一种用于o糖基化肽段及其完整糖链的鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种0糖基化肽段及其完整糖链的鉴定方法，具体是先对样品进行PNGase F酶处理，去除N糖基化修饰的干扰，然后再进行酶解。酶解后的肽段经过亲水作用色谱富集后进入质谱分析，使用Triple-TOF质谱的碰撞诱导解离模式得到丰富的碎片信息进行数据库检索，最终得到完整的0糖基化修饰肽段的鉴定结果。
【背景技术】
[0002]0糖基化是一种常见的蛋白质糖基化修饰，研究表明0糖基化在细胞粘附、细胞信号通讯、免疫应答和蛋白质转换酶加工等方面具有重要作用，并且还与癌症的生长和转移有密切联系。因此开发一种高效准确的0糖基化修饰鉴定方法具有非常重要的意义。
[0003]目前0糖基化鉴定面临的主要困难有以下几点:1)没有类似于PNGaseF的糖苷酶能够将0链接的糖链特异性的从蛋白质或者肽段上切除，因此N糖链分析中常用的切除后再分析的手段无法应用；2)0糖链的核心结构比N糖链复杂，N糖链拥有一个固定的五碳糖核心，而0糖链理论上有八种不同的核心结构，其中有两种核心最为常见，而其他类型的核心结构亦有报道；3)N糖链在蛋白上的连接位置呈现出特异的模体序列NX[S/T]，因此可以根据位点是否符合此序列来判断N糖基化修饰鉴定的可靠性，而0糖基化修饰没有这样的固定序列，增加了鉴定的困难。
[0004]同非修饰肽段相比，糖基化肽段的丰度比较低，导致在质谱检测中信号会被非修饰肽段抑制，因此检测之前必须对样品进行富集。亲水作用色谱法是一种常用的糖肽富集方法，它的两大优点是:1)对糖基化肽段上的糖链没有任何破坏性；2)对富集的糖链类型没有选择性。因此，亲水作用色谱法可以在保持糖链完整性的同时对不同类型的糖链都进行富集，是研究糖链多样性的最佳选择。但是由于亲水作用色谱对N链接糖和0链接糖都具有富集效果，而生物样品中，大部分蛋白质是N糖基化修饰的，因此会对0糖基化的分析产生很大的干扰。除了样品的预处理之外，质谱碎裂方式对于完整0糖肽的鉴定也极为重要。常用的碎裂方式包括线性离子阱质谱中的碰撞诱导解离(LTQ-CID)、高能碰撞裂解(HCD)、电子转移裂解(ETD)以及飞行时间质谱的CID模式(TOF-CID)。LTQ-CID和HCD两种碎裂方式主要碎裂糖链中单糖间的糖苷键，而不能对肽段序列骨架进行碎裂，因此只能得到糖链组成的信息。而ETD虽然能够得到一些肽段序列的信息，但是谱图质量比较差，当0糖肽中存在唾液酸时会发生很强的中性丢失，以至于在数据库检索时肽段鉴定的打分值非常低。与以上三种碎裂模式不同的是，T0F-CID既能够得到比较完整的肽段序列骨架信息，也能够获得糖基化位点和糖链组成的信息，因此更适用于糖肽及其完整糖链的鉴定。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是准确高效的实现对0糖基化肽段序列、糖基化位点和糖链结构的同时鉴定，从而对糖基化修饰位点的不均一性进行研究。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0007]首先对样品进行预处理，去除N糖基化修饰的干扰。本发明采用的是一种结合超滤辅助样品预处理系统的方法，使蛋白质样品首先在超滤管内完成变性、还原和烷基化，然后通过加入PNGase F糖苷酶将蛋白质上的N糖链特异性地切除，并超滤除去切除的糖链。随后加入蛋白酶对蛋白质进行酶解，最后得到的样品用亲水色谱法富集其中的完整0糖肽。
[0008]本发明由于采用以上技术方案，其具有以下优点:1)灵敏度高，去除了 N糖基化修饰的干扰，能有效提高0糖基化鉴定的灵敏度；2)采用超滤辅助样品预处理系统进行样品制备，操作简单快速；3)富集过程不破坏原始的糖链结构，可以鉴定样品中真实的0糖基化状态。
[0009]本方法包含从实验操作到数据处理的完整操作流程，其主要面向复杂样品的高通量0糖基化修饰位点结构微不均一性的分析。样品预处理方法中的去N糖基化修饰步骤大大降低了 N糖基化的干扰，而基于亲水作用色谱的富集方法有效的实现了 0糖基化肽段的富集。Triple-TOF质谱分析的CID模式提供了丰富的碎片信息，使得糖基化肽段及完整糖链的鉴定得以实现。
【附图说明】
[0010]图1完整0糖肽分析流程图。
【具体实施方式】
[0011 ] 实施例1牛胎球蛋白的0糖基化分析:
[0012]1、100 μ g牛胎球蛋白标准样品加入到分子量截留为lOkDa的0.5mL超滤管内，力口入300 μ L 8Μ尿素/lOOmM NH4HC03,在离心力14000g下超滤15分钟，并用300 μ L 8M尿素/100mM順4!10)3重复超滤一次。
[0013]2、向上述超滤管中加入10 μ L 1Μ DTT，在37°C反应2小时，再加入3.8mg IAA，室温避光下反应40分钟。超滤15分钟除去多余的DTT或IAA，并用400 μ L Η20洗两次，每次超滤15分钟，离心力为14000g。
