一种亚甲基二氧吡咯戊酮检测试纸条和应用的制作方法

本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一种亚甲基二氧吡咯戊酮检测试纸条和应用。

背景技术：

亚甲基二氧吡咯戊酮(methylenedioxypyrovalerone)，简称mdpv，是当前在欧美兴起的迷幻药，初时人们以其外形如同海盐，故称之为“浴盐”。在本世纪初的欧洲出现mdpv的滥用，当前主要发生在德国、芬兰等一些国家。这种滥用行为可能引发相关社会问题，因而在出现mdpv滥用流行的国家，执法部门将其视为具有一定危险性的药物。最近的主要案例如下：

2012年5月26日美国迈阿密有一名男子尤金怀疑服用此种迷幻药后，犹如“丧尸”般在街上发狂追咬路人，一名流浪汉走避不及，惨被咬脱半边脸皮，遂有人将mdpv称作“丧尸浴盐”。同年香港《文汇报》报道，香港荃湾深夜有“丧尸”出没。一名90后迷幻青年，疑吸食新兴毒品“浴盐”后顿变“丧尸”，如行尸走肉般至荃湾葵盛围一间中学外，遇见学校保安员突发狂袭击，仅隔9分钟再于附近紧咬另一名夜归少女颈部。

mdpv是兴奋剂属性的精神药物，能抑制去甲肾上腺素，在1969年开发时，它是一种不起眼的兴奋剂，但后来却证实此药可导致心理及身体受到严重伤害。

药剂师解释称，服食mdpv后做出类似丧尸咬人行为，是由于mdpv会增加脑部多巴胺及去甲肾上腺素分泌，从而令人兴奋，同时出现幻觉、妄想，还变得孔武有力，最恐怖是令人产生暴力倾向，产生磨牙反应以致“想咬嘢”。

当前部分国家(如英国、丹麦、瑞典、比利时等国)对mdpv进行管制。英国根据《1971年药物滥用法》，将mdpv列为b类药物管理，未经许可的销售、购买和持有均为非法。在英国，非法持有mdpv最高可处5年和/或无限额的罚金；非法生产、运输mdpv可处高于14年和/或无限额的罚金。在澳大利亚，虽然该物质还未列入非法物质之列，但澳大利亚海关和检疫检验局会查扣此类物质。

2007年美国食品药品管理局批准mdpv可以作为实验研究使用的化学物质，但不得用于医疗用途。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种亚甲基二氧吡咯戊酮检测试纸条和应用，可应用于亚甲基二氧吡咯戊酮检测。

所述亚甲基二氧吡咯戊酮结构如下：

本发明提供了一种亚甲基二氧吡咯戊酮抗原，具有式ⅰ所示结构：

其中，pr为大分子蛋白，优选为牛血清白蛋白(bsa)。

本发明提供了上述亚甲基二氧吡咯戊酮抗原的制备方法，包括以下步骤：

式ⅱ所示化合物与脯氨酸进行缩合反应，然后与大分子蛋白质偶联，得到亚甲基二氧吡咯戊酮抗原；

上述偶联是通过脯氨酸的羧基与大分子蛋白进行共价偶联。

本发明将脯氨酸手臂用于胶体金检测亚甲基二氧吡咯戊酮，使得抗原特异性好，灵敏度高。

上述反应的反应路线如下(以pr为bsa为例)：

所述式ⅱ所示化合物可以按照本领域技术人员熟知的方法制备，本发明优选按照以下方法制备：

首先将戊二酸酐和1,3-苯并间二氧杂环戊烯在三氯化铝的催化下进行开环缩合反应，得到化合物2；然后进行溴代，得到化合物3；再加入吡咯烷，在缚酸剂存在下，进行取代反应，得到化合物4，即式ⅱ所示化合物。

其反应方程式如下：

本发明提供了上述亚甲基二氧吡咯戊酮抗原，或上述制备方法制备的亚甲基二氧吡咯戊酮抗原，在制备检测亚甲基二氧吡咯戊酮的胶体金试纸条中的应用。

本发明中，所述检测为痕量检测，其最低检出限(cutoff)为100ng/ml。

基于此，本发明还提供了一种亚甲基二氧吡咯戊酮检测试纸条，其t线位置负载有上述亚甲基二氧吡咯戊酮抗原，或上述制备方法制备的亚甲基二氧吡咯戊酮抗原。

本发明对所述试纸条的构造没有特殊限定，可以为本领域技术人员熟知的构造，在本发明的某些具体实施例中，其为胶体金试纸条，包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸。其中，硝酸纤维素膜上靠近吸水滤纸一端设置有控制线，靠近样品垫一端设置有t线。其结构示意图如图1所示。

本发明还提供了上述检测试纸条在亚甲基二氧吡咯戊酮检测中的应用。

与现有技术相比，本发明提供了一种亚甲基二氧吡咯戊酮抗原，具有式ⅰ所示结构。上述亚甲基二氧吡咯戊酮抗原可应用于胶体金试纸条，用于对亚甲基二氧吡咯戊酮的检测，具有较高的检测灵敏度。

本发明还提供了上述亚甲基二氧吡咯戊酮抗原的制备方法，以1,3-苯并间二氧杂环戊烯为原料合成半抗原，从c原子上接上交联臂再与具有免疫原性的蛋白质偶联，以此来获得具有反应原性和免疫原性的完全抗原。此合成方法简单，所使用的材料和催化剂均为普通产品，具有实用性，适于工业生产并能产生经济价值；同时，不使用氯仿等高毒性溶剂，毒性较低，更具有安全性，适用于胶体金试纸条。

