本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及检测人legumain的elisa检测试剂盒及其应用。
背景技术：
乳腺癌是女性排名第一的常见恶性肿瘤。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。美国8名妇女一生中就会有1人患乳腺癌。中国不是乳腺癌的高发国家，但是今年我国乳腺癌的发病率的增长速度却高出高发国家1～2个百分点。乳腺癌已经成为当前社会的重大公共卫生问题，早发现，早治疗可以极大地提高乳腺癌的存活率。
legumain(c13)(ec3.4.22.34)又称天冬酰胺内肽酶(asparaginylendopep-tidase，aep)，是一种溶酶半胱氨酸蛋白酶，是半胱氨酸蛋白酶c13家族一个新成员。人的legumain基因定位于14号染色体，编码由433个氨基酸残基组成的多肽链,去糖基化后成为具有生物活性的成熟酶，与小鼠具有83％的同源性。人的legumain蛋白具有3种形式，分别为56kd的酶原前体，46kd和36kd成熟酶。legumain的活性催化中心是由组氨酸(his)和半胱氨酸(cys)组成的催化二联体，是legumain发挥催化活性所必需的，也是每一个c13家族成员必有的结构。
与正常组织相比，legumain在小鼠和人类多种实体瘤组织中高表达，尤其是在肿瘤细胞、新生血管内皮细胞和肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages，tams)中，而在体外培养的相应肿瘤细胞株中却不表达。liu等最先报道legumain与肿瘤发生发展有关。他们通过westernblot和免疫组化分析，发现在多种鼠肿瘤细胞中，legumain表达增高，而在体外培养的各肿瘤细胞株中则不表达。liu等还检测了人正常组织及多种实体瘤组织，结果显示在正常组织中，legumain表达极低，而在多种实体瘤组织中(如乳腺、结肠、肺、前列腺、卵巢肿瘤和中枢神经系统恶性肿瘤)legumain高表达。
侵袭和转移是恶性肿瘤的播散方式，也是影响肿瘤患者的治疗效果和预后的重要因素。legumain与整合素形成复合物，在实体肿瘤的低氧和酸性微环境中，具有激活肿瘤细胞pro-mmp2和pro-cathepsinl的功能，促进肿瘤生长、侵袭和转移。为了证实legumain的表达是否与肿瘤的分化程度、坏死、凋亡及预后相关。murthy等通过westernblot和免疫组织化学方法，对164例原发性结肠癌、34例远端正常粘膜组织、89例癌旁组织及33例淋巴结转移癌组织样本进行临床病理检测，结果表明，在原发性结肠癌中，legumain表达明显高于远端正常组织和癌旁组织(p<0.05)，但与淋巴结转移癌组织样本无显著差异(p>0.05)。同时，legumain在肿瘤患者瘤体(p＝0.01)或基质中的表达(p＝0.04)水平较低时，其预后较好。gawenda等、通过免疫组织化学方法研究了432例乳腺浸润癌和128例乳腺非癌组织样本，证实人乳腺癌组织中legumain高表达，并且与乳腺癌临床病理变化有一定的相关性。lin(linet.al.,jnci,2014.)等报道了乳腺癌病人细胞内的legumain在traf6的催化下进行泛素化，然后与hsp90α形成复合体被运输到细胞外随血液循环系统到达远端组织，在远端组织进行活化后促进肿瘤的迁移和扩散，并且已证实乳腺癌病人血清中legumain的水平与癌症的发展阶段呈一定的相关性。血清中的legumain水平可以促进肿瘤的侵袭和扩散，用抑制剂或者抗体阻断血清中的legumain作用可以消除小鼠体内肿瘤的扩散。
因此，legumain作为一种新的生物学指标，目前临床上暂时没有针对其的检测方法，在监测肿瘤的发生发展中的应用还属空白。
技术实现要素：
为了弥补以上领域的不足，本发明提供了一种检测人legumain的elisa检测试剂盒。
本发明所提供的检测人legumain的elisa检测试剂盒，包括包被捕获抗体的酶标板、封闭液、洗涤液、生物素标记的检测抗体、酶标生物素、底物显色液、终止液；
所述捕获抗体是由名称为lgmn-1，保藏号为cgmccno.12994的杂交瘤细胞株分泌产生；
所述检测抗体是由名称为lgmn-2，保藏号为cgmccno.12995的杂交瘤细胞株分泌产生。
所述试剂盒还包含人legumain标准抗原液，用于定量检测人legumain。
