高凝血状态的生物标志物及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及高凝血状态的生物标志物及其应用。
背景技术：
：机体受到生理或病理因素刺激时，会产生一系列的变化，其中可监测的变化被称为生物标志物。生物标志物的最根本特征是变化。当机体受到刺激后，体内原本的平衡状态被打破，细胞、组织和器官会产生一些异常的代谢产物，并将其排出体外，以恢复原有的平衡，维持内环境稳态。与血液相比，尿液由于不受机体稳态机制的调节，可以积累大量变化，能够更好地反应机体的变化，是一种良好的生物标志物的来源。同时，尿液具有大量、无创、可连续收集等优势，对尿液中各类代谢产物的研究越来越受到人们的重视。虽然尿液在生物标志物研究方面具有很多优势，但由于蛋白质组具有明显的个体差异，且多种生理性因素，如年龄、性别、运动、饮食等，均会使尿液蛋白质组产生变化，这就使得直接研究人类的尿液蛋白质组学比较困难。而采用动物模型进行尿蛋白质组研究，筛选可能的候选疾病生物标志物，就可通过严格控制实验条件，将个体差异和环境等因素对尿蛋白质组的影响降到最低，从而在较短的时间内获得比较可信的实验结果，是目前较为流行的一种寻找尿液生物标志物的方法。血液高凝状态(hypercoagulablestates)是指血液处于非常容易凝结的状态，通常被认为是血栓前状态，最终会导致动静脉血栓的形成。血栓性疾病常常是心血管疾病的严重并发症。高凝状态的相关生物标志物研究，目前可见报道主要是一些血液生物标志物的相关报道，而未见相关尿液生物标志物研究报道。同时，临床上对于高凝状态的诊断方法，主要集中于血液检测方面，如凝血因子检测、d-二聚体检测、凝血时间检测等。但技术实现要素：本发明使用三种不同的促凝血药物(酚磺乙胺、氨甲环酸和氨基己酸)，分别对大鼠的凝血状态进行干预，成功得到大鼠急性高凝血状态模型。然后采用完全一致的分析策略，分析了不同促凝血药物干预组的大鼠尿液蛋白质组的变化，首次系统研究了高凝血状态下，尿液蛋白质组的变化特征，并寻找到高凝血状态相关尿液生物标志物。本发明首先提供了检测x含量的系统的新用途。本发明提供了检测x含量的系统在制备诊断或辅助诊断高凝血状态的产品中的应用；本发明还提供了检测x含量的系统在制备诊断或辅助诊断血栓性疾病和/或心血管疾病的产品中的应用；本发明还提供了检测x含量的系统在诊断或辅助诊断高凝血状态中的应用；本发明还提供了检测x含量的系统在诊断或辅助诊断血栓性疾病和/或心血管疾病中的应用；所述x为如下x1)或x2)或x3)：x1)为高尔基体蛋白i、碳酸酐酶i、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、核糖核酸酶4、氯离子胞内通道蛋白1、双糖链蛋白多糖、rabgdp解离抑制剂、磷酸甘油酸激酶1、黄曲霉毒素b1醛还原酶成员2、组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1、肌球蛋白轻链6、l-木酮糖还原酶和血红蛋白β亚基；x2)为胞液氨肽酶、核苷三磷酸二磷酸水解酶5、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-1亚基、肌动蛋白样蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(k)α亚基、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-2亚基、血管紧张素转换酶2同系物、超氧化物歧化酶[cu-zn]、淀粉样蛋白2、钙结合蛋白、延胡索酰乙酰乙酸酶、肌球蛋白轻链6、卷曲蛋白2、载脂蛋白m、肌红蛋白、肝配蛋白b1、硒结合蛋白1和钙调蛋白(cam)；x3)为细胞粘附分子3、前胶原c-内肽酶增强剂1、铜蓝蛋白、硫氧还蛋白(trx)、肽基脯氨酰顺反异构酶a、abhd14b蛋白、卷曲蛋白4、α-烯醇化酶、炭疽毒素受体1、卷曲蛋白2、吸引素、neuroplastin、cd166抗原、谷胱甘肽s-转移酶p、碱性磷酸酶、14-3-3蛋白ζ/δ、喹诺酮氧化还原酶、rhogdp-解离抑制剂1、过氧化物还原酶-6、多磷酸肌醇磷酸酶1、葡萄糖-6-磷酸异构酶、e3泛素-蛋白连接酶ubr4、前列腺素f2受体负调节因子、氯离子胞内通道蛋白4、组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1、连接粘附分子c、斯钙素-1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、n(g),n(g)-二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1、α-n-乙酰半乳糖胺酶、延胡索酰乙酰乙酸酶、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、硒结合蛋白1和硫酸软骨素蛋白多糖4。上述应用中，所述检测x含量的系统可为利用现有技术中的方法检测所述x含量所需的试剂和/或仪器，如利用质谱或其相关技术检测所述x含量所需的试剂和/或仪器，或利用免疫杂交技术检测所述x含量所需的试剂和/或仪器，或利用elisa技术检测所述x含量所需的试剂和/或仪器，或利用蛋白芯片或试纸检测所述x含量所需的试剂和/或仪器；所述x含量为尿液中x含量。本发明发现促凝血药物(酚磺乙胺、氨甲环酸和氨基己酸)干预后，大鼠凝血功能发生改变，导致尿液蛋白质组发生变化，说明尿液可以反映血液的变化。尿液作为积累体内代谢物的最终场所，不受稳态机制调控，可以反映大量的变化，大量的变化意味着大量的潜在生物标志物。本发明所涉及的酚磺乙胺，中文别名：止血敏、止血定、羟苯磺乙胺、氢醌磺乙胺，化学名称为2,5-二羟基苯磺酸二乙胺盐，其分子式：c10h17no5s，分子量为263.31，分子结构示意图如图1所示。本发明使用酚磺乙胺对大鼠的凝血状态进行干预，成功得到大鼠急性高凝血状态模型，基于酚磺乙胺构建的大鼠高凝血状态动物模型的蛋白质组学分析，得到20个显著差异蛋白，其中，有13个为人类同源蛋白，即上述x1)中所述的13个蛋白，并将其作为酚磺乙胺诱导所致高凝血状态的生物标志物。酚磺乙胺诱导所致高凝血状态指的是由于初级凝血功能增强导致的血液高凝状态，即通过促进血管收缩，促进血小板的聚集、粘附和活性因子的释放，所导致的高凝状态，也可称为血栓前状态。本发明所涉及的氨甲环酸，化学名称为4-(氨甲基)环己甲酸，又名为凝血酸、传明酸、止血环酸，分子式为c8h15no2，分子量为157.21，其分子结构示意图如图1所示；氨甲环酸能与纤溶酶和纤溶酶原上的纤维蛋白亲和部位的赖氨酸结合部位(lbs)强烈吸附，阻抑了纤溶酶、纤溶酶原与纤维蛋白结合，从而强烈地抑制了由纤溶酶所致纤维蛋白分解，从而达到血液高凝态。本发明使用氨甲环酸对大鼠的凝血状态进行干预，成功得到大鼠急性高凝血状态模型，基于氨甲环酸构建的大鼠高凝血状态动物模型的蛋白质组学分析，得到28个显著差异蛋白，其中，有18个为人类同源蛋白，即上述x2)中所述的18个蛋白，并将其作为氨甲环酸诱导所致高凝血状态的生物标志物。氨甲环酸诱导所致高凝血状态指的是通过抑制纤溶酶活性所导致的高凝状态。