刺梨SSR标记多态性检测的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法与流程

本发明涉及实验
技术领域：
，尤其是一种刺梨ssr标记多态性检测的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。
背景技术：
：聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,page)技术由于其检测灵敏度和分辨率高的特点，特别适合于像ssr这样的小片段扩增产物的检测，是分子生物学和基因工程研究上不可缺少的实验技术。其技术主要包含以下几个步骤:(1)聚丙烯酰胺凝胶制备；(2)电泳；(3)银染显色；(4)照相。整个过程比较繁琐，需要用到多种仪器及化学试剂。刺梨(rosaroxburghiitratt.)为我国特有的新兴果树，因其果实含有丰富的营养物质和药用成分，特别是极高的维生素c含量而引起国内外的广泛关注。但采用现有的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对其ssr标记多态性进行检测所获得的结果极不稳定，容易受多种因素的影响，如试剂配比、温度等。技术实现要素：本发明的目的是：提供了一种刺梨ssr标记多态性检测的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，它适用于刺梨ssr标记多态性检测，能稳定的获得高清晰度的电泳结果，以克服现有就技术的不足。本发明是这样实现的：刺梨ssr标记多态性检测的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，包括如下步骤：步骤一、聚丙烯酰胺凝胶制备：1)封胶：将平面玻璃板和凹面玻璃板放在桌面上，灌胶面朝上，滴无水乙醇于板面上，再用称量纸擦拭干净后阴干，在阴干后在凹面玻璃板的灌胶面滴上质量百分比为4％的亲和硅烷，并擦拭均匀，待阴干后将玻璃板置于制胶条内，使玻璃板与制胶条结合完全，然后将玻璃面呈60°倾斜放在支撑物上，平面玻璃板朝上；将浓度为30g/l琼脂糖溶液均匀的滴入制胶条与平面玻璃板结合部，整个过程要迅速，避免琼脂糖溶液凝固，15-20分钟后，琼脂糖溶液凝固完全，完成封胶；2)配胶、灌胶、凝胶：将封好胶的玻璃板带制胶条放进垂直电泳槽内，拧紧旋钮。将以下母液逐一按量加入烧杯中混匀，按照用量由多到少的顺序先将30％acr:bis、10×tbe和ddh2o加入烧杯中充分混匀，然后加入20％ap和temed，用玻璃棒搅拌，充分混匀，然后将胶液沿着凹口变缓缓倒入两个玻璃板的夹层中，缓慢插入与胶厚度一致的梳子(倒胶与插梳子过程中要避免产生气泡)，将电泳槽置于25℃的环境中，待胶完全凝固，获得聚丙烯酰胺凝胶；步骤二、电泳：1)往电泳槽内加入适量1×tbe电泳缓冲液；2)用胶头滴管吹去梳子与玻璃板结合处的残胶，再拔出梳子，吸取电泳缓冲液冲洗点样孔，除去气泡；3)将ssr扩增产物样品加入点样孔中，最后点markerdna；4)恒压电泳90min，保持电压恒定150v；步骤三、银染显色：当染料接近胶底边缘或刚好抛出时，电泳结束；关闭电泳仪，回收电泳缓冲液，拧开电泳槽旋钮，取出玻璃板，小心的将封胶条取下，并去掉多余的琼脂糖胶；撬开平面玻璃板，使平面玻璃板与胶分离，而胶仍贴在凹面玻璃板上，然后开始银染显色，处理均在摇床上进行，具体步骤如下：1)固定：将凹面玻璃板放置在长方形盘内，加入质量百分比为10％的冰醋酸，在摇床上缓慢摇动固定15min，然后回收固定液；2)漂洗：用蒸馏水冲洗2次，每次2min；3)染色：将固定好的凝胶放入质量百分比为0.2％的硝酸银溶液中银染12min，保证摇床处于黑暗状态，然后回收硝酸银溶液；4)漂洗：用蒸馏水快速冲洗凝胶3-4次，每次5s。5)显影：把凝胶放入显影液中，先暗显色3min，再打开光源，观察凝胶显色情况，待出现清晰条带后，显色完成；步骤四、照相：用凝胶成像分析仪照相。所述的显影液由双蒸馏水、氢氧化钠及甲醛组成，其中，每升双蒸馏水中还有15g氢氧化钠及3ml甲醛。与现有的技术相比，本发明针对刺梨ssr标记多态性检测优化出合适的凝胶及电泳参数，按照本发明的具体流程操作可以稳定的得到分辨率高、条带清晰的电泳图胶片。且本发明操作简单，重复性好，成本低廉。附图说明附图1、2、3为本发明的灌胶、凝胶及电泳过程，同时在15℃、25℃、30℃左右环境中结构示意图；附图4、5、6为本发明所筛选的不同电泳条件(300v，30min；200v，60min；150v，90min)下得到的电泳图。