所述包被捕获抗体的酶标板是由如下方法制备得到的：用包被缓冲液将捕获抗体lgmn-1稀释，然后加入到酶标板孔中，4℃反应过夜；甩掉包被缓冲液后，拍干，加入封闭液，反应，甩掉封闭液，拍干，即得所述包被捕获抗体的酶标板；所述包被缓冲液为ph值为9.0～9.6的0.1mol/l碳酸盐缓冲液。
所述酶标生物素为辣根过氧化物酶标记的生物素。
所述的封闭液是含质量百分比浓度为1～10％牛血清白蛋白(bsa)的磷酸盐缓冲液(pbs)。
所述洗涤液是含质量体积比为0.1％tween-20的磷酸盐缓冲液。
所述底物显色液是过氧化尿素和四甲基联苯胺。
所述终止液是2m硫酸溶液。
本发明还提供了定量检测人legumain的elisa检测试剂盒，包括包被捕获抗体的酶标板、人legumain标准抗原液、封闭液、洗涤液、生物素标记的检测抗体、酶标生物素、底物显色液、终止液；
所述捕获抗体是由名称为lgmn-1，保藏号为cgmccno.12994的杂交瘤细胞株分泌产生；
所述检测抗体是由名称为lgmn-2，保藏号为cgmccno.12995的杂交瘤细胞株分泌产生。
所述检测人legumain的elisa检测试剂盒在制备定性和/或定量检测人legumain的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的测定基础是人legumain的双抗体夹心elisa反应。酶标板包被有捕获人legumain的抗体lgmn-a，当加入游离的人legumain(标准品或样品血清)，游离的人legumain被捕获抗体捕获；之后加入生物素标记的人legumain检测抗体lgmn-b，没有被结合的检测抗体在洗涤步骤中被除去；然后加入亲和素和酶标生物素，洗涤后将酶底物(过氧化尿素和四甲基联苯胺)加入到孔中并且孵育。结合的酶标生物素将无色的发光剂转化为蓝色产物。加入反应停止液2m硫酸后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm波长的酶标仪测量微孔溶液的吸光度值，样品中的人legumain与吸光度值成正比，按照绘制的校正曲线定量计算。
本发明填补了人legumain定量检测的空白，它以双抗体酶联免疫反应为测定基点，具有灵敏度高，特异性好，重复性高和检测准确快速的优点。此方法检测费用低，检测样本数量大，可以用于临床定量检测肿瘤组织和淋巴组织中的人legumain，根据检测水平来评估肿瘤扩散的风险，可在肿瘤发生的早前期对病人采取治疗措施，控制肿瘤的恶性发展，提高癌症的治愈率和病人的存活率。利用血清中的legumain水平来评估肿瘤的扩散风险在国际上尚属先例，将会有很好的发展前景。
附图说明
图1为重组质粒pcdna3.1-tpa-lgmn的酶切鉴定结果图；其中1为tpa-hlgmnpcr片段，2为pcdna3.1-tpa-hlgmn双酶切，m为dna分子量标准markerdl2000(takara,catno.3427a)。
图2为重组人legumain纯化抗原的sds-page图；其中，p1为亲和层析纯化得到的legumain(ph8.0)，mw为蛋白分子量标准。
图3为westernblot检测重组人legumain的免疫原性图；其中p1为人legumain，mw为蛋白分量标准。
图4为杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的免疫印迹图；其中p1为单克隆抗体lgmn-a，p2为单克隆抗体lgmn-b，mw为蛋白分子量标准，c为阳性对照。
图5为legumain浓度的自然对数与od450值的关系图。
图6为定量检测人legumain的双抗体夹心elisa检测试剂盒标准曲线图。
具体实施方式
实施例1、制备抗人legumain蛋白的单克隆抗体
1.人legumain重组抗原制备
1)legumain基因序列的获得
legumain编码基因位于人的第14号染色体上(14q32.12)，在ncbi数据库中的序列号为ccds:ccds9904.1。携带人legumain基因的质粒plexsy-sat2-hlgmn由奥地利萨尔兹堡大学的elfriededall博士惠赠，记载过真核表达质粒plexsy-sat2-hlgmn的非专利文献是e.dallandh.brandstetter，activationoflegumaininvolvesproteolyticandconformationalevents,resultinginacontext-andsubstrate-dependentactivityprofile.，actacrystallogrsectfstructbiolcrystcommun.2012jan1；68(pt1):24–31.