本发明所涉及的氨基己酸，中文别名：6-氨基己酸，氨己酸、ε-氨基已酸、抗血纤溶酸，分子式为c6h13no2，分子量为131.17，其分子结构示意图如图1所示；氨基己酸可抑制纤溶酶原激活，从而使纤维蛋白溶酶原不能激活为纤维蛋白溶酶，从而抑制纤维蛋白的溶解，产生高凝血状态。本发明使用氨基己酸对大鼠的凝血状态进行干预，成功得到大鼠急性高凝血状态模型，基于氨基己酸构建的大鼠高凝血状态动物模型的蛋白质组学分析，得到65个显著差异蛋白，其中，有34个为人类同源蛋白，即上述x3)中所述的34个蛋白，并将其作为氨基己酸诱导所致高凝血状态的生物标志物。氨基己酸诱导所致高凝血状态指的是通过抑制纤维蛋白溶酶原的激活因子导致的高凝血状态。在实际应用中可以根据上述获得的高凝血状态的生物标志物按照如下(1)-(3)中任一种方法来判断受试者是否处于高凝血状态：(1)若受试者尿液的高尔基体蛋白i、碳酸酐酶i、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3和核糖核酸酶4的含量均高于健康人至少一倍，且氯离子胞内通道蛋白1、双糖链蛋白多糖、rabgdp解离抑制剂、磷酸甘油酸激酶1、黄曲霉毒素b1醛还原酶成员2、组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1、肌球蛋白轻链6、l-木酮糖还原酶和血红蛋白β亚基的含量均低于健康人至少一倍，则受试者处于或候选处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于酚磺乙胺诱导所致高凝血状态。若受试者尿液的高尔基体蛋白i、碳酸酐酶i、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3和核糖核酸酶4的含量未均高于健康人至少一倍，或氯离子胞内通道蛋白1、双糖链蛋白多糖、rabgdp解离抑制剂、磷酸甘油酸激酶1、黄曲霉毒素b1醛还原酶成员2、组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1、肌球蛋白轻链6、l-木酮糖还原酶和血红蛋白β亚基的含量未均低于健康人至少一倍，则受试者不处于或候选不处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于酚磺乙胺诱导所致高凝血状态。(2)若受试者尿液的胞液氨肽酶、核苷三磷酸二磷酸水解酶5、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-1亚基、肌动蛋白样蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(k)α亚基、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-2亚基和血管紧张素转换酶2同系物的含量均高于健康人至少一倍，且超氧化物歧化酶[cu-zn]、淀粉样蛋白2、钙结合蛋白、延胡索酰乙酰乙酸酶、肌球蛋白轻链6、卷曲蛋白2、载脂蛋白m、肌红蛋白、肝配蛋白b1、硒结合蛋白1和钙调蛋白(cam)的含量均低于健康人至少一倍，则受试者处于或候选处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于氨甲环酸诱导所致高凝血状态。若受试者尿液的胞液氨肽酶、核苷三磷酸二磷酸水解酶5、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-1亚基、肌动蛋白样蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(k)α亚基、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-2亚基和血管紧张素转换酶2同系物的含量未均高于健康人至少一倍，或超氧化物歧化酶[cu-zn]、淀粉样蛋白2、钙结合蛋白、延胡索酰乙酰乙酸酶、肌球蛋白轻链6、卷曲蛋白2、载脂蛋白m、肌红蛋白、肝配蛋白b1、硒结合蛋白1和钙调蛋白(cam)的含量未均低于健康人至少一倍，则受试者不处于或候选不处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于氨甲环酸诱导所致高凝血状态。(3)若受试者尿液的细胞粘附分子3、前胶原c-内肽酶增强剂1、铜蓝蛋白和硫氧还蛋白(trx)的含量均高于健康人至少一倍，且肽基脯氨酰顺反异构酶a、abhd14b蛋白、卷曲蛋白4、α-烯醇化酶、炭疽毒素受体1、卷曲蛋白2、吸引素、neuroplastin、cd166抗原、谷胱甘肽s-转移酶p、碱性磷酸酶、14-3-3蛋白ζ/δ、喹诺酮氧化还原酶、rhogdp-解离抑制剂1、过氧化物还原酶-6、多磷酸肌醇磷酸酶1、葡萄糖-6-磷酸异构酶、e3泛素-蛋白连接酶ubr4、前列腺素f2受体负调节因子、氯离子胞内通道蛋白4、组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1、连接粘附分子c、斯钙素-1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、n(g),n(g)-二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1、α-n-乙酰半乳糖胺酶、延胡索酰乙酰乙酸酶、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、硒结合蛋白1和硫酸软骨素蛋白多糖4的含量均低于健康人至少一倍，则受试者处于或候选处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于氨基己酸诱导所致高凝血状态。若受试者尿液的细胞粘附分子3、前胶原c-内肽酶增强剂1、铜蓝蛋白和硫氧还蛋白(trx)的含量未均高于健康人至少一倍，或肽基脯氨酰顺反异构酶a、abhd14b蛋白、卷曲蛋白4、α-烯醇化酶、炭疽毒素受体1、卷曲蛋白2、吸引素、neuroplastin、cd166抗原、谷胱甘肽s-转移酶p、碱性磷酸酶、14-3-3蛋白ζ/δ、喹诺酮氧化还原酶、rhogdp-解离抑制剂1、过氧化物还原酶-6、多磷酸肌醇磷酸酶1、葡萄糖-6-磷酸异构酶、e3泛素-蛋白连接酶ubr4、前列腺素f2受体负调节因子、氯离子胞内通道蛋白4、组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1、连接粘附分子c、斯钙素-1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、n(g),n(g)-二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1、α-n-乙酰半乳糖胺酶、延胡索酰乙酰乙酸酶、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、硒结合蛋白1和硫酸软骨素蛋白多糖4的含量未均低于健康人至少一倍，则受试者不处于或候选不处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于氨基己酸诱导所致高凝血状态。