本发明涉及一种免标记sers微阵列芯片的检测试剂盒及其应用，属于生物检测领域。
背景技术：
：目前微生物的快速检测与鉴别在临床医学、食品卫生学、环境科学等领域都具有重要的研究意义。传统的微生物检测方法包括铺板培养法、流式细胞仪检测法(flowcytometry)、显微镜技术(荧光显微镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜和原子力显微镜)、聚合酶链式反应(pcr)和酶联免疫分析法(elisa)、铺板培养法虽然方法简单且灵敏度和选择性较高，但耗时较长，往往需要2-3天甚至更长，难以适应突发性公共卫生安全事件的需要；而诸如flowcytometry、pcr和elisa等分子生物学方法则必须依靠成本较高的抗体或核酸探针实现病原菌的检测，不利于大范围推广到实际的病原菌检测应用中；而显微镜技术需要价格昂贵的仪器和复杂的样品准备，不利于大规模应用和现场原位检测。此外，上述方法基本都属于带标记(label)的方法，需要标记上相应的荧光染料分子，相对于免标记(label-free)的方法，不仅增加了操作步骤和时间，且生物分子标记后容易失活，易导致结果重现性差的问题。因此，开发低成本、简单、通用性好、免标记的病原菌快速实时现场鉴定和检测技术已成为饮用水/食品安全领域的迫切需求。表面增强拉曼散射(surface-enhancedramanscattering，简称sers)检测技术恰好满足上述饮用水/食品安全领域的需求。sers技术具备高信噪比、高分辨率、检测速度快、可提供生物样品指纹图谱的突出优势，因此很快成为病原菌无损、原位、快速免标记检测的研究热点。但根据我们前期研究和文献检索发现，sers技术用于病原菌的检测主要存在以下两个问题：1)检测信号的重现性差；2)检测效率低，不能进行多种病原菌的高通量快速同时检测。最近，一种基于细菌表面原位(in-situ)包裹银纳米粒子(agnps)的sers微阵列芯片(microarray)平台为解决以上两大问题提供了新的思路。一方面，这种基于带负电的细胞壁表面原位合成agnps的方法有助于解决传统sers信号稳定性低和重现性差的问题，因其能使agnps直接包覆在细胞壁表面，克服了传统简单混合方法agnps不能和细胞壁很好结合的问题。另一方面，微阵列芯片通过平面微细加工技术，在很小的平面固体表面上有序地排列成千上万个生物识别功能的分子探针点阵，形成可寻址的探针微阵列，具有高通量快速检测的能力。目前，基于sers的微阵列芯片检测原理一般为利用静电引力策略来达到高效、精确组装纳米粒子到致病菌表面。这种策略主要基于革兰氏阴性菌细胞壁上的磷壁酸(teichoicacid)和革兰氏阳性菌外膜上的脂多糖(lipopolysaccharides)使细胞壁表面带负电。带正电荷的聚(l-赖氨酸)修饰的金纳米粒子、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)修饰的金纳米棒28和聚(丙烯胺盐酸盐)/金纳米粒子/聚(丙烯胺盐酸盐)31逐层自组装(静电吸附)纳米结构能够高效的、精确的沉积到带负电的细胞壁表面。但是这些研究工作一般需要复杂的制备过程，且没有进行相应的sers实验。此外，这些方法有个潜在的问题，包裹试剂(例如ctab)具有很强的拉曼信号，可能对病原菌的sers信号造成干扰。因此，发展一种快速、简单、精确且高效的控制纳米粒子自组装到致病菌表面的新技术已迫在眉睫技术实现要素：本发明第一方面是基于sers的微阵列芯片检测试剂盒，其包括：包被抗体的微阵列芯片、反应试剂以及清洗试剂。在一个实施方案中，所述反应试剂包括：贵金属盐溶液和还原剂。在另一个实施方案中，所述贵金属盐溶液为银盐溶液。所述还原剂选自抗坏血酸、柠檬酸三钠、硼氢化钠和盐酸羟胺。在具体地实施方案中，所述银盐溶液为硝酸银溶液，浓度为5-20mmol/l，优选为10mmol/l。所述盐酸羟胺的用量是0.05-0.5mmol/l，优选为0.17mmol/l。在又一个实施方案中，所述清洗试剂为200mmol/l的ph值为7.6的pbs缓冲液。在本发明中，所述包被抗体的微阵列芯片可以根据检测的微生物的种类不同，制备出不同抗体修饰的微阵列芯片。所述抗体可以特异性识别目的微生物，所述抗体的类型可以是多克隆抗体或单克隆抗体。如果同时要检测多种细菌，我们需相应的制备出多抗体修饰的微阵列芯片。同时根据样品数目的多少，控制微阵列芯片上的抗体点数和排列组合方式，使其达到最大的检测效率。本发明第二方面是提供所述基于sers的微阵列芯片检测试剂盒的制备方法，其包括：(1)包被抗体的微阵列芯片的制备：a)用100％h2so4活化载玻片,然后通过有机硅烷gopts进行载玻片硅烷化；b)将上一步处理得到的载玻片用n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化，然后将dsc、dmap、dmf和三乙胺的溶液加至peg化的芯片；活化的芯片在超声波浴中用甲醇清洗两次；随后将芯片在n2气氛下干燥；c)将抗体、pluronicf127和海藻糖溶于pbs溶液中作为点样溶液，将点样溶液加入到384孔微量滴定板中；通过接触式检测器，用坚硬的针将体积为1nl的样品点出直径400μm左右的斑点；然后将芯片至于水中20℃温育，然后用封闭剂对芯片进行封闭处理，最后用水和pbs中清洗芯片即得。(2)按常规方法制备反应试剂以及清洗试剂。