2)重组质粒的构建及酶切鉴定
为了使人的legumain在表达后能够分泌到细胞外，克隆过程中在hlgmn前端加入组织型纤溶酶原激活物(tpa)信号肽序列，后端加入6×his标签。
pcr上游引物：
5’-nhei-ccagctagcatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccagccaggaaatccatgcccgattcagaagaggagccagatccatggtttggaaagtagc-3’
下游引物：
5’-tgccttggtcactactga
pcr反应体系：
pcr反应程序：
pcr片段纯化经pcr产物快速纯化试剂盒(qigen)纯化后，经nhei和hindiii酶切，酶切完成后在反应体系中加入1μldpni，于37℃反应30min，消化掉模板dna。
pcdna3.1(+)载体(购自invitrogen,catno.v790-20)也由nhei和hindiii酶切。
酶切体系：
酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析，切取目的片段，经凝胶纯化试剂盒(qigen,catno.20021)提取目的片段，之后进行连接反应。
连接反应体系为：约0.1pmoltpa-hlgmn片段，约0.01pmolpcdna3.1载体dna片段，1μlt4dna连接酶缓冲液(neb)，1μlt4dna连接酶(neb)，加去离子水补足到10μl体系，16℃连接过夜。取3μl反应产物转化至100μl感受态细胞xl-1blue(agilent)中。
挑取阳性克隆，经37℃培养12h后，用质粒小提试剂盒(qigen)提取质粒，并对提取的质粒进行酶切鉴定。
使用nhei和hindiii对所提质粒进行酶切鉴定，酶切体系为：
酶切鉴定结果见图1。由图1可见，lane2pcdna3.1-tpa-hlgmn经酶切后得到的较小的片段与lane1的pcr片段大小一致，说明重组质粒构建成功。
3)转染及蛋白纯化
提前一天用无血清培养基f17medium(invitrogen,cat.0050092dk)悬浮培养hek2936e细胞(购自nationalresearchcouncilcanada)，细胞密度为1.0×106/ml，培养条件为130rpm,37℃.and5％co2。
采用上述构建的pcdna3.1-tpa-lgmn质粒，通过线性pei瞬时转染的方法(jagerv.etal.,highleveltransientproductionofrecombinantantibodiesandantibodyfusionproteinsinhek293cells,bmcbiotechnology13(1):52·june2013.)转染hek2936e细胞。
以在125ml培养瓶中悬浮培养的细胞为例：转染前一天调整细胞密度为1.0×106/ml，培养体积为22.5ml，24h后，细胞密度为1.5-2.0×106/ml，此时可以进行转染实验。
首先在25-37℃预热传染培养基，并且解冻dna和pei(polyethylenimine(linear,25kda),polysciences,catno.23966)：
准备dna溶液：
在15ml离心管中加入1.5ml转染培养基f17
加入25μg待转染dna
涡旋混匀
准备pei溶液：
在15ml离心管中加入1.5ml转染培养基f17
加入50μlpeisolution(1μg/ul)(50μg)
涡旋混匀
准备dna-pei复合物：
将pei溶液加入到dna溶液中
涡旋混匀
室温静置15min
转染：
将dna-pei复合物加入培养细胞中，并迅速转动培养瓶使之混匀，将培养瓶放回到5％二氧化碳培养箱中继续悬浮培养。24h后加入25ml新鲜的freestylef17expressionmedium(购自invitrogen,catno.a1383501)，使培养基体积加倍，120h后收获细胞培养基，10000rpm，30min，离心去除细胞，收获细胞上清进行蛋白纯化。
使用ni-ntaagarose(qigen，catno.30230)对hlgmn-his进行亲和层析，细胞上清首先通过渗滤法交换为缓冲液(50mmnahpo4,ph7.6,300mmnacl)，使用1mlni-nta琼脂糖凝胶柱进行亲和层析。
使用30ml洗涤液b(50mmnahpo4,ph7.6,300mmnacl,30mm咪唑)洗涤，5ml洗脱液c(50mmnahpo4,ph7.6,300mmnacl,300mm咪唑)洗脱。取少量洗脱蛋白液做电泳分析和westernblot鉴定。电泳分析结果如图2所示，由图2可见，纯化后的目的片段大小为56kd，与理论值相符。
westernblot流程：
使用表达的重组人legumain蛋白，进行sds-page凝胶电泳，并将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5％脱脂奶粉4℃封闭过夜后，加1:1000倍稀释的山羊抗legumain多克隆抗体(santacruzbiotechnology,inc.,catno.sc-47105)，室温孵育1h，洗膜3次，加入hrp-山羊抗小鼠igg(h+l)(invitrogen，catno.62-6520)，最后加入dab显色试剂盒(上海生工，catno.pw017)中的反应液和溶液a和溶液c的混合液，避光显色10min后，加入终止液，拍照记录实验结果(图3)。由图3可见，表达纯化的蛋白在56kd处有显色条带，说明重组legumain蛋白具有良好的免疫原性。
