苏拉明钠的高效液相检测方法与流程

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种苏拉明钠的高效液相检测方法。

背景技术：

苏拉明钠(suramin)，又名舒拉明钠、苏拉明等，是德国bayerag公司于1961年合成的一种抗锥虫类化合物，白色至浅黄色粉末，主要用于治疗非洲锥虫病和盘尾丝虫病。20世纪80年代，有学者发现苏拉明钠能够抑制肿瘤病毒有关的逆转录酶活性，将苏拉明钠应用于获得性免疫缺陷综合症(aids)的治疗，表明苏拉明钠对人类免疫缺陷病毒(hiv)有一定的抑制作用。使用苏拉明钠治疗aids患者时发现患者同时患有的卡西肉瘤和非何杰金淋巴瘤完全消退，结合体外实验发现苏拉明钠能够阻断某些与肿瘤生长密切相关的生长因子和酶的活性，可以将苏拉明钠作为一种抗肿瘤药物广泛应用于各种恶性肿瘤的治疗，如前列腺癌，肺癌，结肠癌，子宫肌瘤等。近年来，苏拉明钠在防治眼部增殖性疾病的研究中也取得了较大的进展。最近，又有苏拉明钠治疗肝纤维化的报道。

但是苏拉明钠暂时没有发展到临床使用水平，原因在于苏拉明钠的物理特性使其在体内分布不良，产生药物动力学和毒性相关的难题，从而需要降低剂量以限制毒性进一步提高患者的耐受性，使靶向投药达到最大，这必然要求苏拉明钠的定量检测线相对较低。

目前还没有检测苏拉明钠的高效液相方法的报道。根据现有技术中类似化合物的高效液相检测方法进行检测，发现对苏拉明钠的分离效果较差，分离度r小于1，无法有效检出个别工艺杂质峰或有关物质峰，洗脱时基线易发生漂移，积分不准确，其用于定量分析时的精确度和准确度不高，且检测耗时长需15min以上。本发明针对现有技术中的检测方法进行了改进与优化，与现有技术中的方法相比，本发明的检测方法不仅分离效果好，精密度和准确度高，而且操作安全简易，处理方便快捷，适合高通量筛选及精准定量。该方法对苏拉明钠的原料、制剂质量研究以及相关药动学定量研究等方面均具有重要研究价值。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，提供一种检测时间短、分离效果好、精确度和准确度更高的苏拉明钠的高效液相检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的苏拉明钠的高效液相检测方法，其中，

色谱柱采用反相c18色谱柱；

检测器采用dad检测器；

流动相包括流动相a和流动相b；流动相a为0.0005～0.0015％氨水、1～3mm醋酸铵和0.15～0.20mm二丁铵乙酸盐(dbaa)的水溶液；流动相b为1.5～4.5mm醋酸铵和5～15mmn,n-二甲基己铵(dmha)的50％乙腈/水混合溶液；

采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：流动相a+流动相b＝100％，0～0.01min，流动相b保持体积百分比为20％；0.01～2.10min，流动相b体积百分比由20％递增至80％；2.10～2.11min，流动相b体积百分数由80％递减至20％；2.11～3.00min，流动相b保持体积百分数为20％。

在一个优选的实施例中，流动相a为0.001％氨水、2mm醋酸铵和0.18mm二丁铵乙酸盐(dbaa)的水溶液；流动相b为3mm醋酸铵和10mmn,n-二甲基己铵(dmha)的50％乙腈/水混合溶液；

在一个优选的实施例中，色谱柱柱长为100mm。

在一个优选的实施例中，流速为1.0～2.0ml/min，更优选为1.4ml/min。

在一个优选的实施例中，检测波长为250～255nm，更优选为254nm。

在一个优选的实施例中，柱温控制在35～40℃，更优选为40℃。

在一个优选的实施例中，进样量为2～8μl，更优选为3～5μl。

本发明还提供一种测定苏拉明钠含量的高效液相方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液及供试品溶液的制备：精密称取适量苏拉明钠对照品，用注射用水溶解，稀释定容成具有一定浓度梯度的多个对照品溶液；精密称取适量苏拉明钠供试品，用注射用水溶解并定容得到供试品溶液；

