本发明属于分析化学领域，涉及一种基于苯硼酸功能化的银纳米粒子检测微生物的方法。
背景技术：
微生物作为公共健康、环境监测、食品安全和生化安全等领域的一大威胁，其快速、灵敏检测越来越引起人们的关注。传统的检测方法，如平板计数法，往往需要耗费3-7天的时间来得到检测结果；而聚合酶链式反应虽然可以快速地得到检测结果，但是操作复杂，同时需要昂贵的仪器。因此，开发准确、快速、灵敏、简便的微生物检测方法仍然是我们面临的一大挑战。
比色法由于具有简易、稳定、经济以及潜在的临床检测应用价值等优点，引起了人们的极大兴趣。酶联免疫反应作为一种应用最广泛的比色检测方法，是利用酶标记物催化底物显色来进行信号输出，实现检测的目的，而酶催化底物产生的发色团的消光系数会限制其检测灵敏度。为了提高比色法的检测灵敏度，这些年来，包括金纳米粒子和银纳米粒子在内的纳米等离子体激元材料由于具有特殊的光学性质给生命分析化学领域的研究带来了新的突破。基于纳米等离子体激元材料的比色检测法是通过识别分子修饰的金、银纳米材料与目标物的结合，来改变金、银纳米材料的分散状态，使其由分散态变为聚集态，使其颜色发生变化。传统的识别分子主要使用的是抗体，但抗体具有价格昂贵、不同批次质量存在差异以及不稳定等缺点。
近几年来，苯硼酸及其衍生物被作为识别分子在糖类和细菌的检测中的应用得到了极大关注。苯硼酸可人工合成，价格低廉，稳定性好，可与细菌表面的脂多糖及糖蛋白中含有的顺-邻二羟基结构可逆性地共价结合，经脱水形成环状酯，因此，可用作微生物的识别分子。目前，苯硼酸及其衍生物被作为识别分子多用于电化学传感器中，至今仍没有比色法用于微生物的检测的报道。本发明创造性地将苯硼酸作为纳米银聚集的激发剂，可将分散良好的苯硼酸功能化的纳米银转化为聚集态；而以苯硼酸为识别分子的纳米银可结合到细菌表面，细菌的存在可抑制苯硼酸功能化的纳米银的聚集，不同含量的细菌对苯硼酸功能化的纳米银聚集的抑制程度不同，使溶液颜色发生不同的变化。其颜色变化可通过肉眼进行分辨，同时可利用紫外可见分光光度计对其进行检测。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于苯硼酸功能化的银纳米粒子检测微生物的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案实施：
一种基于苯硼酸功能化的银纳米粒子检测微生物的方法，在待测微生物样品中加入苯硼酸功能化的银纳米粒子和巯基苯硼酸，反应后使得待检测样品中生物表面含有顺-邻二羟基基团，抑制苯硼酸功能化银纳米粒子的聚集，使溶液颜色发生不同的变化，通过比色检测或肉眼观察溶液颜色的变化实现样品中微生物的定量或半定量检测。
所述苯硼酸功能化的银纳米粒子和巯基苯硼酸的浓度分别为5nm和5-30nm。
苯硼酸功能化的银纳米粒子和巯基苯硼酸与微生物反应的条件为室温培养0.5-2h。
所述苯硼酸功能化的银纳米粒子制备过程为：向浓度为5nm的银纳米粒子中，加入10μl5-30nm浓度的巯基苯硼酸，室温下反应5-30min，即可得到苯硼酸功能化的银纳米粒子。
所述的巯基苯硼酸为4-巯基苯硼酸或3-巯基苯硼酸。
所述微生物为革兰氏阴性菌。
本发明的有益效果在于：
本发明比色分析法使用苯硼酸为微生物的识别分子，银纳米颗粒为信号元件具有工艺简单、操作简便、经济实用以及快速准确的优点，整个检测过程可在20min内完成，具有极大的临床应用的潜力。同时，其不需要昂贵的实验仪器，成本低廉，通过肉眼即可实现微生物的半定量检测，具有极大的推广使用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的不同形式聚集后的紫外可见吸收光谱图，其中，a为mpba-agnps,b为mpba-agnps与大肠杆菌结合，c为mpba-agnps加入过量4-巯基苯硼酸，d为mpba-agnps与大肠杆菌结合再加入加入过量4-巯基苯硼酸。
图2苯硼酸功能化的银纳米粒子中，加入1×107，5×106，1×106，5×105，1×105，5×104cfuml-1的大肠杆菌反应10min后，加入10μl300μm的巯基苯硼酸反应1min后的紫外可见吸收光谱图。