剩余蛋白用0.85％的nacl溶液在4℃透析48h。用30kd的超滤膜浓缩至5mg/ml，即制备得到人legumain抗原。
2.动物免疫
将人legumain抗原与弗氏佐剂(0天免疫为弗氏完全佐剂(sigma，catno.：f5881)，14天、28天、35天免疫为弗氏不完全佐剂(sigma，catno.：f5506))等体积混合乳化后于0天、14天、28天、35天背部皮下多点免疫balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，0.2mg/只。
末次免疫一周后采血，间接elisa检测抗体效价，血清稀释104倍时od值为1.116，于末次免疫一周后采用人legumain抗原腹腔冲击选定的小鼠，3天后取小鼠脾脏，进行细胞融合。
3.细胞融合及建株
(1)细胞融合前复苏培养sp2/0细胞株(购自sigmaaldrich，catno.85072401)需在含10％胎牛血清(gibco,catno.10099133)的rpmi1640培养液(gibco,catno.11875093)中，置5％co2培养箱中37℃培养，每2～3天换培养液一次，3～5天换液一次。在倒置显微镜下观察为圆形明亮、排列整齐、形态完整、密度适宜(0.1～1×106/ml)、存活率大于95％时，既可供细胞融合使用。融合前3天扩大培养，融合前1天去除rpmi1640细胞培养液，重新添加培养液，准备sp2/0细胞。
(2)制备脾细胞悬液：取3天前加强免疫的小鼠，断颈处死，浸泡于75％乙醇中3～5min。无菌操作取出脾脏，制备脾细胞悬液，计数活细胞。
(3)根据脾细胞与sp2/0细胞计数结果分别加入适量rpmi-1640培养液，sp2/0细胞晃动混匀，脾细胞用移液管吹打均匀。然后将脾细胞与sp2/0细胞按1:5合于50ml离心管中，混匀。
(4)加rpmi-1640培养液至50ml，1000rpm离心5钟，倒净上清。用手指轻轻敲击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，离心管置37℃水浴，准备融合。
(5)吸取1ml37℃预热的50％的peg4000，缓慢滴入混合细胞管内，1min内加完，边滴边转动离心管，使细胞保存在混匀状态。
(6)静置90s后立即缓慢加入15ml无血清的rpmi-1640培养基(37℃)，800rpm，离心5钟，弃去上清。
(7)加入15ml含10％小牛血清的rpmi-1640培养液，混勾，将混悬液分别加至96孔细胞培养板中，100ul/孔，置于37℃，5％co2培养箱内培养。
(8)第2天细胞板加hat培养液(rmpi-1640含1×hat(sigma，catno.h0262)100ul/孔。
(9)每3天换一次hat培养液，每次吸出培养孔旧液的1/2换入新液，观察是否出现杂交瘤，两周后换ht培养基(mdm含1×ht(sigma，catno.h0137)，观察融合细胞生长状况。
(10)细胞融合后第七天开始观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清利用fortebiooctet96系统(fortebio)进行抗体检测。使用his2生物传感器(fortebio,partno:18-5116)捕获带6×his标签的重组人legumain抗原(用pbs稀释5μg/ml)；0.1mg/mlbsa封闭；吸取细胞培养上清加入待检孔中，如果上清中含有抗人legumain抗体与重组人legumain抗原结合，系统捕捉到的光信号会发生改变，根据光信号判断是否阳性。将阳性孔细胞转入24孔板扩大培养，及时做亚克隆。
fortebiooctet系统所运用的生物膜干涉技术，是一种免标记技术。利用fortebiooctet系统做单克隆抗体筛选的优势是无需对抗体进行标记也无需使用标记的二抗，精密度高于elisa，测试速度更快，无需人工洗涤步骤，是一种全自动的操作系统。
(11)经3次亚克隆得到2株稳定分泌抗体的细胞系，分别将杂交瘤细胞株进行保藏，保藏号分别为cgmccno.12994和cgmccno.12995，分类命名分别为lgmn-1和lgmn-2。legumain抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏时间：2016年10月24日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。
4.杂交瘤细胞株的冷冻保存和复苏
将鉴定为阳性的杂交瘤细胞，加入细胞冻存液(30％小牛血清(gibco,catno.16010159)，60％rpmi-1640，10％dmso)，调整细胞浓度为1～5×106个/ml。将细胞悬液分装到冻存管中，先4℃预冷10min，再置于-20℃冰箱中30min，再移至-80℃冰箱16～18h(或过夜)，最后投入液氮中长期保存。
复苏杂交瘤细胞时，将杂交瘤细胞冷冻管从液氮中取出，立即投入38～40℃水浴中，待细胞悬液解冻后，加入10mlrpmi-1640培养液，将细胞移至25ml培养瓶中，置37℃co2培养箱中培养。过3～4h，待细胞贴壁后，倒掉旧培养基，加入新鲜的rpmi-1640培养基继续培养。
