一种ASE‑HPLC法测定威灵仙中齐墩果酸含量的方法与流程

本发明属于化学检测领域，尤其是一种ase-hplc法测定威灵仙中齐墩果酸含量的方法。

背景技术：

2015年版药典方法：取本品粉末(过四号筛)约4g，精密称定，置索氏提取器中，加乙酸乙酯适量，加热回流3小时，弃去乙酸乙酯液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒转移至锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，置水浴上蒸干，残渣加2mol/l盐酸溶液30ml使溶解，加热回流2小时。立即冷却，移入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中。加乙酸乙酯振摇提取3次，每次15ml，合并乙酸乙酯液，70℃以下浓缩至近干，加甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

该方法提取时间长，且对技术人员的专业水平要求较高。

技术实现要素：

针对上述不足，本发明旨在提供一种ase-hplc法测定威灵仙中齐墩果酸含量的方法，该方法提取时间短、重复性好，且检测精度高。

为了实现上述技术效果，本发明提供的技术方案是这样的：一种ase-hplc法测定威灵仙中的齐墩果酸含量的方法，依次包括下述步骤：

步骤1：采用ase法萃取威灵仙粉末，并收集甲醇萃取液；

步骤2：采用hplc法测定甲醇萃取液中的齐墩果酸的含量；

其中，步骤1所述的萃取依次包括用乙酸乙酯在80℃下去脂，在120℃下乙醇提取。

优选地，所述的步骤1包括下述子步骤：

步骤s1：将威灵仙粉碎，过三号筛，取1g与1g石英砂混合；

步骤s2：将混合物装于放有滤膜、1g硅藻土的ase萃取池中，加石英砂至与池口平行；

步骤s3：用乙酸乙酯去脂，再用乙醇提取；

步骤s4：蒸干，将沉淀用30ml盐酸溶解，加热回流2h；

步骤s5：冷却，移入分液漏斗中，加45ml乙酸乙酯提取，浓缩；

步骤s6：将步骤s5所得的浓缩物加甲醇溶解，并加甲醇定容至10ml，离心，取上清液。

优选地，步骤s3所述的去脂参数为：压力为1500psi，温度为80℃，萃取时间为3min，循环次数为2次，冲洗体积为100％，吹扫时间为60s。

优选地，步骤s3所述的提取参数为：压力为1500psi，温度为120℃，萃取时间为5min，循环次数为3次，冲洗体积为100％，吹扫时间为60s。

优选地，步骤s4所述的盐酸浓度为2mol/l。

优选地，所述的步骤5具体为：冷却，移入分液漏斗中，提取加乙酸乙酯提取3次，每次15ml，收集3次提取液，浓缩。

优选地，步骤2所述的hplc法的检测参数为：色谱柱为thermoacclaimc30；柱温为20℃；

流速为0.5ml/min；流动相为乙腈-水；检测波长为205nm。

优选地，所述的色谱柱的规格为2.1*150mm，3μm。

优选地，所述的流动相为体积比等于62：38的乙腈-水。

本发明与传统方法相比，具有以下优点：

本发明曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，《中国药典》使用乙酸乙酯除杂，采用稀乙醇提取齐墩果酸结合物再水解成齐墩果酸，杂质较少，故对使用乙酸乙酯、正己烷作为除杂溶剂，甲醇、稀乙醇、乙醇作为提取溶剂进行了溶剂考察，结果显示乙酸乙酯除杂，稀乙醇提取齐墩果酸后采用2mol/l盐酸水解后的含量与2015年版《中国药典》含量一致，且杂质峰基本相同，故采用与药典一致的提取溶剂。期间我们试采用乙酸乙酯除杂，采用5％氨水稀乙醇、3％磷酸稀乙醇作为提取和水解溶液作为仪器的萃取罐内进行水解提取，提取效果不佳，故单独采用药典的2mol/l盐酸溶液杂仪器外进行水解。

在除杂过程中，药典方法加入乙酸乙酯回流3h，时间相对较长，我们采用了多次萃取除杂的方式，发现80℃，提取3min，2次即可达到除去大部分杂质，再多的提取时间和次数已经无明显影响，而相对高的温度会是齐墩果酸结果降低，故最终确定最佳除杂工艺组合为提取温度80℃，提取时间3min，提取次数2次。提取过程中采用120℃。提取5min，提取3次即可达到与药典含量接近，更多的提取时间、温度、次数对结果已经无明显影响。最终确定最佳提取工艺组合为提取温度120℃，提取时间5min，提取次数3次。

附图说明

图1为以齐墩果酸对照品的浓度(μg/ml)-峰面积进行的线性回归图；

图2为齐墩果酸对照品溶液的色谱图；

图3为采用药典方法提取所得的供试品溶液的色谱图；

图4为采用ase法提取所得的供试品溶液的色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。

实施例1

1、仪器设备及试剂

1.1仪器：

电子分析天平(xa205du)、ase350快速溶剂萃取仪(美国dionex公司)、thermou3000uhplc液相色谱仪

1.2试剂：

水：符合gb/t6682规定的一级水；

甲醇(ch4o)：色谱纯；

乙醇(c2h60)、乙酸乙酯(c4h8o2)：分析纯；

石英砂：2mm。

2、方法

2.1对照品溶液的制备

取齐墩果酸对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含1mg的溶液，即得。

2.2供试品溶液的制备

2.2.12015年版药典方法

取本品粉末(过四号筛)约4g，精密称定，置索氏提取器中，加乙酸乙酯适量，加热回流3小时，弃去乙酸乙酯液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒转移至锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，置水浴上蒸干，残渣加2mol/l盐酸溶液30ml使溶解，加热回流2小时。立即冷却，移入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中。加乙酸乙酯振摇提取3次，每次15ml，合并乙酸乙酯液，70℃以下浓缩至近干，加甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.2快速溶剂萃取法(ase)制备供试品方法

