共鉴定到569条完整糖肽，而不去除N糖基化修饰则鉴定到200条完整糖肽，可见本方法采取的策略明显提高了鉴定的灵敏度。
[0022]实施例2人血清蛋白的0糖基化分析
[0023]1、60 μ L人血清样品加入到分子量截留为lOkDa的0.5mL超滤管内，加入300 μ L8Μ尿素/lOOmM NH4HC03，在离心力14000g下超滤15分钟，并用300 μ L 8Μ尿素/100mMNH4HC03重复超滤一次；
[0024]2、向上述超滤管中加入10 μ L 1Μ DTT，在37°C反应2小时，再加入3.8mg IAA，室温避光下反应40分钟。超滤15分钟除去多余的DTT或IAA，并用400 μ L Η20洗两次，每次超滤15分钟，离心力为14000g。
[0025]3、超滤完成后，在上述超滤管的蛋白质样品中加入PNGase F糖甘酶2yL，37C过夜反应。反应完成后再超滤一次，加入400 μ L Η20洗两次，每次超滤15分钟，离心力为14000go
[0026]4、上述操作完成后，再往上述超滤管中加入5 μ g弹性蛋白酶进行酶解，样品置于37 °C水浴中过夜酶解，完成后超滤收集蛋白酶解液，超滤管加200 μ L Η20洗三次，最后将样品冻干后放置于_20°C保存。
[0027]5、取一支Eppendorf公司的20 μ L GELoader移液器吸头，首先将吸头的尖端填上一段约为1mm的脱脂棉筛子，并将多余的尖端切除，然后将点击化学连接麦芽糖的亲水性微球分散在80 %乙腈中，取20mg以离心的方式填充在移液器吸头中制成一支亲水微柱。亲水微球的粒径为4μπι，制备方法见文献Guo Z.M., LeiA.ff., Zhang Y.P., Xu Q., Xue X.Y., Zhang F.F., et al."Click saccharides ":novelseparat1n materials for hydrophilic interact1n liquid chromatography[J].Chem Commun, 2007，(24):2491-2493 和 Guo Z.M., Lei A.ff., Liang X.M., Xu Q.Clickchemistry:a new facile and efficient strategy for preparat1n of funct1nalizedHPLC packings.Chem Commun, 2006，(43): 4512—4514。在亲水微柱中加入 10 μ L Η20 离心清洗一次，最后加入10yL 80%乙腈离心清洗后备用。
[0028]6、富集过程首先将蛋白酶解液溶于20 μ L的80% ACN(v/v)/l% TFA(v/v)水溶液中，然后将溶液加入亲水微柱，置于微型离心机中以4000g的速度离心15分钟。亲水微柱用20μ L 80% ACN(v/v)/l% TFA(v/v)水溶液洗两次，每次离心15分钟左右。最后保留在亲水微柱上的糖肽样品通过加入80 μ L含0.1 %甲酸(ν/ν)的水溶液进行离心洗脱并收集洗脱液。最后样品经冷冻干燥后置于-80°C冰箱中保存备用。
[0029]7、样品在 Triple-TOF 5600 (AB SCIEX)系统上进行分析，系统配置 NanoACQUITYUPLC (Waters)超高效液相色谱仪和飞行时间质谱。其分离系统是由一根3cm长的毛细管C18预柱(20(^111内径)、一根20cm长的毛细管分析柱(75 μ m内径)和一根5cm长的毛细管电喷雾喷针(PicoTip Emitter,New Objective)组成。液相流速通过分流控制在350 μ L/min。反相分离梯度设置为:5min 0-5%流动相B (98%乙腈/1.9%水/0.1 %甲酸)，90min5% -25%流动相B，15min25% -70%流动相B，在70%流动相B冲洗lOmin后，整个系统用100%流动相A(0.1%甲酸/98%水/1.9%乙腈)平衡lOmin至下次进样。
[0030]8、Triple-TOF 5600质谱喷雾电压设置为2.3kV，仪器的数据采集为信息依赖型模式，每个全扫描之后选择其中40个丰度最高的离子进行二级碎裂。母离子的质量范围设置为m/z 350-1250，碎片离子的质量范围设置为m/z 100-1500。
[0031]9、质谱采集得到的数据首先转化为MGF格式，生成的谱图用Mascot软件进行检索，使用的数据库是牛胎球蛋白数据库，共包含两条序列。其他检索参数为:母离子质量容忍度设为20ppm，碎片离子质量容忍度设为0.1Da，酶切位点设为KR/P，最大漏切位点数2，固定修饰包括半胱氨酸(Cys)增加+57.0215Da,可变修饰包括天冬酰胺(Asn)和甲硫氨酸(Met)上分别增加+0.9840Da和+15.9949Da,以及0糖基化修饰包括丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)上分别增加 +365.1322Da (Gal-GalNAc)、+656.2276Da (NeuAc-Gal-GalNAc)、+947.323Da(NeuAc-Gal-(NeuAc-)GalNAc)。然后通过提高谱图打分值的门槛来控制检索结果的质量，最终使得鉴定的假阳性率小于1%。
