本发明涉及一种化学发光检测试剂盒及其检测方法，特别是检测牛奶中黄体酮残留量的磁免疫化学发光检测试剂盒，属于免疫学检测领域。
背景技术：
：黄体酮(progesterone)，又名孕酮，是由卵巢黄体分泌的一种天然孕激素，在体内对雌激素激发过的子宫内膜有显著形态学影响，为维持妊娠所必需，生理效应及临床治疗作用广泛，应用历史悠久。孕酮具有促进雌性动物性器官成熟及第二性征出现的作用，并维持生殖功能，孕激素往往在雌激素作用基础上产生效用，以喂养奶牛为例，孕激素可以增强食欲、提高饲料转化率和提高牛奶产量，因此孕激素可以产生显著的经济效益，对畜牧业生产者有很大的吸引力。但国际上已公认，孕酮在食品中的残留有可能增加人类乳腺癌、卵巢癌以及子宫内膜癌发病率，所以奶制品中黄体酮的检测显得尤为重要。目前，激素类物质常用的测定方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法，由于以上诸分析法样品前处理比较复杂，操作时需专门的技术人员、检测费用昂贵，不利于推广应用，因此亟需便携、高灵敏度的快速检测产品的出现。免疫检测方法是以抗原、抗体的特异性反应为基本原理建立起来的快速分析方法，由于抗原、抗体的结合具有高选择性和灵敏性，使得这一技术在药物残留检测领域得到广泛的应用。目前，最常用的免疫检测方法包括酶联免疫检测法和胶体金免疫层析检测法，但由于灵敏度较低，假阴性率和假阳性率较高，逐渐被灵敏度高、准确度高、检测时间短的化学发光免疫检测方法所替代。磁免疫化学发光检测试剂配套磁免疫化学发光检测仪检测动物源性产品中黄体酮的残留，实现检测过程的全自动化，减少人为操作误差，灵敏度高，准确度高，检测成本低，适用于大批量样品中黄体酮残留量的筛查。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种黄体酮检测试剂盒，采用该试剂盒进行黄体酮残留量检测时，具有较高的灵敏度、特异性和准确度。本发明的另一个目的在于提供一种检测黄体酮的方法，采用试剂盒配套化学发光检测仪进行黄体酮残留量检测时，不仅具有较高的灵敏度、特异性和准确度，而且实现了全自动化检测，缩短检测时间，减少人为操作误差。本发明试剂盒，它包括：酶标抗原、酶标抗原稀释液、磁标抗体、磁标抗体稀释液、黄体酮系列标准品溶液、化学发光底物a液、化学发光底物b液、复溶液、洗涤液。所述酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的黄体酮半抗原，所述磁标抗体是免疫磁珠标记的黄体酮单克隆抗体，所述黄体酮单克隆抗体是由黄体酮半抗原与牛血清白蛋白偶联得到的偶联物作为免疫原免疫动物制备获得；所述黄体酮半抗原是16,17-环氧黄体酮与巯基丙酸反应得到，其分子结构式为：所述免疫磁珠表面含有—oh、—cooh或—nh2活性基团。所述化学发光底物a液为含有鲁米诺和对甲苯酚的三羟甲基氨基甲烷溶液，化学发光底物b液为含有柠檬酸、无水na2hpo4和co(nh2)2·h2o2的水溶液。所述黄体酮系列标准品溶液浓度分别为0μg/l、0.1μg/l、0.3μg/l、0.9μg/l、2.7μg/l、8.1μg/l。所述酶标抗原稀释液是ph7.2～7.6、na3po4浓度为0.01mol/l、nacl浓度为0.25mol/l的缓冲溶液。所述磁标抗体稀释液是ph7.2～7.6、na3po4浓度为0.01mol/l、nacl浓度为0.25mol/l的缓冲溶液。所述复溶液是ph7.0、0.1mol/l的磷酸盐缓冲液。所述洗涤液是ph7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液。所述试剂盒配套化学发光检测仪检测牛奶中黄体酮的残留量。本发明还提供一种利用上述试剂盒配套化学发光检测仪检测黄体酮残留量的方法，包括下列步骤：1)将酶标抗原与酶标抗原稀释液按照1:10～1:20的体积比进行稀释，装入化学发光检测仪酶标抗原工作液容器中；2)将磁标抗体与磁标抗体稀释液按照1:10～1:20的体积比进行稀释，装入化学发光检测仪磁标抗体工作液容器中；3)化学发光检测仪分别吸取30～60μl酶标抗原工作液、30～60μl待测样品液和30～60μl磁标抗体工作液，依次加入到反应杯存储装置中，室温下反应15min，再通过清洗装置进行磁分离2～4min，弃上清液后用洗涤液300～500μl对复合物沉淀清洗3～5次；4)将分离好的复合物放入测量暗箱，加入化学发光底物a液和化学发光底物b液各50μl，检测发出的相对光强度，样品中黄体酮的含量与相对光强度成负相关关系，通过相对光强度标准曲线计算黄体酮的残留量。本发明中分析测试方法所用的化学发光检测仪包括电源电路、反应杯存储装置、样品存储装置、样品臂、试剂存储装置、试剂臂、运动式冷藏装置、清洗装置、自动注射泵、微光检测器，同时还配置有计算机与中文界面的windows控制软件，可进行资料录入、结果汇总、质量控制、结果存储和结果查询等功能，可完成多种分析模式的编程，定量或定性报告结果，自动生成并储存和更新功能，两点自动修正标准曲线。