本发明的另一个目的是提供以上述x作为高凝血状态标志物的新用途。本发明提供了以上述x作为高凝血状态标志物在制备诊断或辅助诊断高凝血状态的产品中的应用；本发明还提供了以上述x作为高凝血状态标志物在制备诊断或辅助诊断血栓性疾病和/或心血管疾病的产品中的应用。本发明还提供了以上述x作为高凝血状态标志物在诊断或辅助诊断高凝血状态中的应用；本发明还提供了以上述x作为高凝血状态标志物在诊断或辅助诊断血栓性疾病和/或心血管疾病中的应用。本发明还有一个目的是提供诊断或辅助诊断高凝血状态的产品。本发明提供的诊断或辅助诊断高凝血状态的产品为上述检测x含量的系统。所述产品包括记载有如下内容的诊断卡：(1)若受试者尿液的高尔基体蛋白i、碳酸酐酶i、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3和核糖核酸酶4的含量均高于健康人至少一倍，且氯离子胞内通道蛋白1、双糖链蛋白多糖、rabgdp解离抑制剂、磷酸甘油酸激酶1、黄曲霉毒素b1醛还原酶成员2、组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1、肌球蛋白轻链6、l-木酮糖还原酶和血红蛋白β亚基的含量均低于健康人至少一倍，则受试者处于或候选处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于酚磺乙胺诱导所致高凝血状态。若受试者尿液的高尔基体蛋白i、碳酸酐酶i、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3和核糖核酸酶4的含量未均高于健康人至少一倍，或氯离子胞内通道蛋白1、双糖链蛋白多糖、rabgdp解离抑制剂、磷酸甘油酸激酶1、黄曲霉毒素b1醛还原酶成员2、组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1、肌球蛋白轻链6、l-木酮糖还原酶和血红蛋白β亚基的含量未均低于健康人至少一倍，则受试者不处于或候选不处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于酚磺乙胺诱导所致高凝血状态。(2)若受试者尿液的胞液氨肽酶、核苷三磷酸二磷酸水解酶5、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-1亚基、肌动蛋白样蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(k)α亚基、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-2亚基和血管紧张素转换酶2同系物的含量均高于健康人至少一倍，且超氧化物歧化酶[cu-zn]、淀粉样蛋白2、钙结合蛋白、延胡索酰乙酰乙酸酶、肌球蛋白轻链6、卷曲蛋白2、载脂蛋白m、肌红蛋白、肝配蛋白b1、硒结合蛋白1和钙调蛋白(cam)的含量均低于健康人至少一倍，则受试者处于或候选处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于氨甲环酸诱导所致高凝血状态。若受试者尿液的胞液氨肽酶、核苷三磷酸二磷酸水解酶5、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-1亚基、肌动蛋白样蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(k)α亚基、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-2亚基和血管紧张素转换酶2同系物的含量未均高于健康人至少一倍，或超氧化物歧化酶[cu-zn]、淀粉样蛋白2、钙结合蛋白、延胡索酰乙酰乙酸酶、肌球蛋白轻链6、卷曲蛋白2、载脂蛋白m、肌红蛋白、肝配蛋白b1、硒结合蛋白1和钙调蛋白(cam)的含量未均低于健康人至少一倍，则受试者不处于或候选不处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于氨甲环酸诱导所致高凝血状态。(3)若受试者尿液的细胞粘附分子3、前胶原c-内肽酶增强剂1、铜蓝蛋白和硫氧还蛋白(trx)的含量均高于健康人至少一倍，且肽基脯氨酰顺反异构酶a、abhd14b蛋白、卷曲蛋白4、α-烯醇化酶、炭疽毒素受体1、卷曲蛋白2、吸引素、neuroplastin、cd166抗原、谷胱甘肽s-转移酶p、碱性磷酸酶、14-3-3蛋白ζ/δ、喹诺酮氧化还原酶、rhogdp-解离抑制剂1、过氧化物还原酶-6、多磷酸肌醇磷酸酶1、葡萄糖-6-磷酸异构酶、e3泛素-蛋白连接酶ubr4、前列腺素f2受体负调节因子、氯离子胞内通道蛋白4、组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1、连接粘附分子c、斯钙素-1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、n(g),n(g)-二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1、α-n-乙酰半乳糖胺酶、延胡索酰乙酰乙酸酶、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、硒结合蛋白1和硫酸软骨素蛋白多糖4的含量均低于健康人至少一倍，则受试者处于或候选处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于氨基己酸诱导所致高凝血状态。若受试者尿液的细胞粘附分子3、前胶原c-内肽酶增强剂1、铜蓝蛋白和硫氧还蛋白(trx)的含量未均高于健康人至少一倍，或肽基脯氨酰顺反异构酶a、abhd14b蛋白、卷曲蛋白4、α-烯醇化酶、炭疽毒素受体1、卷曲蛋白2、吸引素、neuroplastin、cd166抗原、谷胱甘肽s-转移酶p、碱性磷酸酶、14-3-3蛋白ζ/δ、喹诺酮氧化还原酶、rhogdp-解离抑制剂1、过氧化物还原酶-6、多磷酸肌醇磷酸酶1、葡萄糖-6-磷酸异构酶、e3泛素-蛋白连接酶ubr4、前列腺素f2受体负调节因子、氯离子胞内通道蛋白4、组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1、连接粘附分子c、斯钙素-1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、n(g),n(g)-二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1、α-n-乙酰半乳糖胺酶、延胡索酰乙酰乙酸酶、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、硒结合蛋白1和硫酸软骨素蛋白多糖4的含量未均低于健康人至少一倍，则受试者不处于或候选不处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于氨基己酸诱导所致高凝血状态。