具体实施方式本发明的实施例：本发明实验进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，其玻璃板规格为20cm×11.2cm，去掉板条尺寸，胶为18.4cm×11.2cm×1mm。(1)封胶：清洗玻璃板、烧杯、玻璃棒和量筒，洗净后的玻璃板置于通风处晾干(制胶用玻璃板灌胶面必须干净无水分，否则灌胶时容易产生气泡)。将平面玻璃板和凹面玻璃板放在桌面上(灌胶面朝上)，滴少许无水乙醇于板面上，用称量纸(质量好、不易掉毛)擦拭干净，阴干后在凹面玻璃板的灌胶面滴上200ul4％亲和硅烷，用称量纸擦拭均匀，待阴干后将玻璃板置于制胶条内，保证玻璃板与制胶条结合完全，然后将玻璃面呈60度倾斜放在支撑物上(平面玻璃板朝上)。称取1.5g琼脂糖溶于50ml水于烧杯中，置于微波炉内加热，使琼脂糖充分溶解。然后将琼脂糖溶液用胶头滴管均匀的滴入制胶条与平面玻璃板结合部，整个过程要迅速，避免琼脂糖溶液凝固，15-20分钟后，琼脂糖溶液凝固完全，完成封胶。封胶中应注意事项：a.玻璃板应清洗干净及晾干，否则后续灌胶时容易产生气泡。要控制好琼脂糖溶液的浓度，过大不容易渗入玻璃板内，过低则容易漏胶。b.琼脂糖溶液凝固时，环境温度不能过高，否则会影响其凝固，导致漏胶。c.配胶、灌胶、凝胶：将封好胶的玻璃板带制胶条放进垂直电泳槽内，拧紧旋钮。将以下母液逐一按量加入烧杯中混匀。试剂母液用量(40ml)用量(80ml)30％acr:bis10.7ml21.4ml10×tbe4ml8mlddh2o24.75ml49.5ml20％aps200ul400ultemed20ul40ul按照用量由多到少的顺序先将30％acr:bis、10×tbe和ddh2o加入烧杯中充分混匀，然后加入20％ap和temed，用玻璃棒搅拌，充分混匀，然后将胶液沿着凹口变缓缓倒入两个玻璃板的夹层中，缓慢插入与胶厚度一致的梳子(倒胶与插梳子过程中要避免产生气泡)，待胶凝固。常规的凝胶方法，没有考虑温度这一要素，笔者在试验过程中，发现温度对凝胶的质量有很大的影响。基于凝胶的温度，进行了对照试验：a.将灌胶、凝胶过程在15℃左右环境中进行，然后在相同温度环境下进行电泳，结果如附图1所示；b.将灌胶、凝胶过程在25℃左右环境中进行，然后在相同温度环境下进行电泳，结果如附图2所示；c.将灌胶、凝胶过程在35℃左右环境中进行，然后在相同温度环境下进行电泳，结果如附图3所示；从图中可以看出，在本发明所确定的温度下(25℃)进行凝胶及电泳可以得到质量高，条带清晰的胶片。(2)配胶、灌胶、凝胶中应注意的事项：a.灌胶时，胶液要匀速稳定的倒入玻璃板夹层内，避免产生气泡；b.梳子保持干净、干燥，垂直插入玻璃板夹层内，同时避免产生气泡。2.电泳(1)15-20分钟后，胶液充分凝固，往电泳槽内加入适量1×tbe电泳缓冲液。(2)用胶头滴管轻轻吹去梳子与玻璃板结合处的残胶，缓缓的拔出梳子，用2.5ml医用注射器吸取电泳缓冲液冲洗点样孔，除去气泡。(3)将ssr扩增产物样品加入点样孔中，每个样品点1.5ul，最后点markerdna。(4)恒压电泳，整个电泳过程保持电压恒定，否则条带容易弯曲。基于电泳电压大小及电泳时间，进行了试验设计：序号电压大小(v)电泳时间(min)130030220060315090基于上述试验设计，进行了对照试验：分别按照上述的设计进行电泳，电泳结果见附图4、5、6，从图中可以看出，本发明所筛选的电泳条件(150v，90min)可以得到条带清晰、分辨率高的胶片。3.银染显色当染料接近胶底边缘或刚好抛出时，电泳结束；关闭电泳仪，回收电泳缓冲液，拧开电泳槽旋钮，取出玻璃板，小心的将封胶条取下，并去掉多余的琼脂糖胶；用镊子轻轻撬开平面玻璃板，使平面玻璃板与胶分离，而胶仍贴在凹面玻璃板上，然后开始银染显色，处理均在摇床上进行，具体步骤如下：(1)固定：将凹面玻璃板放置在长方形盘内，加入固定液(10％冰醋酸)在摇床上缓慢摇动固定15min，然后回收固定液(固定液可多次利用)。(2)漂洗：加入500ml蒸馏水冲洗2次，每次2min。(3)染色：将固定好的凝胶放入0.2％硝酸银溶液中银染12min，保证摇床处于黑暗状态，然后回收硝酸银溶液(可重复使用2-3次)。(4)漂洗：用蒸馏水快速冲洗凝胶3-4次，每次5s。(5)显影：把凝胶放入显影液(500ml双蒸馏水+7.5g氢氧化钠+1.5ml甲醛)中。先暗显色3min，再打开光源，观察凝胶显色情况，待出现清晰条带后，显色完成。4.照相用凝胶成像分析仪照相。当前第1页12