本发明的有益效果如下：1)本发明试剂盒具有较高的灵敏度和特异性，对黄体酮的检测灵敏度可达到0.1μg/l。2)本发明试剂盒配套化学发光检测仪对样品中黄体酮残留量进行检测，实现检测过程的全自动化，减少人为操作误差，检测时间短，仅需20min即可完成对样品中黄体酮残留量的检测。附图说明图1：黄体酮半抗原合成路线图图2：磁免疫化学发光检测试剂盒标准曲线图具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。实施例1：黄体酮磁免疫化学发光检测试剂盒具体组分的制备1.黄体酮半抗原的合成(合成路线见附图1)取16,17-环氧黄体酮0.5g，加甲醇溶解，加冰乙酸0.3ml，充分搅拌后，加入巯基丙酸0.32g，回流反应12h，停止反应，旋蒸蒸干，加乙酸乙酯、水，充分震荡，萃取，无水硫酸钠干燥蒸干，上硅胶柱，正己烷/乙酸乙酯(v/v，3/1)洗脱分离，得到巯基丙酸黄体酮半抗原产物0.59g，收率89.9％。2.酶标抗原的制备取15mg巯基丙酸黄体酮半抗原，加n,n-二甲基甲酰胺300μl溶解，加碳化二亚胺(edc)11mg，加n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)8mg，室温搅拌3h，得到a液；取辣根过氧化物酶100mg，加0.1mol/l磷酸盐缓冲液8ml溶解，得到b液；将a液缓慢滴加到b液中，室温搅拌5h，0.02mol/lpb缓冲液透析纯化，得到酶标抗原，-20℃保存备用。3.免疫原的制备取32mg巯基丙酸黄体酮半抗原，加n,n-二甲基甲酰胺500μl溶解，加氯甲酸异丁酯20μl，混匀，加三乙胺30μl，搅拌反应2h，得到半抗原活化液a液；取牛血清白蛋白100mg，加0.9％的生理盐水溶解，得到b液；将a液缓慢滴加到b液中，室温搅拌4h，0.02mol/lpb缓冲液透析纯化，得到免疫原，-20℃保存备用。4.黄体酮单克隆抗体的制备(1)杂交瘤细胞的获得1)首次免疫：将黄体酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物(免疫原)与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的balb/c小鼠，每只0.2ml；2)加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；3)最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时进行如下末次免疫：腹腔注射不加任何佐剂的免疫原溶液0.1ml，三天后处死小鼠，取其脾脏与骨髓瘤细胞融合；4)采用间接酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌黄体酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株，取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。(2)单克隆抗体的制备1)细胞复苏：取出黄体酮单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；2)制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯度经sds-page电泳鉴定，小瓶分装，-20℃保存。5.磁标抗体的制备该过程以粒径2.8μm的羧基磁珠为载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂edc-nhs组合处理后，活化磁珠可与黄体酮单克隆抗体进行偶联，具体步骤如下：(1)清洗：取100μl羧基磁珠(购于dynal，粒径为2.8μm，含量是0.15eq/g)于离心管中，用100μl含0.05％吐温-20的ph5.0、25mmol/l的mes溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；(2)活化：用4℃贮存的ph5.0、25mmol/lmes溶液分别配制50mmol/l的edc、nhs溶液；分别加入50μl新配制的edc和nhs溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min，磁分离后移除上清，同(1)mes溶液洗涤2-3次；(3)偶联：将黄体酮单克隆抗体溶解到60μlph5.0、25mmol/lmes溶液中，用所述mes溶液调节总体积至100μl，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4℃偶联2h，期间使磁珠保持混匀状态；(4)封闭：磁分离后移除上清，加入100μlph7.4的tris溶液反应15min封闭磁珠；(5)保存：磁分离后移除上清，用100μl含0.1％-0.3％bsa、0.1％吐温-20的tris溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0.1％-0.5％bsa、0.01％-0.1％吐温-20、0.02％nan3的tris溶液中(浓度为10mg/ml)，2-8℃保存备用。