本发明属于抗生素的检测领域，尤其涉及一种动物源性食品中多种糖肽类抗生素的同时检测方法。
背景技术：
：我国是抗生素的生产和使用大国，临床上抗生素的不合理使用，水环境中抗生素污染和食品中抗生素的残留导致许多致病菌产生了耐药性。耐药菌的增加一方面造成常用抗生素的进一步滥用，另一方面也从临床上对抗生素产品提出了更高的要求。由于青霉素和头孢菌素类抗生素的上市使用，糖肽类抗生素作为保留药物，在临床上通常被用作经β-内酰胺内抗生素或其他抗菌药物治疗失败后才使用的最后手段；被认为是抗菌药物的最后一道防线，成为顽固性耐药细菌感染危重病人的救命药物。但是随着糖肽类抗生素的广泛使用，已经出现了糖肽类抗生素耐药的金黄色葡萄球菌种，使人类的生命健康又受到了严重的威胁。寻找新型抗生素来攻克耐药细菌的任务变得十分紧迫，但合理使用抗生素、避免临床滥用和被动暴露仍是杀灭感染，控制疾病的最根本途径。食品中抗生素的分离与检测将为流行病学评价特定人群对其暴露程度提供理论和数据依据。尽管分析测试平台在分离技术，高灵敏度、高分辨率的新型质谱仪及后期高通量组学数据处理都有了长足的发展,然而准确测定各种复杂介质中痕量抗生素对样品的前处理和检测方法都提出了很高的要求。固相萃取由于具有较高的富集因子、较少的试剂消耗、易于实现自动化及无相分离操作等优点，已成为最为常用的样品前处理方法。如何选择高效的样品前处理方法已越来越成为其分析鉴定的关键步骤。近年来，国内外有不少对糖肽类抗生素的高效液相色谱质谱检测的研究。但是，大部分的研究只限于对某一种，特别是替考拉宁的检测，而且针对的是体液(血液)样品，针对动物源性食品猪肉，也只有万古霉素，去甲万古霉素和替考拉宁的检测。对动物源性食品中万古霉素，替考拉宁，特拉万星，达巴万星，奥利万星的同时检测研究，目前并没有报道过。技术实现要素：针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种动物源性食品中多种糖肽类抗生素的同时检测方法。一种动物源性食品中多种糖肽类抗生素的同时检测方法，主要包括以下步骤：(1)对动物源性食品样品进行液相萃取；(2)对步骤(1)得到的提取液进行富集净化：采用hlb和mcx固相萃取柱串联净化富集，经洗脱后，将洗脱液吹干，复溶于0.2％甲酸水溶液中；(3)将步骤(2)所得溶液经反相色谱柱在柱温为在40℃、流速为0.3ml/min，采用0.1％甲酸水与甲醇进行梯度洗脱；再采用超高效液相色谱串联质谱联用仪多反应监测模式下在优化的色谱和质谱分析条件下进行检测；(4)定性和定量分析：用样品溶液中出现的色谱峰保留时间和母离子/子离子对进行定性分析；制作多种糖肽类抗生素的标准曲线，用外标法分别对样品溶液中多种糖肽类抗生素的含量进行定量计算。进一步的，所述多种糖肽类抗生素包括特拉万星、替考拉宁、奥利万星、达巴万星、万古霉素中的一种或者多种。进一步的，步骤(1)中对样品进行液相萃取主要包括：称取动物源性食品样品置于离心管中，加入0.1mol/ledta-mcllvaine缓冲溶液旋涡混合，于振荡器上提取15min，再加入甲醇沉淀蛋白10min,在用冷冻离心机在温度低于5℃的条件下离心5min，取上清液，用快速滤纸过滤。温度低于5℃使蛋白沉淀更完全、更有效。进一步的，步骤(2)中所述串联萃取包括：用转接头将hlb固相萃取柱和mcx固相萃取柱串联起来，用甲醇活化、水平衡；将步骤(1)所得提取液以2～3ml/min的速度过柱，弃去滤液，用5％v/v甲醇水溶液淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干，再用甲醇和含10％v/v氨水甲醇溶液洗脱并收集洗脱液。进一步的，所述hlb固相萃取柱和mcx固相萃取柱的重量比和体积比均为1:1。进一步的，所述动物性食品包括牛奶、鸡蛋和鸡肉。进一步的，步骤(3)中梯度洗脱为：0-1.5min时0.1％甲酸水与甲醇含量比为95:5，1.5-2.5min时0.1％甲酸水与甲醇含量比为70:30，2.5-5.0min时0.1％甲酸水与甲醇含量比为30:70，5.5-6.0min时0.1％甲酸水与甲醇含量比为95:5。进一步的，步骤(3)中优化的色谱和质谱条件的选择的具体方法为：用多种糖肽类抗生素的标准溶液进行子离子扫描，在多种糖肽类抗生素的碎片离子中选择响应较好的两组离子对作为定性离子对，选择其中响应较好的一组作为定量离子对，优化各离子对的碎裂电压和碰撞能量以得到最佳的相应值。进一步的，步骤(4)所述外标法进行定量计算主要包括：取阴性基质样品进行加标，制备混合标准溶液，经步骤(1)-(3)的样品前处理，在步骤(3)所述优化的色谱和质谱分析条件下测糖肽类抗生素的线性方程、线性范围、相关系数。进一步的，所述多种糖肽类抗生素浓度检测范围为1.0μg/kg到20.0μg/kg。与现有技术相比，采用hlb固相萃取柱和强阳离子(mcx)固相萃取柱串联净化富集，来进行同步分离富集，比单筒法提高了分析物的回收率；反相色谱柱进行分离后采用超高效液相色谱串联质谱联用仪对牛奶，鸡蛋、鸡肉样品中五种糖肽类抗生素进行同时检测。本发明的检测方法灵敏准确快速，在六分钟内同时五糖肽类抗生素进行定性和定量分析。本发明的检测方法对其他糖肽类抗生素的检测也具有一定的参考价值。