本发明的第三方面是提供一种采用基于sers的微阵列芯片检测试剂盒检测微生物的方法：(1)将样本滴加在包被抗体的微阵列芯片上反应1小时；(2)用清洗试剂反复清洗包被抗体的微阵列芯片3次后，依次添加反应试剂原位合成纳米颗粒，反应时间30分钟；(3)用清洗试剂再次清洗包被抗体的微阵列芯片，然后通过激光显微拉曼系统进行检测获得拉曼指纹图谱，通过化学计量学方法对样本中微生物进行鉴别和定量。附图说明图1：采用实施例1制备的试剂盒对大肠杆菌dsm1116样品检测图谱图2：清洗溶液对试剂盒检测效果的影响具体实施方式还可进一步通过实施例来理解本发明，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。实施例1基于sers的微阵列芯片检测试剂盒的制备包被抗体的微阵列芯片的制备：首先用100％h2so4活化载玻片,然后通过有机硅烷gopts进行载玻片硅烷化。用聚(乙二醇)(peg)-二胺与载玻片表面反应。接下来进行抗体的固定，在抗体固定之前，将上一步处理得到的载玻片用n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化(4小时)。使用三明治夹心技术将总计600μl80mg(0.31mmol)的dsc，4mg(0.03mmol)dmap，1.6mldmf和125μl三乙胺的溶液加至两块peg化的芯片。活化的芯片在超声波浴中用甲醇清洗两次，每次10分钟。随后，将芯片在n2气氛下干燥。为了防止点样抗体的变性，配制pluronicf127和10％海藻糖的pbs溶液作为抗体稳定剂。该溶液在15小时的孵育过程内保持水分。此外，借助作为强蛋白质结构稳定剂的0.005％pluronicf127防止斑点的不均匀铺展。每个点样溶液含有1.0gl-1抗大肠杆菌抗体，加入到384孔微量滴定板中。通过接触式检测器(bioodysseycalligrapherminiarrayer，bio-rad，munich，germany，http：//www.biorad.com/)，将抗体溶液点出来。用一根坚硬的针(sns9，telechemstealth，perkinelmergmbh，germany，http://www.perkinelmer.com/)将体积为1nl的样品点出直径400μm的斑点。点样过程在50％湿度和15℃平板温度下进行。在含有200μlh2o的培养皿中于20℃温育15小时后，在含有2％酪蛋白的pbs中，通过涡旋100秒使斑点周围的芯片表面失活，并在室温下在2％酪蛋白的pbs中摇动5小时。最后用水和pbs中清洗芯片。芯片在含有0.1％nan3的pbs中，储存在4℃下备用。(2)反应试剂：常规方法配置10mmol/l的硝酸银溶液和0.17mmol/l的盐酸羟胺溶液。(3)清洗试剂：200mmol/l的ph值为7.6的pbs。实施例2基于sers的微阵列芯片检测试剂盒的检测方法1)实施例1制备试剂盒检测流程：将大肠杆菌dsm1116样品悬浮于pbs缓冲液中，孵育1小时以将其包裹在微阵列芯片的表面，然后首先用pbs洗涤芯片，再用水洗涤。然后将该芯片放入一个聚碳酸酯的容器内，加入agno3溶液(1.0ml，10mm)，孵育30分钟，加入9mlnh2oh·hcl(0.17mmol/l)溶液，并将该容器在搅拌下孵育5分钟。将吸附了细菌和银纳米粒子的芯片进行sers测定，每个样品至少测定3次。检测结果如图1所示：(a)单个大肠杆菌dsm1116的显微图像(b)相应的sers光谱2)检测限的测定：利用该芯片为基底，sers测定不同浓度的细菌样品，能检测出的最低细菌浓度为检测限。检测表明实施例1制备试剂盒的检测限：102cells/ml。3)重现性测定：在微阵列芯片上随机选取一个150×l50μm2的区域，用50×物镜以5μm为步长进行30×30共计900个点的方阵区域扫描。探针分子选用的是浓度为10-4m罗丹明6g(r6g)，选择其中较强的1362cm-1特征峰的强度作为采集对象。计算探针分子特征信号峰的相对标准偏差(rsd)来表征该芯片的重现性。结果表明实施例1制备试剂盒的重现性数据：rsd＝4.5％。实施例3清洗试剂的类型、ph值以及浓度对检测结果的影响通过原位合成方法获得sers信号与细菌表面所带的电荷密切相关，而细菌表面的电荷会随着溶剂的ph值和离子强度而改变。溶液的ph值一定，溶液的离子强度越高，细菌表面所带的负电荷越少。因此我们选用pbs作为清洗剂。我们用不同浓度的pbs清洗细菌，首先，我们制备了不同浓度的pbs溶液，例如0，0.1，1.0，10，80，100mm。然后我们使用制备的pbs溶液洗涤1×108cells/ml大肠杆菌dsm1116两次。最后，我们使用这些洗过的细菌来测量相应的zeta电位并制备不同的细菌(pbs)@agnps样品，然后测量相应的拉曼光谱。结果如图2所示，当pbs浓度增加时，细胞壁的zeta电位变小，相应地，细菌的sers信号降低。实施例4反应试剂的筛选按照实施例1的方法制备相关试剂盒，对反应试剂盒中的还原试剂进行考察，分别采用相同浓度的抗坏血酸、柠檬酸三钠和硼氢化钠(0.17mmol/l)制备反应试剂，按照实施例2的方法检测相关试剂盒的检测限和重现性具体结果如下：还原剂检测限重现性对比试剂盒1抗坏血酸5×102cells/ml7.6％对比试剂盒2柠檬酸三钠103cells/ml8.7％对比试剂盒3硼氢化钠5×103cells/ml10.3％本
发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。当前第1页12