本发明还提供了一种亚甲基二氧吡咯戊酮检测试纸条，其t线位置负载有式ⅰ所示结构的亚甲基二氧吡咯戊酮抗原，用于对亚甲基二氧吡咯戊酮的检测，具有较高的检测灵敏度。

附图说明

图1为本发明实施例制备的胶体金检测试纸条的结构示意图。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的亚甲基二氧吡咯戊酮检测试纸条和应用进行详细描述。

实施例1

一、亚甲基二氧吡咯戊酮抗原的制备

在氩气保护下，向250ml反应瓶中加入6g无水氯化铝，然后加入无水二氯甲烷40ml，搅拌使其溶解。溶解以后加入3.42g戊二酸酐，继续搅拌20min。然后滴加入1.22g1,3-苯并间二氧杂环戊烯(溶解于20ml无水二氯甲烷中)，30min内滴加完成。滴加完成以后，回流过夜。反应完成以后冷却到室温。冷却以后将溶液倒入40ml冰水中，并且加入20ml二氯甲烷和20ml6n盐酸，剧烈摇晃以后静置分层。分层以后留下二氯甲烷相，用1nhcl洗涤二氯甲烷相2次，无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸得到1.9g红色油状物质。过硅胶柱纯化得到1.6g红色油状产物2，收率67.8％。

结构验证如下：

¹³cnmr(dmso)δ:198.467,175.866,150.785,147.274,129.003,120.753,109.746,107.110,100.034,36.897,29.234,27.529；

esim/z＝237(m+1)。

在氩气保护下，分别将1.6g产物2和1.08g溴素溶解于10ml醋酸中。产物2的醋酸溶液置于100ml圆底烧瓶中，然后将溶解有溴素的醋酸溶液缓慢滴加入烧瓶。滴加完毕后室温搅拌2小时。反应完成以后，至于旋转蒸发仪上蒸去醋酸，然后用20ml二氯甲烷溶解粗产物。二氯甲烷溶液依次用20ml饱和碳酸氢钠溶液，20ml水和20ml饱和氯化钠溶液洗涤。然后干燥、蒸干二氯甲烷溶液得到产物3，2.1g(收率98％)。无需进一步纯化直接用于下一步反应。

将2.1g产物3溶解于20ml乙腈中，然后加入1g三乙胺和0.5g吡咯烷。室温反应过夜。反应完成以后浓缩，硅胶柱纯化。得到1.78g产物4，收率89％。

结构验证如下：

¹³cnmr(dmso)δ:195.776，177.112，150.051，146.764，129.043，121.003，108.964，107.545，100.975，75.981，54.729,29.663,21.452；

esim/z＝306(m+1)。

1.78g产物4溶解于20ml二氯甲烷中并且置于100ml圆底烧瓶内，然后加入1.12gedc和1.75g三乙胺，搅拌2小时。然后0.7g脯氨酸溶解于10ml二氯甲烷中，缓慢滴加入圆底烧瓶，30min以上滴加完成。反应2小时后，蒸干溶剂，硅胶柱纯化得到1.8g产物5，收率76.6％。

结构验证如下：

¹³cnmr(dmso)δ:196.532，177.112，175.829，154.336，148.527，131.408，122.778，112.530，109.216，102.775，77.876，67.309，58.234,50.201，30.45625.325；

esim/z＝403(m+1)。

二、产物偶联载体蛋白

1.取60mg产物5溶于2mldmf，浓度为50mg/ml。配置20mg/ml的pbs-bsa蛋白。

2.在2ml×50mg/ml产物5中加入40mgedc，25mgnhs，室温搅拌8h。

3.取步骤1的pbs-bas蛋白溶液30ml，然后滴入活化过的产物5，室温反应过夜得到终产物6。pbs透析3天，测得浓度为17.54mg/ml。

三、抗原在胶体金检测试纸条的应用

用柠檬酸钠还原四氯化金制备直径在20-40nm的胶体金，然后将胶体金标记到抗亚甲基二氧吡咯戊酮的抗体上，用λmax的吸光值(od)来表示金标抗体的浓度；

将金标抗体上样到金标机上，将一定od值的金标抗体均匀地喷于聚酯膜(金标垫)上，喷好后放入37度烘箱烘8h；切成合适的大小，放入装有干燥剂的铝箔袋内，室温存放备用；

将亚甲基二氧吡咯戊酮抗原稀释到合适浓度，用点膜机点到硝酸纤维素膜上相应t线位置，37度烘干12h；

样品垫---玻璃纤维经过缓冲液和表面活性的处理，37度烘干10h备用；

按金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜，吸水纸，大卡组装成胶体金检测试纸卡，结构如图1所示；

配制相应浓度的小分子溶液，加入到样品垫上，5min后读取结果；

产品对亚甲基二氧吡咯戊酮的cutoff值的要求是100ng/ml，并且对于类似物1-苯基-2-吡咯烷戊酮(a-pyrrolidinopentiophenone，α—pvp)需要检出，以判断是否有浴盐类毒品。

由表1、表2可知：产物灵敏度符合qc标准，且热稳定性好，检测抗原合格。

由表3可知：产品特异性好。可以按照需求特异性检出目标产物。

备注1：所有待测小分子均溶于阴性尿液中；

备注2：qc标准：阴性≥g8；-50％﹥g4；+50％﹤g3.5。

表1对亚甲基二氧吡咯戊酮小分子的检测灵敏度结果

表2抗原的加速稳定性(将组装好的检测卡55℃烘72小时)结果

表3交叉数据

由上述实施例可知，本发明提供的亚甲基二氧吡咯戊酮抗原可应用于亚甲基二氧吡咯戊酮的检测，且具有较高的灵敏度。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。