[0014]3、超滤完成后，在上述超滤管的蛋白质样品中加入PNGase F糖甘酶2yL，37C过夜反应。反应完成后再超滤一次，加入400 μ L Η20洗两次，每次超滤15分钟，离心力为14000go
[0015]4、上述操作完成后，再往上述超滤管中加入5yg弹性蛋白酶进行酶解，样品置于37 °C水浴中过夜酶解，完成后超滤收集蛋白酶解液，超滤管加200 μ L Η20洗三次，最后将样品冻干后放置于_20°C保存。
[0016]5、取一支Eppendorf公司的20 μ L GELoader移液器吸头，首先将吸头的尖端填上一段约为1mm的脱脂棉筛子，并将多余的尖端切除，然后将点击化学连接麦芽糖的亲水性微球分散在8 0 %乙腈中，取2 0 m g以离心的方式填充在移液器吸头中制成一支亲水微柱。亲水微球的粒径为4 μ m，制备方法见文献Guo Z.Μ.，Lei A.ff.，Zhang Y.P.，Xu Q.，XueX.Y., Zhang F.F., et al.〃Click saccharides ":novel separat1n materials forhydrophilic interact1n liquid chromatography.Chem Commun, 2007, (24):2491-2493和 Guo Z.M., Lei A.ff., Liang X.M.,Xu Q.Click chemistry: a new facile andefficient strategy for preparat1n of funct1nalized HPLC packings.ChemCommun, 2006, (43):4512_4514。在亲水微柱中加入10uL H20离心清洗一次，最后加入10 μ L 80%乙腈离心清洗后备用。
[0017]6、富集过程首先将蛋白酶解液溶于20 μ L的80% ACN(v/v)/l% TFA(v/v)水溶液中，然后将溶液加入亲水微柱，置于微型离心机中以4000g的速度离心15分钟。亲水微柱用20μ L 80% ACN(v/v)/l% TFA(v/v)水溶液洗两次，每次离心15分钟左右。最后保留在亲水微柱上的糖肽样品通过加入80 μ L含0.1 %甲酸(ν/ν)的水溶液进行离心洗脱并收集洗脱液。最后样品经冷冻干燥后置于-80°C冰箱中保存备用。
[0018]7、样品在 Triple-TOF 5600 (AB SCIEX)系统上进行分析，系统配置 NanoACQUITYUPLC(Waters)超高效液相色谱仪和飞行时间质谱。其分离系统是由一根3cm长的毛细管C18预柱(20(^111内径)、一根20cm长的毛细管分析柱(75 μ m内径)和一根5cm长的毛细管电喷雾喷针(PicoTip Emitter,New Objective)组成。液相流速通过分流控制在350 μ L/min。反相分离梯度设置为:5min 0-5%流动相B (98%乙腈/1.9%水/0.1 %甲酸)，90min5% -25%流动相B，15min25% -70%流动相B，在70%流动相B冲洗lOmin后，整个系统用100%流动相A(0.1%甲酸/98%水/1.9%乙腈)平衡lOmin至下次进样。
[0019]8、Triple-TOF 5600质谱喷雾电压设置为2.3kV，仪器的数据采集为信息依赖型模式，每个全扫描之后选择其中40个丰度最高的离子进行二级碎裂。母离子的质量范围设置为m/z 350-1250，碎片离子的质量范围设置为m/z 100-1500。
[0020]9、质谱采集得到的数据首先转化为MGF格式，生成的谱图用Mascot软件进行检索，使用的数据库是牛胎球蛋白数据库，共包含两条序列。其他检索参数为:母离子质量容忍度设为20ppm，碎片离子质量容忍度设为0.1Da，酶切位点设为KR/P，最大漏切位点数2，固定修饰包括半胱氨酸(Cys)增加+57.0215Da,可变修饰包括天冬酰胺(Asn)和甲硫氨酸(Met)上分别增加+0.9840Da和+15.9949Da,以及0糖基化修饰包括丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)上分别增加 +365.1322Da (Gal-GalNAc)、+656.2276Da (NeuAc-Gal-GalNAc)、+730.2644Da (Gal-(Gal-GlcNAc-)GalNAc)、+947.323Da (NeuAc-Gal-(NeuAc-)GalNAc)、+1021.3598Da(NeuAc-Gal-(Gal-GlcNAc_)GalNAc)和 +1312.4552Da(NeuAc-Gal-(NeuAc-Gal-GlcNAc-)GalNAc)。
[0021]分析结果:为了说明去除N糖基化的作用，采取了对照试验的方式，在其他步骤完全相同的前提下不进行第三步骤的去N糖基化处理过程。结果去除N糖基化修饰后用本方法