5.单抗细胞株腹水制备及抗体效价检测
单抗腹水制备：待细胞覆盖25ml的细胞培养瓶瓶底50％以上时，选择健康的spf级balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，先于小鼠腹腔注射0.3ml石蜡油，7～10天后于每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞0.5～5×108个。待小鼠腹部明显膨大时，用9号针头抽取腹水或用16号针头放腹水，可反复抽取多次。腹水经12000rpm，10min离心后，取上清液分装，置-20℃保存备用。
单抗效价检测：
单抗效价检测：利用fortebiooctet96系统对单抗细胞株腹水效价进行测定，使用his2生物传感器捕获重组人legumain抗原(用pbs稀释5μg/ml)，作用时间10min；pbst洗涤2min；0.1mg/mlbsa封闭5min；pbst洗涤2min；加入梯度稀释的lgmn-a和lgmn-b腹水，作用10min。使用未免疫过重组人legumain蛋白的小鼠腹水作为阴性对照。结果显示，两株单抗细胞株腹水抗体效价分别为1:2.05×107，1:2.56×108，效价较高。
fortebiooctet96系统(fortebio)进行抗体检测。使用his2生物传感器(fortebio,partno:18-5116)捕获带his×6标签的重组人legumain抗原(用pbs稀释5μg/ml)；0.1mg/mlbsa封闭；吸取细胞培养上清加入待检孔中，如果上清中含有抗人legumain抗体与重组人legumain抗原结合，系统捕捉到的光信号会发生改变，根据光信号判断是否阳性。将阳性孔细胞转入24孔板扩大培养，及时做亚克隆。
6.western检测单克隆抗体与抗原的结合
使用表达的重组人legumain蛋白，进行sds-page凝胶电泳，并将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5％脱脂奶粉4℃封闭过夜后，加1:1000倍稀释的含有lgmn-1和lgmn-2单克隆抗体的腹水，阳性对照为购买的山羊抗legumain多克隆抗体(santacruzbiotechnology,inc.,catno.sc-47105)，室温孵育1h，洗膜3次，二抗分别为hrp-山羊抗小鼠igg(h+l)(invitrogen，catno.62-6520)和hrp-兔抗山羊igg(invitrogen,catno.61-1620)，最后加入dab显色试剂盒(上海生工，catno.pw017)中的反应液和溶液a和溶液c的混合液，避光显色10min后，加入终止液，拍照记录实验结果(图4)。由图4可见，c为购买的山羊抗legumain多克隆抗体阳性对照，p1、p2为两株单克隆抗体与重组legumain蛋白的反应，说明两株单克隆抗体与重组legumain蛋白有良好的免疫原性反应。
7.、抗体亚类测定
将人legumain抗原采用0.01mpbs稀释至5μg/ml，100ul/孔包被酶标板，置于4℃过夜，以5％脱脂奶粉37℃封闭1h，然后采用鼠单抗分型试剂盒(sigma,is02-1kt)按照单抗亚类试剂盒说明书进行试验，结果显示本发明单克隆抗体lgmn-a为igg2a型，单克隆抗体lgmn-b为igg2b型。
8.杂交瘤细胞系分泌单抗的稳定性检测
分别在3个月和9个月后，从液氮中取出冻存的杂交瘤细胞株lgmn-1和lgmn-2进行复苏、扩大培养后，制备腹水，进行间接elisa检测抗体效价，以前期制备的腹水，lgmn-a和lgmn-b单抗腹水(0天)为对照同时进行检测。结果表明，本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体腹水效价达到107以上，与前期腹水效价无差异，表明细胞保藏后制备的腹水的效价未下降。因此单克隆细胞株分泌抗体的活性没有降低，稳定性良好。
9.亲和常数测定
将本发明的杂交瘤细胞株分泌的单抗lgmn-a和lgmn-b分别纯化后检测其蛋白质含量。采用1:5,1:10,1:20,1:40稀释的不同浓度的legumain抗原横向包被酶标板，100ul/孔，4℃包被过夜。第二天洗板后封闭2小时，拍干待用。将纯化后的单抗lgmn-a和lgmn-b分别2倍梯度稀释，纵向加入包被后的酶标板，采用间接elisa法检测抗原抗体反应的od值。以各抗原浓度下的曲线平坦段的od值计为100％，计算50％od值，考察50％od值所对应点的单抗浓度[ab]t，再根据亲和常数计算公式k＝(n-l)/2(nab'-ab)可以得到本发明单抗lgmn-a的亲和常数为1.48×107。lgmn-b的亲和常数为1.32×107(表1)。
表1亲和常数检测结果
10.单克隆抗体的特异性
将人legumain抗原，cathepsinb(sigmaaldrich，catno.srp0289)，cathepsinh(biovision,catno.1023-5)和cathepsinl(sigmaaldrich，catno.spr0291)采用0.01mpbs稀释至5μg/ml，100ul/孔包被酶标板，每种蛋白包被四个孔，每两个孔作为一个重复，置于4℃过夜，5％脱脂奶粉37℃封闭1h，洗涤三次，然后分别加入单克隆抗体lgmn-a和lgmn-b37℃孵育1h，洗涤三次，加入1:1000倍稀释的hrp-山羊抗小鼠igg(h+l)，洗涤三次后，加入tmb显色液显色，2m硫酸终止，在450nm测定吸光度。
