一种电化学生物传感器及其制备方法和用途与流程

本发明涉及酶电化学生物传感器技术领域，尤其是涉及一种二氧化钛纳米管/纳米金/酶电化学生物传感器及其制备方法和用途。

背景技术：

黄曲霉毒素(AFT)是主要由黄曲霉(aspergillus flavus)和寄生曲霉(a.parasiticus)产生的次生代谢产物，广泛存在于粮食中，特别容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品。黄曲霉毒素主要有B1、B2、G1、G2等类型，其中以B1的毒性最强。黄曲霉毒素B1的极性毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，慢性毒性可诱发癌变，是一种人类肝癌的潜在致病源，致癌能力为二甲基亚硝胺的75倍，比二甲基偶氨苯高900倍。

检测黄曲霉毒素B1的传统分析方法，如薄层层析法、液相色谱法、酶联免疫法等已被广泛应用，虽然这些方法的对黄曲霉毒素的检测较为灵敏、可靠，但是存在仪器价格昂贵、检测耗时长或需要复杂的预处理步骤等缺点,为黄曲霉毒素的检测带来了不便之处。因此，发展快速、灵敏、高效的黄曲霉毒素B1检测方法具有重要意义。

近年来，纳米材料应用在黄曲霉毒素B1检测上的研究得到快速的发展。Chaudhuri C R.[Nanoporous Silicon Structures for Toxin Detection,[J].Comsol Com,2014,The Proceedings of 2012,COMSOL Conference in Bangalore]利用纳米多孔硅制备电阻抗传感器检测黄曲霉毒素B1，检测浓度低至100fg/mL。Joseph H.O.Owino[Electrochemical Immunosensor Based on Polythionine/Gold Nanoparticles for the Determination of Aflatoxin B1[J].Sensors,2008,8(12):8262-8274]等利用聚硫瑾/金纳米颗粒制备电化学免疫传感器检测黄曲霉毒素B1，获得良好线性范围为0.6～2.4μg/mL，检测限为0.07μg/mL。

然而，仍然需要发展利用纳米材料的酶电化学生物传感器，以便快速、灵敏、高效地检测黄曲霉毒素。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术中的问题，本发明提供了以下技术方案。

本发明的第一个发明提供一种电化学生物传感器，包括乙酰胆碱酯酶修饰电极，所述乙酰胆碱酯酶修饰电极包括由二氧化钛纳米管和沉积在二氧化钛纳米管表面上的纳米金构成的复合电极、以及通过附着在所述电极表面的壳聚糖-戊二醛混合膜固定在所述复合电极的乙酰胆碱酯酶。

根据本发明的所述电化学生物传感器，其中所述乙酰胆碱酯酶修饰电极通过以下步骤制备：

S310，将所述复合电极浸泡在壳聚糖溶液中，然后干燥，得到表面附有壳聚糖膜的复合电极；

S320，将步骤S310的表面附有壳聚糖膜的复合电极浸泡在戊二醛溶液中，然后干燥，得到表面附有壳聚糖-戊二醛混合膜的复合电极；

S330，在步骤S320的表面附有壳聚糖-戊二醛混合膜的复合电极上滴加乙酰胆碱酯酶溶液，然后干燥，得到所述乙酰胆碱酯酶修饰电极。

根据本发明的所述电化学生物传感器，其中所述复合电极通过以下步骤制备：

S210，以钛片为阳极、铝片为阴极、0.2～1.0wt％氟化铵-丙三醇溶液为电解质，在15～30V，优选20V，电压下进行阳极氧化1～3h，优选2h，然后用超纯水清洗干净，500℃高温退火1h，得到二氧化钛纳米管；

S220，以步骤S210的二氧化钛纳米管为工作电极、Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极对电极，电解液为0.05～0.2mM的AuClH4·4H2O，在恒电位下在二氧化钛纳米管表面沉积纳米金,得到所述复合电极。

本发明的第二个方面提供一种制备所述电化学生物传感器的方法，包括：

S310，将所述复合电极浸泡在壳聚糖溶液中，然后干燥，得到表面附有壳聚糖膜的复合电极；

S320，将步骤S310的表面附有壳聚糖膜的复合电极浸泡在戊二醛溶液中，然后干燥，得到表面附有壳聚糖-戊二醛混合膜的复合电极；

S330，在步骤S320的表面附有壳聚糖-戊二醛混合膜的复合电极上滴加乙酰胆碱酯酶溶液，然后干燥，得到所述乙酰胆碱酯酶修饰电极。

根据本发明的所述制备方法，包括：

S210，以钛片为阳极、铝片为阴极、0.2～1.0wt％氟化铵-丙三醇溶液为电解质，在15～30V，优选20V，电压下进行阳极氧化1～3h，优选2h，然后用超纯水清洗干净，500℃高温退火1h，得到二氧化钛纳米管；