样品经粉碎机粉碎，过三号筛，约1g，精密称定，与适量石英砂混合均匀，待用，在预先放好过滤膜的10ml萃取池中先加入1g硅藻土，后加入混合均匀的样品，再加入适量石英砂，轻轻振摇使之与池口在同一水平线下2mm处，拧紧萃取池上盖。萃取(包括除杂和提取2步，见ase条件方法)结束后，置水浴上蒸干，残渣加2mol/l盐酸溶液30ml使溶解，加热回流2小时。立即冷却，移入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中。加乙酸乙酯振摇提取3次，每次15ml，合并乙酸乙酯液，70℃以下浓缩至近干，加甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，在15000r/min下离心3min，取上清液，进入lc测定即得。

2.2.3对照品溶液的制备

取威灵仙对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含1mg的溶液，即得。

2.3ase萃取条件

去脂参数为：压力为1500psi，温度为80℃，萃取时间为3min，循环次数为2次，冲洗体积为100％，吹扫时间为60s。

提取参数为：压力为1500psi，温度为120℃，萃取时间为5min，循环次数为3次，冲洗体积为100％，吹扫时间为60s。

2.4色谱条件与系统适用性试验

a)仪器：thermo双三元液相(u-3000)；

b)色谱柱：thermoacclaimc30，2.1*150mm，3μm

c)柱温：20℃；

d)流速：0.5ml/min；

e)流动相：乙腈-水(62：38)；

f)检测波长：205nm；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；理论板数按齐墩果酸峰计算应不低于3000。

2.5测定法

照高效液相色谱法(通则0512)测定；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.6标准限值要求

本品按干燥品计算，含齐墩果酸(c30h48o3)不得少于0.30％。

2.7计算(外标法)

式中cr—对照品溶液浓度，单位为微克每升(mg/l)；

ax—供试品的峰面积；

ar—对照品峰面积。

注意：

使用前萃取池底部应拆卸清理干净，否则容易引起压力不稳；

萃取池底部的滤纸应在密封圈内，否则引起渗漏；

萃取池装样时松紧适中，太松容易导致提取液过多；

开机前检查气瓶气压是否达到1mpa；

使用结束后清理干净，萃取池要及时晾干(容易生锈)。

3、结果

3.1线性关系

取齐墩果酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml含齐墩果酸1mg的溶液，然后分别精密吸取该溶液0.1μl、0.2μl、0.5μl、0.8μl、1.0μl进入lc测定，并依照上述方法测定，结果详见表1。

以浓度(μg/ml)-峰面积进行线性回归，求得回归方程y＝0.00084x+0.03077，r＝0.99991。齐墩果酸在108.4～1084μg/ml范围内呈良好的线性关系，详见图1。

表1线性实验结果

3.2重现性实验

取相同批号的样品(批号：150410(z))1.0g，共6份，精密称定，按ase提取方法提取供试品溶液，进样量为1μl，以上述的色谱条件平行试验，测得样品中齐墩果酸的含量见表2，rsd为2.0％，结果表明ase提取方法重复性良好。

表2

3.3精密度和稳定性实验

取齐墩果酸对照品溶液(1.084mg/ml)，连续进样6次，记录峰面积，峰面积rsd为0.5％，表明仪器精密度良好。

取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0，1，3，6，12h依法测定。结果黄芪甲苷峰面积的rsd为1.5％，表明供试品溶液在12h内稳定。

3.4样品采用药典方法与sae方法含量测定结果(3批)

表3可以看出采用ase仪器1、ase仪器2和药典方法提取后的结果以及ase仪器之间的重复性均良好。

表3

4、讨论：

4.1ase提取溶剂的选择：

试验中，曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，《中国药典》使用乙酸乙酯除杂，采用稀乙醇提取齐墩果酸结合物再水解成齐墩果酸，杂质较少，故对使用乙酸乙酯、正己烷作为除杂溶剂，甲醇、稀乙醇、乙醇作为提取溶剂进行了溶剂考察，结果显示乙酸乙酯除杂，稀乙醇提取齐墩果酸后采用2mol/l盐酸水解后的含量与2015年版《中国药典》含量一致，且杂质峰基本相同，故采用与药典一致的提取溶剂。期间我们试采用乙酸乙酯除杂，采用5％氨水稀乙醇、3％磷酸稀乙醇作为提取和水解溶液作为仪器的萃取罐内进行水解提取，提取效果不佳，故单独采用药典的2mol/l盐酸溶液再仪器外外进行水解。

4.2ase提取条件的优化

在除杂过程中，药典方法加入乙酸乙酯回流3h，时间相对较长，我们采用了多次萃取除杂的方式，发现80℃，提取3min，2次即可达到除去大部分杂质，再多的提取时间和次数已经无明显影响，而相对高的温度会是齐墩果酸结果降低，故最终确定最佳除杂工艺组合为提取温度80℃，提取时间3min，提取次数2次。提取过程中采用120℃。提取5min，提取3次即可达到与药典含量接近，更多的提取时间、温度、次数对结果已经无明显影响。最终确定最佳提取工艺组合为提取温度120℃，提取时间5min，提取次数3次。

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。