本发明产品具体可为试剂盒。上述产品在制备诊断或辅助诊断血栓性疾病和/或心血管疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。上述产品在制备检测或评估受试者高凝血状态的产品中的应用也属于本发明的保护范围。上述产品在诊断或辅助诊断血栓性疾病和/或心血管疾病中的应用也属于本发明的保护范围。上述产品在检测或评估受试者高凝血状态的产品中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的最后一个目的是提供一种检测或评估受试者高凝血状态的方法。本发明提供的检测或评估受试者高凝血状态的方法是检测受试者中上述x含量。上述方法中，所述检测受试者中上述x含量为检测受试者尿液中上述x含量。上述方法中，评估受试者高凝血状态的方法参照上述产品中的诊断卡所记载的内容。上述方法中，所述受试者是哺乳动物；哺乳动物是人或非人哺乳动物。本发明的试验结果表明：三种不同促凝药物分别干预后，共得到105个显著变化的差异蛋白，这105个差异蛋白中有65个能够在人类中找到对等蛋白，即人类同源蛋白，在这65个人类同源蛋白中，有35个是人类核心尿蛋白质组成员，说明血液高凝状态下，人类核心尿蛋白质组可能会发生变化。本发明还发现差异蛋白的人类同源蛋白分布于各个不同组织中，但多集中于泌尿系统、消化系统和呼吸系统，说明凝血功能的改变，可能会影响这些系统的功能，也说明高凝血状态的机体干预范围是比较广泛的，机体高凝血状态作为一种显著的病理生理变化，可对机体多条代谢途径产生影响。本发明初步揭示了高凝血状态的机体干预范围和变化因子，而这些既可以提示相关生理病理机制、信号途径的变化特征，同时，也可以作为重要的生物标志物，应用于高凝血状态相关病理变化的检测和/或诊断，或者为此方面提供辅助信息。附图说明图1为酚磺乙胺、氨甲环酸和氨基己酸的结构示意图。a为酚磺乙胺的结构示意图；b为氨甲环酸的结构示意图；c为氨基己酸的结构示意图。图2为酚磺乙胺、氨甲环酸和氨基己酸致大鼠高凝血状态动物模型的建立方法的示意图。a为酚磺乙胺致大鼠高凝血状态动物模型的建立方法的示意图；b为氨甲环酸致大鼠高凝血状态动物模型的建立方法的示意图；c为氨基己酸致大鼠高凝血状态动物模型的建立方法的示意图。图3为酚磺乙胺、氨甲环酸和氨基己酸对大鼠aptt和ct的影响。a为酚磺乙胺对大鼠aptt和ct的影响；b为氨甲环酸对大鼠aptt和ct的影响；c为氨基己酸对大鼠aptt和ct的影响。图4为对照组(生理盐水组)和实验组的尿液蛋白质sds-page分析。a为生理盐水组和酚磺乙胺组的尿液蛋白质sds-page分析；b为生理盐水组和氨甲环酸组的尿液蛋白质sds-page分析；c为生理盐水组和氨基己酸组的尿液蛋白质sds-page分析。图5为高凝血状态尿液差异蛋白的组织表达分析。a为酚磺乙胺高凝血状态尿液差异蛋白的组织表达分析；b为氨甲环酸高凝血状态尿液差异蛋白的组织表达分析；c为氨基己酸高凝血状态尿液差异蛋白的组织表达分析。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的spf级雄性wistar大鼠，180-200g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，标准环境下适应性饲养一周后开始实验。下述实施例中采用活化部分凝血活酶时间(activatedpartialthromboplastintime，aptt)和凝血时间(clottingtime，ct)评估大鼠的凝血状态，以确定大鼠高凝血模型是否成功建立，具体测定方法如下：1、活化部分凝血活酶时间的测定大鼠内眦静脉采血后，按照血液:柠檬酸钠抗凝剂＝9:1(体积比)的比例加入柠檬酸钠抗凝剂，上下轻柔颠倒混匀5～6次，离心：4℃，2500g，15min，离心所得上清液即为血浆。取100μl血浆用于部分凝血活酶时间的测定。测定方法遵循试剂盒的产品说明书：37℃温浴100μl鞣花酸试剂(不超过15min)，然后加入100μl待测血浆，37℃温浴5min(不少于5min)，之后加入37℃预热的0.5mol/lcacl2溶液100μl，混匀并开始计时。当出现絮状沉淀时立即停止计时，即为活化部分凝血活酶时间。2、凝血时间测定采用毛细玻璃管法测定凝血时间。大鼠内眦静脉采血后，立即将25μl未加抗凝剂的静脉血吸入毛细玻璃管中，开始计时。计时过程中，与水平面呈±60°角度来回颠倒毛细玻璃管，直到玻璃管内的血液不再来回移动，停止计时，即为凝血时间。下述实施例中构建大鼠高凝血状态动物模型所用的试剂如表1所示，仪器及耗材如表1所示。表1、构建大鼠高凝血状态动物模型所用的试剂表2、构建大鼠高凝血状态动物模型所用的仪器及耗材仪器耗材公司硬质中性玻璃点样毛细管华西医科大学仪器厂dk-s22型电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司干式恒温器杭州奥盛仪器有限公司centrifuge5417reppendorf公司电子天平沈阳腾龙电子称量仪器厂实施例1、大鼠急性高凝血状态模型的建立一、基于酚磺乙胺构建大鼠高凝血状态动物模型1、实验方法将20只雄性wistar大鼠随机分成两组，每组10只，称重。其中一组大鼠腹腔注射酚磺乙胺注射液(250mg/kg体重)，记为实验组；另一组大鼠腹腔注射相应体积生理盐水注射液，记为对照组。第一次注射时间记为0h，每隔3h腹腔注射一次，共注射3次(即在0h、3h和6h各一次)。在第一次注射后9h(即第三次注射后3h)，立即内眦静脉采血，并检测大鼠的凝血功能，确定高凝血状态大鼠动物模型形成规格(流程图如图2所示)。通过aptt和ct两个重要指标来评估大鼠凝血功能的改变。aptt，即活化部分凝血活酶时间，是通过对内源性凝血的全部条件进行体外模拟，测定血浆凝固的时间，从而反映出内源凝血因子是否正常行使生物学功能。ct，即凝血时间，是指血液离开血管，在体外发生凝固所需的时间，用于检测内源性凝血途径中，各种凝血因子的数量和功能正常与否，同时还可检测是否有多余的抗凝物质。2、实验结果通过上述实验步骤，给予促凝药物酚磺乙胺之后，如图3所示的大鼠的活化部分凝血活酶时间(aptt)和凝血时间(ct)检测结果显示，wistar大鼠的aptt和ct均显著缩短(p<0.01)，表明大鼠的正常凝血功能被扰乱，处于高凝血状态，建模成功。二、基于氨甲环酸构建大鼠高凝血状态动物模型1、实验步骤雄性wistar大鼠20只，随机等分成两组，每组10只，称重。实验组大鼠灌胃氨甲环酸(315mg/kg)，对照组灌胃相应体积生理盐水。6h一次，共2次。将第一次灌胃时间记为0h，第二次灌胃时间则为6h。第一次灌胃后12h，立即内眦静脉采血，并检测大鼠的凝血功能，确定高凝血状态大鼠动物模型形成规格(流程图如图2所示)。2、实验结果通过上述实验步骤，经氨甲环酸作用之后，如图3所示的大鼠的活化部分凝血活酶时间(aptt)和凝血时间(ct)检测结果显示，wistar大鼠的aptt和ct均显著缩短(p<0.01)，表明灌胃氨甲环酸使大鼠凝血功能改变，血液处于高凝血状态，高凝态模型建模成功。