添加cathepsinb，cathepsinh和cathepsinl孔的od450值与标准曲线上空白孔od450值相近，与legumain蛋白孔差异性显著(p>0.05)，故该方法的特异性较好。
实施例2、制备定量检测人legumain的双抗体夹心elisa检测试剂盒
1.单克隆抗体表位鉴定
将0.1ug的两种单克隆抗体lgmn-1、lgmn-2分别以1:2的比例与legumain抗原混合，利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native–page)进行分析，考马斯亮蓝染色后切取复合体条带(非单克隆抗体条带，非legumain条带)，用胰蛋白酶不完全消化后进行质谱分析，结果表明两种单克隆抗体lgmn-1、lgmn-2的抗原表位不重合，分别位于n端和c端。
2.制备包被捕获抗体的酶标板：
用包被缓冲液将捕获抗体lgmn-1按1:1000稀释，然后加入到酶标板孔中，每孔100μl，4℃反应过夜；
甩掉包被缓冲液后，拍干，每孔加入200μl的封闭液，反应，甩掉封闭液，拍干，保存；
所述包被缓冲液为ph值为9.0～9.6的，0.1mol/l碳酸盐缓冲液；
所述封闭液为含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，所述牛血清白蛋白在所述封闭液中的终浓度为1～10％，所述终浓度为质量百分比浓度。
3.制备生物素标记的检测抗体(b-lgmn-2)
使用elabscience的生物素标记试剂盒(购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，产品目录号为eblk0002)对单克隆抗体lgmn-2进行生物素标记，具体操作完全按照说明书进行，得到生物素标记的检测抗体b-lgmn-2。
4.酶标生物素(b-hrp)的制备
称取辣根过氧化物酶(hrp)5mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
反应后的酶溶液经sephadexg-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以peg浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。
将待标记的生物素(购自sigma-aldrich，产品目录号为v900418)2.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
用1mph9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。
加0.2m赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mph7.4的pbs中。至此得到辣根过氧化物酶标记的酶标生物素(biontin-hrp)。
加甘油至50％，-20℃保存。
5.试剂的配制及抗体工作浓度的选择
试剂的配制：
人legumain(lgmn)标准抗原液10ng/μl，纯化抗原液使用磷酸盐缓冲液(加入0.02％叠氮化钠)稀释。包被液，ph9.6，0.05m碳酸盐缓冲液(cbs)(市售)；封闭液，1％bsa的磷酸盐缓冲液(pbs)(市售)；捕获抗体lgmn-1，定量至0.5mg/ml；生物素标记的检测抗体lgmn-2-biotin，定量至0.8mg/ml；亲和素(av)(市售)，定量至0.5mg/ml；
tmb单组份显色液(市售)；反应停止液，2m硫酸溶液(市售)；洗涤液磷酸盐缓冲液(pbs)(市售)。
abc复合物的制备：将av和b-hrp分别以1:750和1:500倍稀释成工作液，在使用前半小时等体积混匀。
捕获抗体和生物素标记检测抗体工作浓度的选择：
用包被缓冲液(0.05mcbs，ph9.6)将捕获抗体稀释成5μg/ml、2μg/ml、1μg/ml和0.5μg/ml4个浓度包被酶标板，1％bsa的磷酸盐缓冲液(pbs)37℃封闭2h，用抗体稀释液(1％bsa/pbst)将生物素标记的抗体b-lgmn-2(0.8mg/ml)稀释成1:1000、1:2000、1:4000和1:80004个梯度，设定棋盘滴定试验。以阳性孔od450值在1.0左右，空白孔的od450小于0.1的条件作为最佳抗体工作浓度。据实验结果，包被抗体的浓度确定为2μg/ml，检测抗体的稀释度为1:4000，浓度为2μg/ml。
6.人legumain夹心elisa定量检测试剂盒标准曲线的制作
本发明的单克隆抗体可以应用于legumain抗原含量的检测。其中一种单克隆抗体可以作为双抗体夹心elisa检测试剂盒包被抗体，另一种抗体可以进行生物标记或化学标记，作为双抗体夹心elisa的酶标抗体；纯化的legumain抗原可以作为标准品，制作抗原含量检测的标准曲线，对待测样品的legumain含量进行定量。