S220，以步骤S210的二氧化钛纳米管为工作电极、Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极对电极，电解液为0.05～0.2mM的AuClH4·4H2O，在恒电位下在二氧化钛纳米管表面沉积纳米金,得到所述复合电极。

本发明的第三个方面提供一种检测黄曲霉毒素B1浓度的方法，包括将根据权利要求1-3中任一项的所述电化学生物传感器与黄曲霉毒素B1接触。

根据本发明的所述检测黄曲霉毒素B1浓度的方法，其中将含有黄曲霉毒素B1的溶液滴加至所述电化学生物传感器的乙酰胆碱酯酶修饰电极的表面，然后放入含有氯化乙酰硫代胆碱的缓冲液中，在紫外光照射下，利用三电极体系测量通过乙酰胆碱酯酶修饰电极的电流值。

根据本发明的所述检测黄曲霉毒素B1浓度的方法，其中所述三电极体系包括以乙酰胆碱酯酶修饰电极为工作电极、Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极对电极。

根据本发明的所述检测黄曲霉毒素B1浓度的方法，其中采用时间-电流曲线法测量通过乙酰胆碱酯酶修饰电极的电流值。

本发明有益的技术发明效果在于：

本文采用阳极氧化法制备了二氧化钛纳米管，通过高温退火改变二氧化钛的晶型(锐钛矿型)，通过恒电位沉积法将纳米金沉积到二氧化钛纳米管表面，再将乙酰胆碱酯酶化学键合到二氧化钛纳米管表面，构建了检测黄曲霉毒素B1的二氧化钛纳米管/纳米金/酶电化学生物传感器，并将其用于黄曲霉毒素B1的检测。检测的线性范围为1～6nM，相关系数为0.988，检出限为0.33nM。本发明的二氧化钛纳米管/纳米金/酶电化学生物传感器具有制备简单，灵敏度高，操作简便等优点，为黄曲霉毒素B1的检测提供了一种颇具前景的技术。

附图说明

图1是本发明生物传感器的制备方法和检测方法的技术路线示意图；

图2是二氧化钛纳米管分别在氧化、退火和固定乙酰胆碱酯酶后的X射线衍射(XRD)图谱；

图3是二氧化钛纳米管和二氧化钛纳米管-纳米金复合电极的扫描电子显微镜(SEM)图；

图4是纳米金对二氧化钛纳米管光催化效应的影响(a：二氧化钛纳米管在0.1mM AuHCl4·4H2O中对不同沉积时间的时间-电流曲线,电位：0V；b：峰电流曲线)；

图5是不同浓度黄曲霉毒素B1的检测结果(a：生物传感器在0.1M的PBS溶液(c(ATCl)＝0.1mM，pH＝7.4)中对不同浓度黄曲霉毒素B1标准溶液的时间-电流曲线，电位：0V；b：不同浓度黄曲霉毒素B1标准溶液的标准曲线)。

具体实施方式

在下面描述和图解本发明的示例性实施方案。为了清楚和准确，下面讨论的所述示例性实施方案可以包括优选的步骤、方法和特征，本领域普通技术人员将可以认识到，这些优选的步骤、方法和特征不是落在本发明范围内的必要条件。

在下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。在下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：生物传感器的制备

1、二氧化钛纳米管的制备

通过阳极氧化法制备二氧化钛纳米管，其具体步骤如下：将钛片(武汉高仕睿联科技有限公司)分别用丙酮、甲醇、超纯水超声10min后，用氮气吹干。以钛片为阳极、铝片(武汉高仕睿联科技有限公司)为阴极、0.5wt％氟化铵-丙三醇溶液为电解质，在20V电压下进行阳极氧化2h，然后用超纯水清洗干净，500℃高温退火1h(上升温度为1℃/min)。

2、复合电极的制备

通过电化学工作站(CHI660E电化学工作站，上海辰华仪器有限公司)，采用三电极体系，以上述二氧化钛纳米管为工作电极、Ag/AgCl电极(上海辰华仪器有限公司)为参比电极，Pt电极(上海辰华仪器有限公司)对电极，电解液为0.1mM AuClH4·4H2O，进行恒电位沉积5min(初始电位为0.1V),即得到二氧化钛纳米管-纳米金复合电极。