三、基于氨基己酸构建大鼠高凝血状态动物模型1、实验方法雄性wistar大鼠20只，随机等分成两组，每组10只，称重。实验组大鼠灌胃氨基己酸(4.2g/kg)，对照组灌胃相应体积生理盐水。6h一次，共2次。将第一次灌胃时间记为0h，第二次灌胃时间则为6h。第一次灌胃后12h，立即内眦静脉采血，并检测大鼠的凝血功能，确定高凝血状态大鼠动物模型形成规格(流程图如图2所示)。2、实验结果通过上述实验步骤，经氨基己酸作用之后，如图2所示的大鼠的活化部分凝血活酶时间(aptt)和凝血时间(ct)检测结果显示，wistar大鼠的aptt和ct均显著缩短(p<0.01)，表明氨基己酸的干预改变了大鼠的凝血功能，血液处于高凝血状态，高凝态模型建模成功。上述方法成功建立了基于不同促凝血药物(酚磺乙胺、氨甲环酸和氨基己酸)的大鼠高凝血状态动物模型，基于此高凝血状态大鼠模型，可开展相关尿液蛋白质组学及相关生物标志物的研究工作，为相关于大鼠高凝血状态相关研究奠定重要的基础。实施例2、高凝血状态尿液蛋白质组学分析及生物标志物研究一、实验方法1、乙醇沉淀法提取尿液蛋白质组取实施例1中基于不同促凝血药物(酚磺乙胺、氨甲环酸和氨基己酸)构建的大鼠高凝血状态动物模型的尿液样品作为实验组样品，同时以各模型中的对照组的尿液样品作为对照组样品，并提取尿液样品中的蛋白质组。具体提取方法如下：取尿液样品8ml于洁净的50ml离心管中，离心：2500g，30min，4℃。转移上清液至洁净的50ml离心管中，离心：12000g，30min，4℃。量取上清液体积，转移至洁净的50ml离心管中，加入三倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，摇匀，于-20℃沉淀2小时。沉淀完成后，离心：12000g，30min，4℃。弃上清，室温风干沉淀(约20min)。向沉淀加入适量25mmnh4hco3(约600μl)复溶沉淀，移液枪反复吹打，使沉淀完全溶解。转移所得溶液至洁净的1.5mlep管中，超声3min，然后置于旋转混匀仪上4℃旋转混匀2h。之后，离心：12000g，30min，4℃，转移上清于干净的ep管中，即为提取得到的尿液蛋白质组。2、bradford法测蛋白浓度配制1μg/μl牛血清白蛋白(bsa)作为标准蛋白溶液，然后将标准蛋白溶液、bradford工作液及ddh2o按照表3中的体积混匀，终体积均为300μl，然后于96孔板中用酶标仪检测595nm处吸光度值，绘制标准曲线。表3、不同浓度标准蛋白溶液的配制对于尿液样品而言，各取1μl尿液样品，然后与285μlbradford工作液及14μlddh2o混合均匀，同样检测595nm处吸光度值，根据所得吸光度值，对照标准曲线，得到尿液样品的蛋白质浓度，之后，分装样品，-80℃冻存。3、sds-page初步检测尿蛋白质组1)sds-page检测尿蛋白质组(1)电泳前样品处理：每个样品上样量为20μg，将样品和5×sds-page上样缓冲液按照4:1的体积比混合均匀，沸水中加热10min使蛋白质变性。(2)根据说明书安装胶板，向缝隙中注入超纯水，10min后检测是否漏水。(3)按照表4所示，配制12％sds-page分离胶和5％sds-page浓缩胶。将分离胶灌入两玻璃板的缝隙中，速度要慢，尽量不要产生气泡，然后立即用无水乙醇覆盖封胶，室温放置20min。待分离胶凝固后倒去无水乙醇，用滤纸吸干残留的液体，稍微晾干，再灌入浓缩胶，插上梳子，室温静置20min，等待浓缩胶聚合。表4、12％sds-page分离胶和5％sds-page浓缩胶(4)待浓缩胶聚合完全后，将凝胶板固定于电泳装置上，内外槽分别加入1×sds电泳缓冲液，小心拔去梳子。(5)按照预定顺序上样，其中最左侧孔道加入蛋白marker。(6)电泳：在浓缩胶以80v恒压进行电泳，当溴酚蓝指示剂达浓缩胶与分离胶的分界线时，调节电压到120v，在分离胶以120v恒压电泳，待溴酚蓝指示剂达凝胶底部，停止电泳。(7)电泳结束后，小心取下凝胶，用超纯水反复冲洗，去除凝胶表面的电泳缓冲液。2)考马斯亮蓝染色(1)将凝胶放到玻璃培养皿中，加入适量考马斯亮蓝染液，脱色摇床上室温缓慢振荡2h，染色。(2)弃染液，超纯水漂洗数次，加入脱色液，脱色摇床上室温缓慢振荡过夜，中途更换脱色液2-3次，脱色致出现清晰蛋白条带，且背景颜色较浅为止。(3)弃脱色液，超纯水漂洗数次，浸入超纯水中，之后凝胶成像仪中成像。4、蛋白质的膜上辅助酶切1)蛋白质膜上辅助酶切(1)现配ua溶液(8m尿素，0.1mtris/hcl，ph8.5)和abc溶液(25mmnh4hco3溶液)。(2)清洗超滤管：在每个10kd超滤管内加入ua溶液200μl，离心：12000g，10min，18℃，弃下层滤过液。重复洗涤三次。(3)各取蛋白质样品200μg加在滤膜上，然后加入ua溶液，补充总体积至200μl，离心：12000g，40min，18℃，弃下层滤过液。(4)在滤膜上加入ua溶液200μl，用移液枪反复吹打，离心：12000g，40min，18℃，弃下层滤过液。此步骤重复三次。(5)在滤膜上加入abc溶液200μl，涡旋振荡30s。加入dtt至其终浓度为4.5mm(即加入0.9μl的1mdtt)，涡旋振荡30s，充分混匀后，50℃水浴1小时。(6)从水浴中取出样品，降温至室温，加入现配的iaa使其终浓度为10mm，涡旋振荡1min，充分混匀后，室温避光作用35min。(7)离心：12000g，40min，18℃，使液体充分离干，弃下层滤过液。(8)在滤膜上加入abc溶液200μl，移液枪反复吹打，使膜上蛋白质充分重悬，离心：12000g，40min，18℃，弃下层滤过液。重复此步骤两次。(9)在滤膜上加入abc溶液200μl，按蛋白质与胰酶的质量比为50:1加入胰酶，涡旋1min。然后，放入振荡混匀器中混匀：37℃，400rpm，30min。37℃恒温水浴，过夜酶切14h。(10)取出超滤管，加入甲酸只其终浓度为0.1％，以终止酶切反应。更换新的超滤管外管，离心：12000g，18℃，至接近完全干燥，转移滤过液至新ep管。(11)再向超滤管中加入abc溶液200μl，用移液枪反复吹打，涡旋30s，离心：12000g，18℃，离心至完全干燥。将滤过液与(10)中所得滤过液混合，即为蛋白的酶切产物。2)酶切产物除盐采用oasishlb固相萃取柱除盐法进行酶切产物除盐。具体步骤如下：(1)oasishlb固相萃取柱的活化：先后用1ml甲醇、1ml乙腈活化柱子。注意使滤液自然滴落。(2)oasishlb固相萃取柱的平衡：用1ml0.l％甲酸/2％乙腈平衡柱子。此步骤重复三次，自然滴落。(3)上样：加入4.4.1中所得酶切后的样品，让其自然滴落。(4)洗涤除盐：用1ml0.l％甲酸/2％乙腈洗涤脱盐5次。(5)肽段洗脱：加入1ml90％乙腈溶液洗脱萃取肽段，用1.5ml离心管收集洗脱液。样品自然滴落。(6)真空抽干样品，-80℃冻存备用。5、尿液蛋白的质谱鉴定1)bca法测肽段浓度(1)用0.1％甲酸稀释1μg/μl血管紧张素至0.1μg/μl，0.2μg/μl，0.5μg/μl。(2)用0.1％甲酸重溶酶切得到的肽段样品，重溶体积为20μl，测量时用0.1％甲酸稀释10倍。