实施例2：黄体酮磁免疫化学发光检测试剂盒的组建组建黄体酮磁免疫化学发光检测试剂盒，使其包含下述组分：(1)辣根过氧化物酶标记的黄体酮半抗原；(2)酶标抗原稀释液为ph7.2～7.6、na3po4浓度为0.01mol/l、nacl浓度为0.25mol/l的缓冲溶液；(3)免疫磁珠标记的黄体酮单克隆抗体；(4)磁标抗体稀释液为ph7.2～7.6、na3po4浓度为0.01mol/l、nacl浓度为0.25mol/l的缓冲溶液；(5)黄体酮系列标准品溶液浓度分别为0μg/l、0.1μg/l、0.3μg/l、0.9μg/l、2.7μg/l、8.1μg/l；(6)化学发光底物a液为含有鲁米诺和对甲苯酚的三羟甲基氨基甲烷溶液，化学发光底物b液为含有柠檬酸、无水na2hpo4和co(nh2)2·h2o2的水溶液；(7)复溶液为ph7.0、0.1mol/l的磷酸盐缓冲液；(8)洗涤液为ph7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液。实施例3：样品中黄体酮残留量的检测1.样品前处理取1ml牛奶样品至2ml聚苯乙烯离心管中，4500g室温(20-25℃/68-77℉)离心10min，除去上层油脂膜，取中间层50μl至2ml聚苯乙烯离心管中，加入950μl复溶液，涡动混匀，取50μl用于分析。2.用试剂盒检测将酶标抗原与酶标抗原稀释液按照1:10～1:20的体积比进行稀释，装入化学发光检测仪酶标抗原工作液容器中；将磁标抗体与磁标抗体稀释液按照1:10～1:20的体积比进行稀释，装入化学发光检测仪磁标抗体工作液容器中；对每个样品/标准品设置样品架上的位置，输入样品信息和需要检测的测试项目名称；将样品管/标准品管放入已设定好的样品架上，化学发光检测仪依次吸取50μl酶标抗原工作液、50μl待测样品/标准品和50μl磁标抗体工作液加入到反应杯存储装置中，混匀，室温下反应15min，再通过清洗装置进行磁分离4min，弃上清液后用洗涤液对复合物沉淀清洗3～5次，再加入化学发光底物a液和化学发光底物b液各50μl，检测其发出的相对光强度(rlu)，样品中黄体酮的含量与rlu成负相关关系，可以通过rlu结合标准曲线法计算黄体酮的残留量。3.检测结果分析用所获得的每个浓度的标准品溶液的rlu平均值(rlu)除以第一个标准品溶液(0标准)的rlu值(rlu0)再乘以100％，得到相对发光强度(％)。以黄体酮标准品浓度(μg/l)的对数值为横坐标，相对发光强度为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示。用同样的办法计算样品溶液的相对发光强度，相对应每一个样品的黄体酮含量则可从标准曲线上读出。实施例4：黄体酮磁免疫化学发光检测试剂盒的质量评价1.检测限对空白牛奶样品20份进行检测，从标准曲线上查出对应于各相对发光强度的浓度，以20份样品浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对牛奶样品的检测限为2μg/l。2.样品精密度和准确度试验以回收率作为准确度评价指标，以重复测定某一浓度样品的检测结果相对标准偏差(rsd％)作为精密度评价指标。计算公式为：回收率(％)＝实际测定值/理论值×100％，其中理论值为样品的添加浓度；相对标准偏差rsd％＝sd/x×100％，其中sd为标准偏差，x为测定数据的平均值。按2μg/l、4μg/l、8μg/l三个浓度黄体酮对空白牛奶样品进行添加回收测定，每个样品做4个平行，用三批不同试剂盒进行测定，计算样品平均回收率及精密度，结果见表1。表1精密度及准确度试验以2、4、8μg/l三个浓度的黄体酮对空白牛奶样品进行添加，平均回收率在80％～120％；批内、批间相对标准偏差均小于10％。3.特异性试验选择其他雌激素进行测定，通过各种物质的标准曲线分别得到其50％抑制浓度，用下式计算试剂盒对其它物质的交叉反应率，结果见表2。表2交叉反应率试验药物名称ic50(μg/l)交叉反应率(％)黄体酮0.449100炔诺酮7.8765.717-α-羟孕酮＞10＜5甲羟孕酮＞10＜5醋酸甲羟孕酮＞10＜5甲地孕酮＞10＜5醋酸甲地孕酮＞10＜5雌二醇＞10＜5炔雌醇＞10＜5苯甲酸雌二醇＞10＜5雌三醇＞10＜54.稳定性试验试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大rlu值(零标准)、50％抑制浓度、黄体酮添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻7天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少保存12个月以上。当前第1页12