3、修饰电极的制备

将上述复合电极浸泡在5％壳聚糖(CS，广州齐云生物科技有限公司)溶液中过夜，然后置于室温中干燥，再浸泡在5％戊二醛(GAD，国药集团化学试剂有限公司)溶液中过夜，室温中干燥后滴加10μL的乙酰胆碱酯酶(AChE，广州齐云生物科技有限公司，500U/mL)，放置于冰箱(4℃)干燥器内干燥，即得到乙酰胆碱酯酶修饰电极。

图2是二氧化钛纳米管分别在氧化、退火和固定乙酰胆碱酯酶后的X射线衍射(XRD)图谱，从图中可以看出退火和固定乙酰胆碱酯酶后的二氧化钛纳米管在2θ＝25.3°、38.4°左右分别有一个较为明显的衍射峰，它们为锐钛矿型二氧化钛的(101、112)特征衍射峰，峰形窄且尖锐，表明二氧化钛纳米管的结晶度较好。

图3是二氧化钛纳米管和二氧化钛纳米管-纳米金复合电极的扫描电子显微镜(SEM)图。(a)是二氧化钛纳米管放大20000倍的SEM图，(b)是二氧化钛纳米管放大100000倍的SEM图。由此可见，二氧化钛纳米管呈高度自序的多孔管状结构，管口较为规则平滑。(c)是二氧化钛纳米管-纳米金复合电极放大20000倍的SEM图，(d)是二氧化钛纳米管-纳米金复合电极放大100000倍的SEM图。图(d)可清晰看到纳米金均匀地沉积在二氧化钛纳米管表面管内。

实施例2-6

参照实施例1，采用基本相同的方法制备了二氧化钛纳米管-纳米金复合电极，除了在复合电极的制备过程中分别采用了不同的沉积时间(0、1、2、3、4、6min)。

图4为实施例1-6中在不同沉积时间(0、1、2、3、4、5、6min)制备的复合电极的光电流的变化情况。可以看到，随着沉积时间的增加，光电流先增加后减小，其增加的速率也越来越小，沉积5min时光电流最大。

实施例7：溶液中黄曲霉毒素B1的检测

1、检测原理

乙酰胆碱酯酶催化氯化乙酰硫代胆碱生成含巯基的氯化胆碱，二氧化钛纳米管在紫外灯照射下形成电子-空穴对的氧化还原体系，巯基易被其氧化，从而使光电流响应增大。而黄曲霉毒素B1对乙酰胆碱酯酶具有强烈的抑制作用，通过改变乙酰胆碱酯酶的作用位点进行不可逆的非竞争性抑制。

反应式如下：

2、检测方法

分别滴加100uL不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液至上述乙酰胆碱酯酶修饰电极表面，静置5min，吸出电极表面残留的黄曲霉毒素B1标准溶液并用水轻轻清洗电极表面，然后置于0.1M的PBS溶液(其中，氯化乙酰硫代胆碱(ATCl，广州齐云生物科技有限公司)的浓度为0.1mM，pH＝7.4)中，用时间-电流(i-t)曲线测出其峰电流值(电位为0V)。

图5中，(a)为时间-电流曲线图，表明了未滴加黄曲霉毒素B1的生物传感器所产生的电流信号最大，但随着黄曲霉毒素B1标准溶液浓度的增加，生物传感器的电流信号逐渐减小。从图5的(b)可以观察到，随着黄曲霉毒素B1标准溶液浓度的增加，生物传感器的峰电流明显下降。峰电流下降主要是黄曲霉毒素B1对AChE是非竞争性抑制，通过改变AChE与ATCl的作用位点而使二者不能正常结合，产生的胆碱数量减少，从而导致巯基的减少引起的。检测的线性范围为1～6nM，相关系数为0.988，检出限为0.33nM。

在本发明中，利用二氧化钛纳米管电极作为基底电极，在其表面沉积纳米金形成复合电极，在复合电极上形成壳聚糖-戊二醛(CS-GAD)混合膜，然后将AChE固定在CS-GAD混合膜得到修饰电极，构建了用于检测黄曲霉毒素B1的电化学生物传感器。CS-GAD复合膜能保持壳聚糖良好的生物相容性和乙酰胆碱酯酶的活性，当CS-GAD复合膜作为载体对黄曲霉素B1进行检测时，既能保持生物传感器的稳定性，又能提高检测的灵敏度。将不同浓度的黄曲霉毒素B1滴加至乙酰胆碱酯酶修饰电极的表面5min后，采用时间-电流曲线法，进行电化学检测，通过建立不同浓度的黄曲霉毒素B1标准曲线，计算出其检出限。该方法操作简单，检测快速，并且灵敏度高，弥补了传统光谱法和色谱法的样品处理繁琐、仪器价格昂贵等不足。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。