人legumain夹心elisa定量检测试剂盒标准曲线的制作：向包被有捕获抗体的酶标板中加入100μl/孔梯度稀释的人legumain，设置6个重复，37℃反应1h；洗涤酶标板，加入100μl/孔的生物素标记的检测抗体b-lgmn-2，37℃反应1h；洗涤酶标板，加入100μl/孔的abc复合物工作液，37℃反应15～30min；洗涤酶标板；每孔加入底物显色液a液过氧化脲50μl，底物显色液b液四甲基联苯胺(tmb)50μl，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色10分钟，每孔加入2mol/l硫酸终止液50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光值(od值)。得出一组od450-legumain浓度值(表2)。通过抗原浓度的自然对数ln(x)与od450值得曲线图(图5浓度的自然对数与od450值的关系图)。由图5可知抗原在20～2560ng/ml浓度范围内具有良好的线性，并且包含了8个标准点，确定此范围为该方法的检测范围。经过origin8软件拟合得出线性标准曲线和对应的线性方程y＝0.238x-0.475，标准曲线的检测范围为20～2560ng/ml，公式中x为测得的legumain的od450值，y值为对应的legumain浓度对数值，线性相关系数r2为0.991(图6标准曲线图)。测定legumain浓度时，只需将的x值代入公式，计算出的y值即为legumain浓度对数值。
表2双抗夹心elisa检测不同浓度legumain的od450nm值
本发明的双抗体夹心elisa方法可以制备成双抗体夹心elisa试剂盒，用来检测临床肿瘤病人血清中legumain抗原的含量。以此可以作为评价肿瘤是否存在高扩散风险的标准，同时还可以用来作为肿瘤病人预后判断的指标。
实施例3、本发明试剂盒的使用方法
1、血清样品的稀释
将待检血清(佑安医院)用样本稀释液按1:100稀释，取5ul血清用495ul样本稀释液稀释并混匀。
2、检测
向包被有捕获抗体的酶标板中加入100μl/孔梯度稀释的人legumain，设置6个重复，37℃反应1h；洗涤酶标板，加入100μl/孔的生物素标记的检测抗体b-lgmn-2，37℃反应1h；洗涤酶标板，加入100μl/孔的abc复合物工作液，37℃反应15～30min；洗涤酶标板；每孔加入底物显色液a液过氧化尿素50μl，底物显色液b液四甲基联苯胺(tmb)50μl，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色10分钟，每孔加入2mol/l硫酸终止液50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光值(od值)。
3、检测结果分析
将待检测样品吸光度带入标准曲线的方程，即可求得样品浓度。本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件(spss)，此法更便于大量样品的快速分析。
实施例4.试剂盒精密度、准确度、灵敏度和保存期检测
1.精密度试验
根据上述的制备方法制备不同批次(001批、002批、003批)的试剂盒，从中各抽取3个试剂盒，进行试验，测定1660ng/ml、450ng/ml、103.75ng/mllegumain溶液的浓度值，每个样品重复8次，分别计算变异系数(cv％)。通过试验考察(表3、表4)，该检测方法的批内变异系数为，4.86±1.05％，批间变异系数为8.03±1.08％，满足批内精密度小于10％，批间精密度小于15％的要求。
表3批内精密度测定结果
表4批间精密度测定结果
2.特异性评定
添加cathepsinb，cathepsinh和cathepsinl孔的od450值与标准曲线上空白孔od450值相近，与legumain蛋白孔差异性显著(p>0.05)，故该方法的特异性较好。
3.灵敏度试验
通过试验得出此elisa方法的检测限为20ng/ml。通过标准曲线，该方法的定量限设为20ng/ml，抗原在20～2560ng/ml浓度范围内具有良好的线性。
4、试剂盒保存期试验
试剂盒保存条件为2-8℃，经过12个月的测定，试剂盒的线性关系、精密度、准确度实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置9天，进行加速试验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。从以上结果可得出试剂盒在2-8℃至少可以保存12个月。
实施例4、本发明的试剂盒临床试验评价
用本发明制备的试剂盒对30例正常人血清样本和20例确诊的乳腺癌病人血清样本(佑安医院)进行平行检测，检测程序和结果判断严格按照如下方法进行。包被有捕获抗体的酶标板中加入100μl/孔梯度稀释的人legumain，设置6个重复，37℃反应1h；洗涤酶标板，加入100μl/孔的生物素标记的检测抗体b-lgmn-2，37℃反应1h；洗涤酶标板，加入100μl/孔的abc复合物工作液，37℃反应15～30min；洗涤酶标板；加入200μl/孔的底物显色液，37℃条件下孵育显色15min，用酶标仪测定od450值，得出一组od450-legumain浓度值
检测结果如表5和表6所示。
1.检测基准值测定：通过对30例健康受试者血清检测，获得正常人血清中人legumain抗体浓度的基准数值分布情况(见图2)。正常人legumain浓度平均值及标准差为11.32±6.85ng/ml/ml。本实验的数据录于表5。