附图说明图1本发明的五种糖肽类抗生素的化学结构；图2采用hlb和mcx固相萃取柱串联净化富集的示意图；图3五种糖肽类抗生素的子离子谱，(a)万古霉素，(b)替考拉宁，(c)特拉万星，(d)达巴万星和(e)奥利万星；图4采用不同固相萃取柱hlb、c18、mcx、wcx、max和wax对糖肽类抗生素进行分离的比较；图5采用hlb和mcx固相萃取柱串联时添加浓度为10μg/kg的糖肽类抗生素的回收率；图6采用实施例1的方法检测样品的uhplc-ms/ms色谱。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。实施例1一种动物源性食品中五种糖肽类抗生素的同时检测方法，其中五种糖肽类抗生素特拉万星telavacin，替考拉宁teicoplanin，奥利万星oritavancin，达巴万星dalbavacin，万古霉素vancomycin的结构示意图如图1所示，主要包括以下步骤：称取均质试样5g，置于50ml聚丙烯离心管中，加入20ml0.1mol/ledta-mcllvaine缓冲溶液，1000r/min旋涡混合1min，于振荡器上提取15min，再加入10ml甲醇沉淀蛋白10min，再用冷冻离心机于10000r/min离心5min(温度低于5℃)，取上清液，用快速滤纸过滤，待净化。用转接头将hlb固相萃取柱(60mg，3ml)，mcx固相萃取柱(60mg,3ml)串联起来，使用时用3ml甲醇活化、3ml水平衡。如图2所示，将提取溶液以2～3ml/min的速度过柱，弃去滤液，用1ml5％(v/v)甲醇水溶液淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干，再用6ml甲醇和6ml含10％(v/v)氨水甲醇溶液洗脱并收集洗脱液。洗脱液于4℃水浴下用氮气吹干，用1ml0.2％甲酸水溶解，1000r/min漩涡混合1min，用于上机测定。超高效液相色谱串联质谱分析：采用沃特世公司acquityi-classsystem超高效液相色谱，100mm×2.1mmi.d.，1.7μm(粒径)acquitybeh-c18analyticalcolumn超高效液相色谱柱，柱温设定在40℃。色谱分析条件如表1所示：表1色谱分析条件时间(分钟)流速0.1％甲酸水(％)甲醇(％)0.00.39551.00.39551.50.370302.50.330705.00.330705.50.39556.00.3955沃特世公司三重四级杆质谱仪xevotq-striplequadrupolemassspectrometer。进行自动调谐在上述质谱分析条件下用各组分的标准溶液进行子离子扫描，在各组分的碎片离子中选择响应较好的两组离子对作为定性离子对，选择其中响应较好的一组作为定量离子对，优化各离子对的碎裂电压和碰撞能量以得到最佳的相应值。在上述优化的色谱和质谱分析条件下，5种糖肽类抗生素的定性离子对、定量离子对、碎裂电压、碰撞能量和保留时间如表2所示。由于灵敏度高、可靠性好、易于操作和维护，选择正电荷电喷雾离子化探针作为电离技术，得到的子离子谱如图3所示。表2五种糖肽类抗生素的定性离子对、定量离子对、锥孔电压和保留时间(碰撞能量在括号内)制作各组分的标准曲线，用外标法进行定量计算取阴性基质样品进行加标，制备混合标准溶液，经上述样品前处理步骤操作，在上述色谱分离和质谱分析条件下测定五种糖肽类抗生素的线性方程、线性范围、相关系数，其结果如表3所示。从表3可以得知组分的浓度在线性范围为x1.0μg/kg到20.0μg/kg。再将浓度降低就会导致质谱信号的减弱，难以得到稳定性比较好的峰，从而是定性定量不准。将浓度线性上限提高的话会导致离子抑制，线性相关性变差。对于高浓度点可以将其稀释进行测试。一般液质不建议直接上样高浓度，容易造成残留。当样品中测得组分的浓度在线性范围之内时，按照线性方程计算样品浓度；当样品中测得组分的浓度在线性范围之外时，将样品稀释至线性范围以内再按照线性方程计算样品浓度。得到的uhplc-ms/ms色谱图如图6所示。表3.方程的回归曲线的相关系数，校准，对糖肽类抗生素的方法检测限和定量限.将试样中的五种糖肽类抗生素特拉万星telavacin，替考拉宁teicoplanin，奥利万星oritavancin、达巴万星dalbavacin，万古霉素vancomycin分别制备成2.5、5.0和10.0g/kg三个浓度，然后进行三个浓度的加标回收实验，结果如表4所示，从表4中可以看出回收率在83％-102％，对于ug/kg，这个回收率完全满足要求。浓度为10μg/kg的糖肽类抗生素的回收率如图5所示。表4试样中五种糖肽类抗生素加标回收率本实施例中的分析样品可以为牛奶、鸡蛋和鸡肉。糖肽类抗生素为特拉万星、替考拉宁、奥利万星、达巴万星、万古霉素中的一种或者多种时也可以采用相似的分析方法。实施例2-7单独分别采用固相萃取柱hlb、c18、mcx、wcx、wax、max来代替实施例1中的hlb固相萃取柱和强阳离子(mcx)固相萃取柱串联萃取。得到的分析对比结果如图4所示。以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。当前第1页12