利拉利汀的高效液相色谱检测方法与流程

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种利拉利汀的高效液相检测方法。

背景技术：

糖尿病是一种常见的慢性病，据国际糖尿病联合会(IDF)预测，2011年全世界糖尿病患病率约为8.3％(约3.66亿患者)，预计到2030年，糖尿病患病人数将升至5.52亿，其中以2型糖尿病最为常见。

利拉利汀(Linagliptin)，是德国勃林格殷格翰制药公司开发的口服降糖药物，于2011年5 月2日经美国FDA批准上市，商品名为Tradjenta。本品为片剂，与饮食和锻炼结合用于改善2 型糖尿病患者的血糖控制能力。利拉利汀即可单独单独服用，也可与其它现有药物联合使用，如与二甲双胍(metformin)，格列美脲(glimepiride)和吡格列酮(pioglitazone)等合用。目前尚未有利拉利汀与胰岛素联合使用的研究报道。利拉利汀不能用于1型糖尿病患者或血中 /尿中酮体升高(糖尿病酮酸症)的患者。在约3800名2型糖尿病患者参与的8项双盲临床试验中，利拉利汀的安全性和有效性得到证实。其主要不良反应包括：上呼吸道感染、流鼻涕、喉咙痛、肌肉疼和头痛等[Bochringre Ingelheim Intemational GMBH&Co.KG.Phar-maceuti cal compasition,pharmaceutical dosage form,process for their preparation and uses thereof: US,2010/0209506AI[P].2010-02-11.]。

虽然利拉利汀已经被美国FDA批准上市，但是它还是有一些不良反应，从而在服药时需要降低剂量以限制毒性进一步提高患者的耐受性，使靶向投药达到最大，这必然要求利拉利汀检测方法的定量检测限相对较低。

本发明针对现有技术中高效液相定量手段进行了改进与优化，与现有技术中的方法相比，本发明的检测方法用于检测利拉利汀不仅分离效果好，精密度和准确度高，而且操作安全简易，处理方便快捷，适合高通量筛选及精准定量。该方法对利拉利汀的原料、制剂质量研究以及相关药动学定量研究等方面均具有重要研究价值。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种利拉利汀的高效液相色谱检测方法，其用于利拉利汀的含量检测具有定量检测限低、线性关系好、重复性好的特点。

为解决上述技术问题，本发明提供一种利拉利汀的高效液相色谱检测方法，色谱条件如下：

色谱柱采用反相C18色谱柱；

流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为甲酸-醋酸铵的水溶液，该水溶液中甲酸体积浓度为0.01～0.05％，水溶液中醋酸铵浓度为0.5～1.5mM；流动相B为甲酸-醋酸铵的乙腈溶液，该乙腈溶液中甲酸体积浓度为0.01～0.05％，乙腈溶液中醋酸铵浓度为0.5～1.5mM；

采用梯度洗脱：流动相A+流动相B＝100％；0-0.01min，流动相B保持体积百分比为10％； 0.01-2.10min,流动相B体积百分比由10％递增至80％；2.10-2.11min，流动相B体积百分比由80％递减至10％；2.11-3.00min，流动相B保持体积百分比为10％。

在一个优选的实施例中，流动相A中还加入一定量的乙腈，流动相A中甲酸-醋酸铵的水溶液与乙腈的体积比为100～95：0～5；流动相B还加入一定量的水，流动相B中甲酸-醋酸铵的乙腈溶液与水的体积比为100～95：0～5。

在一个优选的实施例中，流动相A是甲酸-醋酸铵的水溶液和乙腈的体积分数为95：5 的混合溶液，流动相B是甲酸-醋酸铵的乙腈溶液和水的体积分数为95：5的混合溶液。

在一个优选的实施例中，流动相A中，水溶液中甲酸体积浓度为0.02～0.04％，醋酸铵浓度为1.8～1.2mM；流动相B中，乙腈溶液中甲酸体积浓度为0.02～0.04％，醋酸铵浓度为 1.8～1.2mM。

在一个优选的实施例中，流动相A中，水溶液中甲酸体积浓度为0.025％，醋酸铵浓度为 1mM；流动相B中，乙腈溶液中甲酸体积浓度为0.025％，醋酸铵浓度为1mM。

在一个优选的实施例中，色谱柱柱长为100mm。

在一个优选的实施例中，色谱柱为Waters XBridge色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

在一个优选的实施例中，流速为1.0～2.0ml/min，更优选为1.2～1.6ml/min，更优选为 1.4ml/min。

在一个优选的实施例中，检测波长为290～298nm，更优选为292～296nm，更优选为294nm。

在一个优选的实施例中，柱温控制在35～40℃，更优选为40℃。

在一个优选的实施例中，进样量为2～8μl，更优选为3～5μl，。

本发明的利拉利汀的高效液相色谱检测方法，具有操作简单、分离效果好且精密度和准确度高的特点，能实现对利拉利汀及其有关物质的良好分离，在6.25～200ug/ml范围内呈良好的线性关系，并且重现性高，可用于精准测定利拉利汀的含量，同时用于其原料及制剂的质量优化和有关物质检测，有助于其后期的原料优化、药代动力学定量考察以及制剂质量研究。

本发明采用了反相高效液相色谱法，通过制备供试液和梯度对照液，并且分别量取供试液及对照溶液，注入色谱仪，记录色谱图，制备线性相关工作曲线，代入供试样品峰面积计算并折干，即完成了利拉利汀含量的测定。