表5正常人legumain含量检测结果
2.经临床确诊的乳腺癌病人经用本定量试剂盒显示legumain含量有显著意义地升高(见图3)，平均含量高达111.57±42.22u/ml。本实验检测数据见表6。
表6未治疗乳腺癌病人legumain含量检测结果
如表5、表6所示，30例正常人legumain含量除一例高于临床判定值30ng/ml外，其余均低于临床判定值，特异性为93.3％(28/30)；20例未治疗乳腺癌病人中19例legumain含量均高于临床判定值，敏感性85％(17/20)；对6例分期治疗乳腺癌患者进行追踪legumain含量检测发现，随着治疗周期和治疗强度的增加，患者legumain含量呈明显的降低趋势。以上结果提示，该试剂盒对于乳腺癌病人治疗效果监测，具有极为重要的意义。
3.完成实验的关键注意点：
(1)按要求将所有试剂回升至室温22-25℃，测量实验台面的温度为22-25℃。
(2)将锡箔袋回至室温后，沿横向边压封线外侧剪开，取出需用数量的酶标板及框架，将不用的酶标板立即放回原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-8℃。
(3)如果用移液器洗酶标板时，移液器管尖千万不要进入酶标板孔中，不要接触到放进孔中的液体，避免污染洗涤液造成洗板不彻底。
(4)实验完毕后，如果容器再次使用，请认真洗净容器，不要造成容器的交叉污染，特别是不要将盛装过标准溶液的容器与其它容器同时洗涤(最好丢弃)。
(5)所有吸头应该一次性使用，要使用高品质的吸头。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
<110>李伟
<120>检测人legumain的elisa检测试剂盒及其应用
<130>p170110/jfq
<160>1
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>1302
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>legumain编码基因
<400>1
atggtttggaaagtagctgtattcctcagtgtggccctgggcattggtgccgttcctata60
gatgatcctgaagatggaggcaagcactgggtggtgatcgtggcaggttcaaatggctgg120
tataattataggcaccaggcagacgcgtgccatgcctaccagatcattcaccgcaatggg180
attcctgacgaacagatcgttgtgatgatgtacgatgacattgcttactctgaagacaat240
cccactccaggaattgtgatcaacaggcccaatggcacagatgtctatcagggagtcccg300
aaggactacactggagaggatgttaccccacaaaatttccttgctgtgttgagaggcgat360
gcagaagcagtgaagggcataggatccggcaaagtcctgaagagtggcccccaggatcac420
gtgttcatttacttcactgaccatggatctactggaatactggtttttcccaatgaagat480
cttcatgtaaaggacctgaatgagaccatccattacatgtacaaacacaaaatgtaccga540
aagatggtgttctacattgaagcctgtgagtctgggtccatgatgaaccacctgccggat600
aacatcaatgtttatgcaactactgctgccaaccccagagagtcgtcctacgcctgttac660
tatgatgagaagaggtccacgtacctgggggactggtacagcgtcaactggatggaagat720
tcggacgtggaagatctgactaaagagaccctgcacaagcagtaccacctggtaaaatcg780
cacaccaacaccagccacgtcatgcagtatggaaacaaaacaatctccaccatgaaagtg840
atgcagtttcagggtatgaaacgcaaagccagttctcccgtccccctacctccagtcaca900
caccttgacctcacccccagccctgatgtgcctctcaccatcatgaaaaggaaactgatg960
aacaccaatgatctggaggagtccaggcagctcacggaggagatccagcggcatctggat1020
gccaggcacctcattgagaagtcagtgcgtaagatcgtctccttgctggcagcgtccgag1080
gctgaggtggagcagctcctgtccgagagagccccgctcacggggcacagctgctaccca1140
gaggccctgctgcacttccggacccactgcttcaactggcactcccccacgtacgagtat1200
gcgttgagacatttgtacgtgctggtcaacctttgtgagaagccgtatccgcttcacagg1260
ataaaattgtccatggaccacgtgtgccttggtcactactga1302