实施例中，在酸的水溶液中，磷酸、甲酸或三氟乙酸的体积百 分数为〇. 1 %。
[0026]在本发明提供的一些实施例中，在酸的水溶液中，冰乙酸的体积百分数为0.5%。 [0027] 作为优选，HPLC检测的流动相流速为0.8~1.5mL/min。
[0028] 优选地，HPLC检测的流动相流速为1 .OmL/min。
[0029] 作为优选，HPLC检测的柱温20°C~40°C。
[0030] 优选地，HPLC检测的柱温30。(3。
[0031 ]作为优选，C18色谱柱为Thermo syncronis C18色谱柱、Agilent 5TC-C18色谱柱、 Kromasil 100-5C18色谱柱、Waters symmetry C18色谱柱或Phenomenex Luna C18色谱柱。 [0032] 在本发明提供的一些实施例中，C18的柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μπι，以 (4 · 6 X 250mm，5μηι)表不。
[0033] 在本发明提供的一些实施例中，HPLC检测的理论板数不低于3000。
[0034] 作为优选，标准品溶液为二苯乙烯苷标准品溶液、芍药苷标准品溶液或芍药内酯 苷标准品溶液中的一种或两者以上的混合物。
[0035]作为优选，在标准品溶液中二苯乙烯苷的含量为70.25~281.00yg/mL。
[0036] 在本发明提供的一些实施例中，在标准品溶液中二苯乙烯苷的含量为86.86yg/ mL〇
[0037] 作为优选，在标准品溶液中芍药苷的含量为37.26~149.04yg/mL。
[0038] 在本发明提供的一些实施例中，在标准品溶液中芍药苷的含量为60.01yg/mL。
[0039] 作为优选，在标准品溶液中芍药内酯苷的含量为34.97~139.88yg/mL。
[0040] 在本发明提供的一些实施例中，在标准品溶液中芍药内酯苷的含量为88.32yg/ mL〇
[0041 ]作为优选，参乌益肾片供试品溶液的制备方法为:取参乌益肾片与乙醇水溶液混 合，超声提取，冷却，乙醇水溶液补足减失质量，混匀，过滤，取续滤液过滤膜，得到参乌益肾 片供试品溶液。
[0042] 作为优选，乙醇水溶液的体积百分数为60%~80%。
[0043]优选地，乙醇水溶液的体积百分数为70%。
[0044] 作为优选，以g/mL计，参乌益肾片与乙醇水溶液的比例为1: (40~60)。
[0045] 优选地，以g/mL计，参乌益肾片与乙醇水溶液的比例为1:50。
[0046] 作为优选，超声的功率为100~500W，频率为10~100kHz。
[0047] 优选地，超声的功率为250W，频率为40kHz。
[0048] 作为优选，超声提取的时间为40~50min。
[0049] 优选地，超声提取的时间为45min。
[0050] 在本发明提供的一些实施例中，滤膜的孔径为0.22μπι。
[0051] 本发明还提供了一种参乌益肾片指纹图谱构建方法，取不同批次的参乌益肾片供 试品溶液进行HPLC检测，HPLC检测的色谱条件为：
[0052]采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A相、酸的水溶液为流动相B相，梯度洗脱程序为： 0~15111；[11，8%~20%乙臆；15~30111；[11，20%~30%乙臆；30~50111；[11，30%~90%乙臆；50~ 60min，90% 乙臆；
[0053]根据HPLC检测结果，标定共有峰，以中位数法建立参乌益肾片指纹图谱。
[0054] 在本发明提供的一些实施例中，HPLC检测的检测波长为210~250nm时，色谱峰较 全面且各色谱峰分离较好，适宜指纹图谱的建立。作为优选，检测波长为230nm。
[0055]在本发明提供的一些实