图3该检测方法下，1×107，5×106，1×106，5×105，1×105，5×104cfuml-1的大肠杆菌在398nm处测定的吸光度值图。
图4该检测方法下，1×107，5×106，1×106，5×105，1×105，5×104cfuml-1的大肠杆菌所对应的颜色图。
图5该检测方法下，1×107，1×106，1×105，1×104，1×103，1×102cfuml-1的硫酸盐还原菌所对应的颜色图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的解释说明。
本发明在含微生物样品中加入苯硼酸功能化的银纳米粒子和巯基苯硼酸，巯基苯硼酸能够有效的促使苯硼酸功能化银纳米粒子发生聚集作用，而样品中的微生物表面含有顺-邻二羟基基团，其可与苯硼酸基团结合，抑制苯硼酸功能化银纳米粒子的聚集，而不同含量的微生物会结合不同量的巯基苯硼酸，使溶液颜色发生不同的变化，通过检测或者观察溶液颜色的变化实现样品中微生物的定量或半定量检测。本发明具有工艺简单、操作简便、经济实用以及快速准确的优点，整个检测过程可在20min内完成，具有极大的临床应用的潜力。同时，其不需要昂贵的实验仪器，成本低廉，通过肉眼即可实现微生物的半定量检测，具有极大的推广使用价值。
实施例1
苯硼酸功能化的银纳米粒子的制备
将1ml100mm硝酸银溶液与1ml100mm柠檬酸三钠溶液在剧烈搅拌条件下，加入到36.8ml超纯水中。然后，加入1.2ml新配制的100mm硼氢化钠。溶液颜色会逐渐变为黄色，反应约10min后，将其移入4℃条件下老化2天。取1ml制备的银纳米粒子稀释16倍，然后加入10μl4-巯基苯硼酸，反应30min，即得到了苯硼酸功能化的银纳米粒子(参见图1)。
如图1所示，a为苯硼酸功能化的银纳米粒子的紫外可见吸收光谱图，其在398nm处有一尖锐的吸收峰；b为向苯硼酸功能化的银纳米粒子加入浓度为107cfuml-1的大肠杆菌后的紫外可见吸收光谱图，其在398nm处的吸光度略有下降，但没有其他峰出现；c为向苯硼酸功能化的银纳米粒子溶液中加入巯基苯硼酸后的紫外可见吸收光谱图，与a相比，c在398nm处的吸光度明显降低，且有一定的红移，同时，其在550nm左右出现了一较宽的吸收峰，这是由于巯基苯硼酸加入后，使得苯硼酸功能化的银纳米粒子发生了迅速大量聚集的现象；d为向加入了大肠杆菌后的苯硼酸功能化的银纳米粒子溶液中加入巯基苯硼酸后的紫外可见吸收光谱图，与b相比，d在398nm处的吸光度略有下降，但远小于c的降低幅度，同时其在500nm左右出现了一吸收峰，这都表明其溶液中的苯硼酸功能化的银纳米粒子的聚集程度要小于不加入大肠杆菌的溶液，这进一步证明细菌的加入可抑制巯基苯硼酸所造成的苯硼酸功能化的银纳米粒子的聚集。
实施例2
基于紫外可见吸光光谱对大肠杆菌的检测
向1ml苯硼酸功能化的银纳米粒子中，加入100μl大肠杆菌，反应10min后，加入10μl300μm的巯基苯硼酸，反应1min后，利用紫外可见分光光度计对其在300nm-700nm的范围内进行波谱扫描(参见图2)，由图2可见随着大肠杆菌浓度的增加，其在398nm处的最大吸光度值逐渐增加。其吸光度值与大肠杆菌浓度的对数值在5×104cfuml-1到1×107cfuml-1的浓度范围内呈线性关系(参见图3)。
实施例3
大肠杆菌的肉眼检测
向1ml苯硼酸功能化的银纳米粒子中，加入100μl大肠杆菌，反应10min后，加入10μl3mm的巯基苯硼酸，反应1min后，观察溶液颜色(参见图4)。由图4所示，随着大肠杆菌浓度的减小，其颜色呈现出由淡黄色向浅红色的变化趋势。其可由肉眼分辨的最低检测限为5×105cfuml-1。
实施例4
硫酸盐还原菌的肉眼检测
向1ml苯硼酸功能化的银纳米粒子中，加入100μl硫酸盐还原菌，反应30min后，加入20μl300μm的巯基苯硼酸，反应1min后，观察溶液颜色(参见图5)。由图5所示，随着大肠杆菌浓度的减小，其颜色呈现出由淡黄色向棕黄色的变化趋势。其可由肉眼分辨的最低检测限为1×104cfuml-1。