(2)色谱条件：

色谱柱采用反相c18色谱柱；

检测器采用dad检测器；

流动相包括流动相a和流动相b；流动相a为0.0005～0.0015％氨水、1～3mm醋酸铵和0.15～0.20mm二丁铵乙酸盐(dbaa)的水溶液；流动相b为1.5～4.5mm醋酸铵和5～15mmdmha的50％乙腈/水混合溶液；

采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：流动相a+流动相b＝100％，0～0.01min，流动相b保持体积百分比为20％；0.01～2.10min，流动相b体积百分比由20％递增至80％；2.10～2.11min，流动相b体积百分数由80％递减至20％；2.11～3.00min，流动相b保持体积百分数为20％；

(3)测定方法：

将所述多个对照品溶液以及供试品溶液按所述(2)色谱条件依次进样，记录色谱图，根据多个对照品溶液的图谱数据和浓度数据制备线性相关工作曲线，代入供试样品的图谱数据计算并得出供试品溶液浓度，完成了苏拉明钠含量的测定。

在一个优选的实施例中，对照品溶液的浓度依次为6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml，流速为1.4ml/min。检测波长为254nm，柱温为40℃，进样量为3～5μl。

本发明提供的苏拉明钠的高效液相检测方法的有益效果在于：

1.本发明的方法能够有效检出苏拉明钠及其有关物质，并且分离度r能达1.5以上，分离效果好。

2.本发明的方法检测时间短，只需3min即可完成高效液相检测过程，大大提高了检测效率，适合高通量筛选。

3.本发明的方法测定hplc图谱基线平稳，不发生漂移。

4.本发明的方法能节省溶剂，降低成本，操作安全简易，处理方便快捷。

5.本发明的方法用于苏拉明钠的含量测定，具有良好的线性关系，重现性高，精确度和准确度高，在原料药、制剂质量研究以及相关药动学定量研究等方面具有重要研究价值。

附图说明

图1为采用本发明的方法测定苏拉明钠供试品的hplc图谱一。

图2为采用本发明的方法测定苏拉明钠供试品的hplc图谱二。

图3为采用本发明的方法测定苏拉明钠供试品的hplc图谱三。

图4为采用本发明的方法绘制的苏拉明钠工作曲线。

具体实施方式

本申请的发明人经过广泛的研究和大量的实验，摸索得到了一种苏拉明钠的高效液相检测方法，该方法提供了能够有效分离苏拉明钠及其有关物质的流动相体系及梯度洗脱程序，可以将现有技术中难以有效分离的苏拉明钠及其有关物质实现很好的分离效果，分离度r可达1.5以上。

发明人采用的苏拉明钠的高效液相检测方法，其色谱条件如下：

色谱柱采用反相c18色谱柱，比如以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的watersxbridge色谱柱；

检测器采用dad检测器；

流动相包括流动相a和流动相b；流动相a为0.0005～0.0015％氨水、1～3mm醋酸铵和0.15～0.20mm二丁铵乙酸盐(dbaa)的水溶液；流动相b为1～4.5mm醋酸铵和5～15mmdmha的50％乙腈/水混合溶液；

采用梯度洗脱，流动相a+流动相b＝100％，梯度洗脱程序按以下程序进行：0～0.01min，流动相b保持体积百分比为20％；0.01～2.10min，流动相b体积百分比由20％递增至80％；2.10～2.11min，流动相b体积百分数由80％递减至20％；2.11～3.00min，流动相b保持体积百分数为20％；

本发明的一个优选的实施例中，流动相a为0.001％氨水、2mm醋酸铵和0.18mm二丁铵乙酸盐(dbaa)的水溶液；流动相b为3mm醋酸铵和10mmn,n-二甲基己铵(dmha)的50％乙腈/水混合溶液。

本发明的一个优选的实施例中，色谱柱柱长为100mm。

本发明的一个优选的实施例中，流速为1.0～2.0ml/min，更优选为1.4ml/min。

本发明的一个优选的实施例中，检测波长为250～255nm，更优选为254nm。

本发明的一个优选的实施例中，柱温控制在35～40℃，更优选为40℃。

本发明的一个优选的实施例中，进样量为2～8μl，更优选为3～5μl。

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中的实验条件如下：

仪器：高效液相色谱仪(lc-20a)