(3)配制bca工作液：a液与b液按照体积比50:1混合均匀。(4)标准曲线制作方法：按照表5所示，将液体加入96孔板中，混匀。表5、制作标准曲线所用试剂的浓度与体积血管紧张素浓度(μg/μl)00.10.20.51.0血管紧张素体积(μl)1010101010bca工作液体积(μl)200200200200200(5)样品孔加入10μl稀释后的肽段样品，200μlbca工作液。(6)37℃水浴30min。(7)测定562nm处吸光度值，绘制标准曲线，求出肽段浓度。(8)稀释肽段浓度至0.5μg/μl。稀释后，每个样品各取20μl，离心：12000g，30min，4℃，小心取出，取上清液等待质谱上样。2)液相色谱分离串联质谱鉴定(lc-ms/ms)用easy-nlc1200hplc系统上样，样品为4.5.1最后所得肽段，每个样品上样量为500ng。自动加样器将样品加入捕获柱(trapcolumn)(75μm×2cm，3μm，c18，)之后，以2.5μl/min的流速冲洗5min进一步去除杂质，之后以0.25μl/min的流速进行反向分析柱洗脱(50μm×150mm，2μm，c18，)。洗脱梯度为5-28％流动相b(流动相a为：0.1％甲酸+99.9％水；流动相b为：0.1％甲酸+79.9％乙腈+20％水)，时间为60min。洗脱下来的多肽采用orbitrapfusionlumosms质谱仪检测。喷雾电压2.1kv，离子传输管温度300℃。母离子m/z扫描范围为350-1550，扫描分辨率为120000。以最高速度模式获取ms/ms图谱，离子碎裂模式为hcd子离子m/z扫描范围为250-1800，扫描分辨率为60000，动态排除时间为30s。每个样品重复鉴定2次。不同样品之间均相隔两次30min的清洗程序，以减少样品间污染。3)数据分析(1)数据检索二级质谱结果用mascot2.4.0软件进行数据库检索。所用数据库为swiss-protratdatabase。检索条件为：胰酶酶切，允许最大2个漏切位点，肽段检索母离子误差为10ppm，子离子容许误差为0.02da，肽段假阳性率(fdr)<1％，只将鉴定到大于或等于2条肽段的蛋白质纳入分析。(2)差异蛋白筛选应用谱图数定量法进行差异蛋白的筛选工作。筛选标准：对照组谱图数平均值和实验组谱图数的平均数进行t-检验，p<0.05；变化倍数1.5倍，即实验组比对照组升高或降低≥1.5倍；升高组中最小谱图数>降低组中最大谱图数。二、实验结果(一)基于酚磺乙胺构建的大鼠高凝血状态动物模型的蛋白质组学分析及生物标志物1、酚磺乙胺高凝血状态模型尿液蛋白质的sds-page分析用sds-page初步分析促凝药物酚磺乙胺干预对尿液蛋白的影响，每个样品的上样量为20μg。sds-page显示：酚磺乙胺作用后的尿蛋白质样品，与对照组(生理盐水组)相比，绝大部分条带基本相同，没有明显的蛋白质降解(图4)。说明技术重复性良好，蛋白质样品质量良好，可以用于后续实验。sds-page结果无明显差异，说明变化的蛋白质可能是低丰度蛋白，超出了sds-page的分辨率，运用常规检测技术、方法无法分辨这种情况下的高凝血状态和对照组的蛋白质差异，需要更加精细的检测手段进行甄别判断。2、酚磺乙胺高凝血状态模型尿液蛋白质组质谱鉴定结果本发明共鉴定得到533个蛋白质，其中，生理盐水组(对照组)530个，酚磺乙胺组(实验组)504个，两组共同鉴定到501个。(1)酚磺乙胺高凝血状态模型差异蛋白种类根据筛选标准，具有显著差异的蛋白质共有20个，具体信息如表6所示。和对照组相比，酚磺乙胺高凝血状态模型的大鼠尿液中的dna酶-2-β、蛋白聚糖聚合物核心蛋白、高尔基体蛋白i、碳酸酐酶i、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、核糖核酸酶4、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、锌-α-2-糖蛋白和i类组织相容性抗原的含量明显提高，氯离子胞内通道蛋白1、双糖链蛋白多糖、rabgdp解离抑制剂β、谷胱甘肽s-转移酶α-3、磷酸甘油酸激酶1、黄曲霉毒素b1醛还原酶成员2、组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1、肌球蛋白轻链6、l-木酮糖还原酶、载脂蛋白a-iv和血红蛋白β亚基-1的含量明显降低。表6、酚磺乙胺高凝血状态模型的尿差异蛋白(2)酚磺乙胺高凝血状态模型尿液差异蛋白的人类同源性分析本发明通过构建高凝血状态大鼠模型，来探究血液高凝状态对人类尿蛋白质组的影响，进而为寻找高凝血状态尿液蛋白质组生物标志物提供一定的线索。不同物种的同源蛋白具有相似的结构和功能。通过uniprot网站(http://www.uniprot.org/blast/)进行序列比对，寻找大鼠高凝血状态差异蛋白的人类同源蛋白。本发明将已被swiss-prot数据库验证，且同源性≥80％的人类同源蛋白为可信的同源蛋白。比较发现，酚磺乙胺大鼠高凝血状态模型得到的20个差异蛋白中，有13个人类同源蛋白，具体信息如表7所示。将这13个人类同源蛋白与人类核心尿蛋白数据库(humancoreurinaryproteome)进行比对，发现其中有9个是人类核心尿蛋白质成员，提示高凝血状态下，人类核心尿蛋白质组可能发生变化。表7、酚磺乙胺致大鼠高凝血状态尿液差异蛋白的人类同源蛋白(3)酚磺乙胺致高凝血状态模型差异蛋白的组织表达分析将步骤(2)中差异蛋白的人类同源蛋白与人类蛋白质表达数据库(humanproteinatlas，http://www.proteinatlas.org)进行对比，筛选出表达量为high的组织类型，可以确定，有7个差异蛋白高表达于29个组织中，组织表达分析情况如表8和图5所示。其中，肾脏中高表达的蛋白量最多，这暗示着机体内部，对于血液高凝血状态反应最为敏感的器官是肾脏，肾脏应答高凝血状态变化，在蛋白表达方面进行了最大程度的调整与适应。此外，消化系统和神经系统中高表达的蛋白也较多。表8、酚磺乙胺高凝血状态模型的尿差异蛋白组织表达分析(二)基于氨甲环酸构建的大鼠高凝血状态动物模型的蛋白质组学分析及生物标志物1、氨甲环酸高凝血状态模型尿液蛋白质的sds-page分析用sds-page初步检测促凝血药物氨甲环酸干预对尿液蛋白的影响，每个样品的上样量为20μg。sds-page结果显示：尿液蛋白条带完整，蛋白质没有明显的降解。与对照组相比(生理盐水组)，氨甲环酸组的尿液蛋白在sds-page凝胶上没有显示出明显变化。可能是因为变化的蛋白质为低丰度蛋白(图4)。2、氨甲环酸高凝血状态模型尿液蛋白质组质谱鉴定结果本发明共鉴定得到582个蛋白质。其中，生理盐水组(对照组)568个，氨甲环酸组(实验组)563个，两组共同鉴定到549个。(1)氨甲环酸高凝血状态模型差异蛋白根据筛选标准，具有显著差异的蛋白质共有28个，具体信息如表9所示。