[0032]结果分析:对应于三种酶切方法，对血清样品的分析最终得到了 2193、2192和1450条完整0糖肽段，鉴定位点数目为385个，糖链结构特异的糖基化位点数目878个。在这385个位点中，48 %的位点鉴定到两种及以上的糖链结构，充分证明了本方法能有效应用于复杂样品的糖链结构的微不均一性分析。
【主权项】
1.一种用于0糖基化肽段及其完整糖链的鉴定方法，其特征在于: 首先使糖基化蛋白质样品在超滤管内完成变性、还原和烷基化，然后通过加入糖苷酶反应将蛋白质上的Ν糖链特异性地切除，并超滤除去切除的糖链；随后加入蛋白酶对蛋白质酶解，最后得到的样品溶解后并加入亲水微柱，离心，亲水微柱洗涤；最后保留在亲水微柱上的糖肽样品进行离心洗脱并收集洗脱液；对完整糖肽样品使用Triple-TOF质谱进行检测，最后通过数据库检索得到完整糖肽的信息。2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于: 具体过程为，首先使糖基化蛋白质样品在分子量截留为10 kDa的超滤管内完成变性、还原和烷基化，然后通过加入2yL PNGase F糖苷酶37°C过夜反应将蛋白质上的N糖链特异性地切除，并超滤15分钟除去切除的糖链；随后加入胰蛋白酶(蛋白样品与酶的质量比例为25:1)对蛋白质在37°C酶解12小时，最后得到的样品溶于20 μ L 80% ACN(v/v)/l%TFA (v/v)中并加入亲水微柱，置于微型离心机中4，000g下离心15分钟，亲水微柱用20 μ L80% ACN(v/v)/l% TFA (v/v)水溶液洗两次，每次离心15分钟左右；最后保留在亲水微柱上的糖肽样品通过加入80yL含0.1%甲酸(v/v)的水溶液进行离心洗脱并收集洗脱液；对完整糖肽样品使用Triple-TOF质谱进行检测，最后通过Mascot软件检索得到完整糖肽的信息。3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于: 采用超滤辅助样品预处理系统进行样品制备，整个预处理过程在同一个超滤管中进行，通过使用 300 μ L 8M 尿素 /lOOmM NH4HC03 重复两次、10 μ L 1M DTT、3.8mg ΙΑΑ、400 μ LH20重复两次洗涤、离心和超滤来完成糖基化蛋白质样品的变性、还原和烷基化，最后在同一个超滤管内加入PNGase F糖苷酶1，000单位进行N糖链的切除。4.根据权利要求1或2所述的鉴定方法，其特征在于: 该亲水微柱是由一根移液器吸头和填充在其中的亲水性材料组成，所用的亲水材料是一种通过点击化学连接麦芽糖的微球；微球为Si02材料，键合后的亲水微球的粒径为4 μ m。5.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于: 使用Triple-TOF 5600系统，用碰撞诱导解离的碎裂方式对样品进行分析。6.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于: 参数为:母离子质量容忍度设为20ppm，碎片离子质量容忍度设为0.1Da，酶切位点设为KR/P，最大漏切位点数2，固定修饰包括半胱氨酸(Cys)增加+57.021?a，可变修饰包括天冬酰胺(Asn)和甲硫氨酸(Met)上分别增加+0.9840Da和+15.9949Da，以及0糖基化修饰包括丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)上分别增加+365.1322Da(Gal-GalNAc)、+656.2276Da(NeuAc-Gal-GalNAc)、+730.2644Da (Gal-(Gal-GlcNAc-)GalNAc)、+947.323Da (NeuAc-Gal-(NeuAc-) GalNAc)、+1021.3598Da (NeuAc-Gal-(Gal-GlcNAc-)GalNAc)和 +1312.4552Da(NeuAc-Gal-(NeuAc-Gal-GlcNAc-)GalNAc)。
【专利摘要】本发明涉及一种用于O糖基化肽段及其完整糖链的鉴定方法，具体是将糖基化蛋白样品首先通过PNGase？F酶切去除N糖基化修饰的干扰，然后经过亲水作用色谱的富集，最后通过飞行时间质谱进行分析的技术流程。所述的方法流程具有操作简便快速，鉴定灵敏度高等优点，可以对复杂生物样品的O糖基化肽段及其完整糖链进行鉴定，从而实现对O糖基化修饰结构微不均一性的研究。
【IPC分类】G01N30/08, G01N30/88
【公开号】CN105467050
【申请号】CN201410459295
【发明人】邹汉法, 朱俊, 程凯, 叶明亮
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2014年9月11日