色谱柱：watersxbridgec18色谱柱，柱长为100mm；

供试品溶液：精密称取苏拉明钠供试品10mg，置于10ml容量瓶，用注射用水溶解并定容，得到供试品溶液；

流速：1.4ml/min；

检测波长：254nm；

柱温：40℃；

流动相：流动相a+流动相b＝100％；

梯度洗脱：0～0.01min，流动相b保持体积百分比为20％；0.01～2.10min，流动相b体积百分比由20％递增至80％；2.10～2.11min，流动相b体积百分数由80％递减至20％；2.11～3.00min，流动相b保持体积百分数为20％；

实施例1

流动相a为0.001％氨水、2mm醋酸铵和0.18mm二丁铵乙酸盐(dbaa)的水溶液；流动相b为3mm醋酸铵和10mmn,n-二甲基己铵(dmha)的50％乙腈/水混合溶液。

按此方法下经过三次进样，hplc图谱如图1-3所示，基线平稳，重复性好，3min能够全部出峰，苏拉明钠保留时间为1.953～1.959min，理论塔板数为9219。

实施例2

流动相a为0.0005％氨水、1mm醋酸铵和0.15mm二丁铵乙酸盐(dbaa)的水溶液；流动相b为1.5mm醋酸铵和5mmn,n-二甲基己铵(dmha)的50％乙腈/水混合溶液。

此方法下基线平稳，苏拉明钠保留时间为2.1min左右，且分离度为1.6。

实施例3

流动相a为0.0015％氨水、3mm醋酸铵和0.20mm二丁铵乙酸盐(dbaa)的水溶液；流动相b为4.5mm醋酸铵和15mmn,n-二甲基己铵(dmha)的50％乙腈/水混合溶液。

此方法下基线平稳，苏拉明钠保留时间为1.8min左右，且分离度为1.5。

实施例4苏拉明钠的含量测定

基于上述的检测方法，发明人还提供一种测定苏拉明钠含量的高效液相方法，按以下步骤进行：

(1)对照品溶液及供试品溶液的制备：精密称取适量苏拉明钠对照品，用注射用水溶解并定容得到1mg/ml的储备液，准确吸取50μl储备液，用注射用水依次稀释定容得到6.25、12.5、25、50、100、200ug/ml的对照品溶液；精密称取适量苏拉明钠供试品，用注射用水溶解并定容得到供试品溶液；

(2)色谱条件：

色谱柱采用反相c18色谱柱；

检测器采用dad检测器；

流动相包括流动相a和流动相b；流动相a为0.001％氨水、2mm醋酸铵和0.18mm二丁铵乙酸盐(dbaa)的水溶液；流动相b为3mm醋酸铵和10mmn,n-二甲基己铵(dmha)的50％乙腈/水混合溶液。

采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行0～0.01min，流动相b保持体积百分比为20％；0.01～2.10min，流动相b体积百分比由20％递增至80％；2.10～2.11min，流动相b体积百分数由80％递减至20％；2.11～3.00min，流动相b保持体积百分数为20％；

(3)测定方法：

将所述6个对照品溶液和供试品溶液按所述色谱条件依次进样，记录色谱图，根据6个对照品溶液的苏拉明钠峰面积和浓度数据制备线性相关工作曲线(如图4所示)，该工作曲线线性关系良好，r≥0.9999；代入供试样品的苏拉明钠峰面积计算并得出供试品溶液浓度，比较测定的供试品溶液浓度和定容的供试品溶液浓度以及进样时的稀释倍数，计算得出苏拉明钠的含量。

本发明的苏拉明钠的高效液相检测方法，能够有效检出苏拉明钠及其有关物质，并且分离度r能达1.5以上，填补了目前苏拉明钠含量测试分析方法尚无的空缺；本发明的检测方法的hplc谱基线稳定，不发生漂移；本发明的方法检测时间短，只需3min即可完成高效液相检测过程，大大提高了检测效率，适合高通量筛选；本发明的方法能节省溶剂，降低成本，操作安全简易，处理方便快捷；本发明的方法用于苏拉明钠的含量测定，具有良好的线性关系，r≥0.9999，重现性高，精确度和准确度高，在原料药、制剂质量研究以及相关药动学定量研究等方面具有重要研究价值。

综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。