和对照组相比，氨甲环酸高凝血状态模型的大鼠尿液中的胞液氨肽酶、smr1蛋白、核苷三磷酸二磷酸水解酶5、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-1亚基、肌动蛋白样蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(k)α亚基、cd302抗原、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-2亚基、血管紧张素转换酶2同系物、白细胞介素-4受体α亚基、巢蛋白-2和尿蛋白1的含量明显提高，三叶因子1、wap四硫化物核心结构域蛋白2、超氧化物歧化酶[cu-zn]、d-多巴胺脱羧酶、淀粉样蛋白2、普罗沙星(硫酸化糖蛋白1)、钙结合蛋白、延胡索酰乙酰乙酸酶、肌球蛋白轻链6、卷曲蛋白2、载脂蛋白m、肌红蛋白、肝配蛋白b1、硒结合蛋白1、胰石蛋白和钙调蛋白(cam)的含量明显降低。表9、氨甲环酸高凝血状态模型的尿差异蛋白(2)氨甲环酸高凝血状态模型尿液差异蛋白的人类同源性分析按照步骤(一)的2中的(2)中的方法分析差异蛋白的人类同源蛋白。氨甲环酸致大鼠高凝血状态，鉴定到的28个差异蛋白中，有18个有人类同源蛋白，其中，有10个是人类核心尿蛋白质组的成员，具体信息如表10所示。其中，凝血功能相关蛋白载脂蛋白m也属于人类核心尿蛋白质组。表10、氨甲环酸致大鼠高凝血状态尿液差异蛋白的人类同源蛋白(3)氨甲环酸高凝血状态模型差异蛋白的组织表达分析按照步骤(一)的2中的(3)中的方法确定差异蛋白的人类同源蛋白的组织表达。最终确定，有8个差异蛋白高表达于19个组织中，具体如表11和图5所示。可以看到，这些蛋白质大部分是在泌尿系统和消化系统中高表达。表11、氨甲环酸高凝血状态模型的尿差异蛋白组织表达分析组织水平uniprotid名称肝highp28838胞液氨肽酶胃highp28838胞液氨肽酶肾highp28838胞液氨肽酶附录higho75356核苷三磷酸二磷酸水解酶5肝higho75356核苷三磷酸二磷酸水解酶5直肠higho75356核苷三磷酸二磷酸水解酶5胃higho75356核苷三磷酸二磷酸水解酶5十二指肠higho75356核苷三磷酸二磷酸水解酶5结肠higho75356核苷三磷酸二磷酸水解酶5膀胱膀胱higho75356核苷三磷酸二磷酸水解酶5肾higho75356核苷三磷酸二磷酸水解酶5前列腺higho75356核苷三磷酸二磷酸水解酶5乳房higho75356核苷三磷酸二磷酸水解酶5胆囊highp62873鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-1亚基大脑皮层highp62873鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-1亚基唾液腺highp62873鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-1亚基肾highp62873鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-1亚基附录highq14019肌动蛋白样蛋白扁桃体highq14019肌动蛋白样蛋白淋巴结highq14019肌动蛋白样蛋白脾highq14019肌动蛋白样蛋白肝highp00441超氧化物歧化酶[cu-zn]小脑highp05937钙结合蛋白肾highp05937钙结合蛋白肝highp16930延胡索酰乙酰乙酸酶肾highp16930延胡索酰乙酰乙酸酶骨骼肌highp02144肌红蛋白心脏肌肉highp02144肌红蛋白鼻咽highq13228硒结合蛋白1支气管highq13228硒结合蛋白1肝highq13228硒结合蛋白1直肠highq13228硒结合蛋白1附录highq13228硒结合蛋白1甲状腺highq13228硒结合蛋白1结肠highq13228硒结合蛋白1(三)基于氨基己酸构建的大鼠高凝血状态动物模型的蛋白质组学分析及生物标志物1、氨基己酸高凝血状态模型尿液蛋白质的sds-page分析用sds-page初步检测促凝药物氨基己酸的干预对尿液蛋白质组的影响，每个样品的上样量为20μg。在sds-page凝胶上，可以看到，与对照组相比(生理盐水组)，氨基己酸组的尿液蛋白显示出一定的变化。分子量约为55kda的蛋白质，氨基己酸组比生理盐水组表达量要少一些，但分子量约为60kda左右的蛋白质，氨基己酸组比生理盐水组表达量要多一些。分子量为15kda上下的两条蛋白质条带，氨基己酸组比生理盐水组的表达量要略少，但分子量为15kda的蛋白质条带，氨基己酸组比生理盐水组表达量略高。两组尿液蛋白条带均完整，蛋白质没有明显的降解(图4)。2、氨基己酸高凝血状态模型尿液蛋白质组质谱鉴定结果本发明共鉴定得到423个蛋白质。其中，生理盐水组(对照组)417个，氨基己酸组(实验组)291个，两组共同鉴定到285个。(1)氨基己酸高凝血状态模型差异蛋白根据筛选标准，具有显著差异的蛋白质共有65个，具体信息如表12所示。和对照组相比，氨基己酸高凝血状态模型的大鼠尿液中的细胞粘附分子3、thy-1膜糖蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂a3m、补体c9、组织蛋白酶s、前胶原c-内肽酶增强剂1、铜蓝蛋白、补体因子d、前列腺碱性蛋白、硫氧还蛋白、cd59糖蛋白、血清白蛋白、cd44抗原、分泌磷蛋白24、β-2微球蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量明显提高，α-1抑制剂3、肽基脯氨酰顺反异构酶a、γ-谷氨酰转肽酶、abhd14b蛋白、甲基多巴aβ亚基、补体c3、卷曲蛋白4、α-烯醇化酶、炭疽毒素受体1、半胱氨酸蛋白酶抑制剂相关蛋白2、连接粘附分子a、卷曲蛋白2、巯基氧化酶1、吸引素、单核细胞分化抗原cd14、neuroplastin、cd166抗原、丛生蛋白、谷胱甘肽s-转移酶p、蛋白fam151a、碱性磷酸酶、谷胱甘肽s-转移酶α-3、14-3-3蛋白ζ/δ、前列腺蛋白、β-氨基己糖苷酶β亚基、喹诺酮氧化还原酶、d-多巴胺脱羧酶、rhogdp-解离抑制剂1、过氧化物还原酶-6、运钴胺素蛋白-2、多磷酸肌醇磷酸酶1、葡萄糖-6-磷酸异构酶、足糖萼蛋白、e3泛素-蛋白连接酶ubr4、前列腺素f2受体负调节因子、氯离子胞内通道蛋白4、组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1、抑制素-βc链、连接粘附分子c、斯钙素-1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、n(g),n(g)-二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1、α-n-乙酰半乳糖胺酶、延胡索酰乙酰乙酸酶、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、硒结合蛋白1、犬尿氨酸/α-氨基己酸转氨酶(线粒体)、硫酸软骨素蛋白多糖4和na(+)/h(+)交换调节辅因子nhe-rf3的含量明显降低。表12、氨基己酸高凝血状态模型的尿差异蛋白(2)氨基己酸高凝血状态模型尿液差异蛋白的人类同源性分析按照步骤(一)的2中的(2)中的方法分析差异蛋白的人类同源蛋白。