具体的，本发明提供的精准测定利拉利汀含量的高效液相色谱检测方法的具体操作如下：

(1)对照品溶液及供试品溶液的制备：精密称取一定量利拉利汀对照品，用注射用水溶解并定容成具有一定浓度梯度的多个对照品溶液；精密称取适量利拉利汀供试品，用注射用水溶解并定容得到供试品溶液；

(2)色谱条件：

色谱柱采用反相C18色谱柱；

检测器采用DAD检测器；

流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为甲酸-醋酸铵的水溶液，该水溶液中甲酸体积浓度为0.01～0.05％，水溶液中醋酸铵浓度为0.5～1.5mM；流动相B为甲酸-醋酸铵的乙腈，该乙腈溶液中甲酸体积浓度为0.01～0.05％，乙腈溶液中醋酸铵浓度为0.5～1.5mM；

采用梯度洗脱：流动相A+流动相B＝100％；0-0.01min，流动相B保持体积百分比为10％； 0.01-2.10min,流动相B体积百分比由10％递增至80％；2.10-2.11min，流动相B体积百分比由80％递减至10％；2.11-3.00min，流动相B保持体积百分比为10％；

(3)测定方法：

将所述多个对照品溶液以及供试品溶液按所述(2)色谱条件依次进样，记录色谱图，根据多个对照品溶液的图谱数据和浓度数据制备线性相关工作曲线，代入供试样品的图谱数据计算并得出供试品溶液浓度，完成了利拉利汀含量的测定。

在一个优选的实施例中，对照品溶液的浓度依次为6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml。

在一个优选的实施例中，流速为1.4ml/min，检测波长为294nm，柱温为40℃，进样量为3～5μl。

本发明的液相色谱方法，记录时间在3min即可；分离效果好，R值≥1，在优选的条件下R值≥1.5；线性关系好，定量检测限低，可有效检测出浓度低至6.25μg/ml的样品，且重复性好，可用于利拉利汀的精准定量。

本发明填补了目前利拉利汀含量测试分析方法尚无的空缺，本发明可以满足研发和生产的需求，能够有效的对利拉利汀含量进行更为严格有效的控制。

附图说明

图1为采用本发明的方法测定利拉利汀供试品的HPLC图谱一。

图2为采用本发明的方法测定利拉利汀供试品的HPLC图谱二。

图3为采用本发明的方法测定利拉利汀供试品的HPLC图谱三。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

流动相A是甲酸-醋酸铵的水溶液/乙腈(95/5；v/v)的混合溶液，水溶液中甲酸体积浓度为0.025％，水溶液中醋酸铵浓度为1mM；流动相B是甲酸-醋酸铵的乙腈溶液/水(95/5； v/v)的混合溶液，乙腈溶液中甲酸体积浓度为0.025％，乙腈溶液中醋酸铵浓度为1mM。

此方法下经过三次进样，HPLC图谱(图1-3)显示基线平稳，重复性好，利拉利汀保留时间为1.961～1.967min，工艺杂质保留时间为0.807～0.920min，3min能够全部出峰，且分离度≥1.5，完全分离。

实施例2精确测定利拉利汀的含量

(1)对照品溶液及供试品溶液的制备：精密称取利拉利汀对照品，用注射用水溶解并定容得到1mg/ml的储备液，准确吸取50μl储备液，用注射用水依次稀释定容得到6.25、12.5、 25、50、100、200ug/ml的对照品溶液；精密称取利拉利汀供试品，用注射用水溶解并定容得到供试品溶液；

(2)色谱条件：

色谱柱采用碳十八烷基键合硅胶填料色谱柱和预柱；检测器采用PDA检测器；柱温为 40℃,进样量3～5μl，流速：1.4ml/min，检测波长：294nm；

流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为0.025％FA&1mM NH₄OAc in water/ACN(v:v,95:5)；流动相B为0.025％FA&1mM NH₄OAc in ACN/water(v:v,95:5)；

采用梯度洗脱，A+B＝100％，梯度洗脱程序按以下程序进行：0-0.01min，流动相B保持体积百分比为10％；0.01-2.10min,流动相B体积百分比由10％递增至80％；2.10-2.11min，流动相B体积百分比由80％递减至10％；2.11-3.00min，流动相B保持体积百分比为10％。

(3)测定方法：

将所述6个对照品溶液和供试品溶液按所述色谱条件依次进样，记录色谱图，根据6个对照品溶液的利拉利汀峰面积和浓度数据制备线性相关工作曲线，该工作曲线线性关系良好 (r≥0.9999)；代入供试样品的利拉利汀峰面积计算并得出供试品溶液浓度，比较测定的供试品溶液浓度和定容的供试品溶液浓度以及进样时的稀释倍数，计算得出利拉利汀的含量。

本发明的利拉利汀的高效液相检测方法，能够有效检出利拉利汀及其有关物质，并且分离度R能达1.5以上，而现有技术中的检测方法难以实现利拉利汀及其有关物质的有效分离；本发明的检测方法的HPLC谱基线稳定，不发生漂移；本发明的方法检测时间短，只需3min 即可完成高效液相检测过程，而现有技术中的检测方法则需要至少15min以上才能完成检测，本方法大大提高了检测效率，适合高通量筛选；本发明的方法能节省溶剂，降低成本，操作安全简易，处理方便快捷；本发明的方法用于利拉利汀的含量测定，具有良好的线性关系(r ≥0.9999)，重现性高，在原料药、制剂质量研究以及相关药动学定量研究等方面具有重要研究价值。

综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。