氨基己酸致大鼠高凝血状态，鉴定到的65个差异蛋白中，有34个有人类同源蛋白，其中，有16个是人类核心尿蛋白质组的成员，具体信息如表13所示。表13、氨基己酸致大鼠高凝血状态尿液差异蛋白的人类同源蛋白(3)氨基己酸高凝血状态模型差异蛋白的组织表达分析按照步骤(一)的2中的(3)中的方法确定差异蛋白的人类同源蛋白的组织表达。分析后确定，有9个差异蛋白高表达于36个组织中，具体如表14和图5所示。可以看到，这些蛋白质在泌尿系统、消化系统和呼吸系统均有较高表达。表14、氨基己酸高凝血状态模型的尿差异蛋白组织表达分析因此，实际应用中可以根据上述各个模型筛选到的高凝血状态标志物按照如下(1)-(3)中任一种方法来判断受试者是否处于高凝血状态：(1)若受试者尿液的高尔基体蛋白i、碳酸酐酶i、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3和核糖核酸酶4的含量均高于健康人至少一倍，且氯离子胞内通道蛋白1、双糖链蛋白多糖、rabgdp解离抑制剂、磷酸甘油酸激酶1、黄曲霉毒素b1醛还原酶成员2、组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1、肌球蛋白轻链6、l-木酮糖还原酶和血红蛋白β亚基的含量均低于健康人至少一倍，则受试者处于或候选处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于酚磺乙胺诱导所致高凝血状态；若受试者尿液的高尔基体蛋白i、碳酸酐酶i、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3和核糖核酸酶4的含量未均高于健康人至少一倍，或氯离子胞内通道蛋白1、双糖链蛋白多糖、rabgdp解离抑制剂、磷酸甘油酸激酶1、黄曲霉毒素b1醛还原酶成员2、组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1、肌球蛋白轻链6、l-木酮糖还原酶和血红蛋白β亚基的含量未均低于健康人至少一倍，则受试者不处于或候选不处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于酚磺乙胺诱导所致高凝血状态。(2)若受试者尿液的胞液氨肽酶、核苷三磷酸二磷酸水解酶5、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-1亚基、肌动蛋白样蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(k)α亚基、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-2亚基和血管紧张素转换酶2同系物的含量均高于健康人至少一倍，且超氧化物歧化酶[cu-zn]、淀粉样蛋白2、钙结合蛋白、延胡索酰乙酰乙酸酶、肌球蛋白轻链6、卷曲蛋白2、载脂蛋白m、肌红蛋白、肝配蛋白b1、硒结合蛋白1和钙调蛋白(cam)的含量均低于健康人至少一倍，则受试者处于或候选处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于氨甲环酸诱导所致高凝血状态。若受试者尿液的胞液氨肽酶、核苷三磷酸二磷酸水解酶5、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-1亚基、肌动蛋白样蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(k)α亚基、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白g(i)/g(s)/g(t)β-2亚基和血管紧张素转换酶2同系物的含量未均高于健康人至少一倍，或超氧化物歧化酶[cu-zn]、淀粉样蛋白2、钙结合蛋白、延胡索酰乙酰乙酸酶、肌球蛋白轻链6、卷曲蛋白2、载脂蛋白m、肌红蛋白、肝配蛋白b1、硒结合蛋白1和钙调蛋白(cam)的含量未均低于健康人至少一倍，则受试者不处于或候选不处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于氨甲环酸诱导所致高凝血状态。(3)若受试者尿液的细胞粘附分子3、前胶原c-内肽酶增强剂1、铜蓝蛋白和硫氧还蛋白(trx)的含量均高于健康人至少一倍，且肽基脯氨酰顺反异构酶a、abhd14b蛋白、卷曲蛋白4、α-烯醇化酶、炭疽毒素受体1、卷曲蛋白2、吸引素、neuroplastin、cd166抗原、谷胱甘肽s-转移酶p、碱性磷酸酶、14-3-3蛋白ζ/δ、喹诺酮氧化还原酶、rhogdp-解离抑制剂1、过氧化物还原酶-6、多磷酸肌醇磷酸酶1、葡萄糖-6-磷酸异构酶、e3泛素-蛋白连接酶ubr4、前列腺素f2受体负调节因子、氯离子胞内通道蛋白4、组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1、连接粘附分子c、斯钙素-1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、n(g),n(g)-二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1、α-n-乙酰半乳糖胺酶、延胡索酰乙酰乙酸酶、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、硒结合蛋白1和硫酸软骨素蛋白多糖4的含量均低于健康人至少一倍，则受试者处于或候选处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于氨基己酸诱导所致高凝血状态。若受试者尿液的细胞粘附分子3、前胶原c-内肽酶增强剂1、铜蓝蛋白和硫氧还蛋白(trx)的含量未均高于健康人至少一倍，或肽基脯氨酰顺反异构酶a、abhd14b蛋白、卷曲蛋白4、α-烯醇化酶、炭疽毒素受体1、卷曲蛋白2、吸引素、neuroplastin、cd166抗原、谷胱甘肽s-转移酶p、碱性磷酸酶、14-3-3蛋白ζ/δ、喹诺酮氧化还原酶、rhogdp-解离抑制剂1、过氧化物还原酶-6、多磷酸肌醇磷酸酶1、葡萄糖-6-磷酸异构酶、e3泛素-蛋白连接酶ubr4、前列腺素f2受体负调节因子、氯离子胞内通道蛋白4、组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1、连接粘附分子c、斯钙素-1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、n(g),n(g)-二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1、α-n-乙酰半乳糖胺酶、延胡索酰乙酰乙酸酶、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、硒结合蛋白1和硫酸软骨素蛋白多糖4的含量未均低于健康人至少一倍，则受试者不处于或候选不处于高凝血状态；且这种高凝血状态的形成机制相关于氨基己酸诱导所致高凝血状态。当前第1页12