本发明属于心血管疾病治疗领域，具体涉及一种腺嘌呤核苷酸转运体1在心肌肥大治疗领域中的应用。
背景技术：
随着当今社会的飞速发展，心血管疾病作为人类健康“三大杀手”之首，正在日趋降低人类的生活质量，严重威胁人类的生命与健康。在众多心血管疾病中，心肌肥大的发生与发展受到人们的广泛关注。目前认为，心肌肥大是心力衰竭过程中一个重要的“过渡”过程，是心肌对于机械应激的一项代偿性反应。心肌肥大是心肌对心功能不全的适应性改变，初期代偿具有有益作用，后期进入失代偿产生不利影响，可以引起心律失常、心肌梗死、充血性心力衰竭等疾病的发生。心肌肥大的主要特征表现为：心肌细胞体积的肥大，细胞外基质的沉积，心肌纤维化的发生，以及伴有心肌内冠脉系统的形成异常等特征。众多研究表明：心肌肥大是心力衰竭的重要前期病变。预防、延缓或逆转心肌肥大的发生与发展，可以有效的预防或遏制心力衰竭的发生，提高病人的生存质量。因此，明确心肌肥大的发生原因和机制，找寻有效的防治心肌肥大的新的思路和干扰靶点，是临床上有效防治心肌肥大亟待解决的重要问题之一。
腺嘌呤核苷酸转运体1（adeninenucleotidetranslocase,ant1）是一种位于线粒体内膜的跨膜蛋白，约占整个线粒体蛋白含量的10%，分子量约为3万道尔顿，以二聚体形式存在，其同型异构体在人类为ant1、ant2、ant3及ant4。ant1是心肌线粒体内膜上含量丰富的多肽，参与细胞质与线粒体基质adp/atp的转运，偶联细胞的产能和耗能，在调控心肌细胞能量转化过程中发挥着重要的作用。同时ant1也是线粒体通透性转运孔（mitochondrialpermeabilitytransitionpore,mptp）的关键组成蛋白，ant1分子构象的改变，尤其是其相邻巯基的氧化还原状态明显影响mptp的开关，从而影响线粒体膜电位、膜通透性、线粒体功能。mptp打开后可增加促凋亡因子的释放，从而激活caspase家族蛋白活性，引起细胞凋亡。因此ant1是一种具有能量转运、线粒体功能调控、凋亡调节等多种功能的载体蛋白，在机体中发挥着重要的生理作用。但是ant1的巯基亚硝基化修饰在心血管疾病中的作用及其机制目前尚未有任何相关的研究和报道。
技术实现要素：
解决的技术问题：本发明提供一种腺嘌呤核苷酸转运体1（ant1）的应用，通过下调心肌细胞内ant1巯基亚硝基化修饰的水平，有效抑制心肌肥大的发生。该方法包含利用半胱氨酸修饰位点突变的腺病毒转染心肌细胞，调控细胞内ant1蛋白巯基亚硝基化修饰的表达，还包含利用半胱氨酸修饰位点突变的腺相关病毒特异性转染小鼠心脏组织，调控心肌组织内ant1蛋白巯基亚硝基化修饰的表达。
技术方案:腺嘌呤核苷酸转运体1作为生物标志物在制备预防检测心肌肥厚试剂盒中的应用。
下调腺嘌呤核苷酸转运体1巯基亚硝基化修饰水平的生物材料在制备治疗心肌肥大药物中的应用。
上述生物材料半胱氨酸修饰位点突变的腺病毒或腺相关病毒。
上述半胱氨酸位于腺嘌呤核苷酸转运体1第160位上（cys160）。
上述腺病毒为ad-c160a或aav9-ant1-c160a腺相关病毒。
有益效果：利用向心肌细胞内转染半胱氨酸修饰位点突变的腺病毒和向心肌组织内转染半胱氨酸修饰位点突变的腺相关病毒，下调细胞和组织内ant1蛋白巯基亚硝基化修饰的表达水平，可有效抑制心肌肥大的发生。
附图说明
图1为细胞心肌肥大模型中ant1修饰水平图：乳大鼠原代心肌细胞给予angii（血管紧张素ii）刺激48h，构建心肌细胞肥大模型，biotin-switch检测ant1巯基亚硝基化修饰水平。**p<0.01。
图2为动物心肌肥厚模型中ant1修饰水平图：利用野生型（wt）cb7bl/6小鼠行假手术（sham）和主动脉缩窄（tac）手术，构建小鼠的心肌肥大模型。术后4周，收取两组小鼠的心肌组织，biotin-switch检测心肌组织ant1巯基亚硝基化修饰水平。*p<0.05。
图3a为质谱筛选ant1第57位半胱氨酸位点修饰位点图；
图3b为质谱筛选ant1第129位半胱氨酸位点修饰位点图；
图3c为质谱筛选ant1第160位半胱氨酸位点修饰位点图；
由图3a-c可看出利用液相色谱串联质谱（lc-ms/ms）技术，在自发性高血压大鼠（shr）及对照鼠wky心肌组织中，biotin-switch检测ant1巯基亚硝基化修饰，筛选ant1的巯基亚硝基化修饰位点。
图4为293t细胞筛选ant1修饰位点图：构建ant1半胱氨酸第57、129、160和257位点突变质粒（c57a、c129a、c160a、c257a）转染293t细胞，biotin-switch检测细胞内ant1巯基亚硝基化修饰水平。
图5为ant1巯基亚硝基化修饰对心肌细胞肥大基因anp、bnp表达水平的调控图：构建ant1野生型腺病毒（adwt）、第160位半胱氨酸位点突变的腺病毒（adc160a）及对照组腺病毒（adgfp）转染原代心肌细胞，angii刺激48h，通过rt-pcr检测细胞内肥大基因anp（心房利尿肽，atrialnatriureticpolypeptide），bnp（脑利尿肽，brainnatriureticpolypeptide）的表达情况。*p<0.05。#p<0.05。
图6为ant1巯基亚硝基化修饰对心肌细胞表面积的调控图：构建ant1野生型腺病毒（adwt）、第160位半胱氨酸位点突变的腺病毒（adc160a）及对照组腺病毒（adgfp）转染原代心肌细胞，angii刺激48h，通过α-actinin的免疫荧光染色检测细胞的面积大小。
图7为ant1第160位半胱氨酸位点突变对tac小鼠心功能的影响图：构建ant1野生型腺相关病毒（aav9-ant1wt）及第160位半胱氨酸位点突变的腺相关病毒（aav9-ant1c160a）尾静脉注射c57bl/6小鼠，4周后行tac手术构建小鼠的心肌肥大模型，术后4周，检测小鼠心脏功能及心脏肥厚相关指标。***p<0.005。###p<0.005。##p<0.01。
图8为ant1第160位半胱氨酸位点突变对tac小鼠心脏指标的影响图：构建ant1野生型腺相关病毒（aav9-ant1wt）及第160位半胱氨酸位点突变的腺相关病毒（aav9-ant1c160a）尾静脉注射c57bl/6小鼠，4周后行tac手术构建小鼠的心肌肥大模型，术后4周收取小鼠心脏组织检测心脏肥厚水平。***p<0.005。**p<0.01。#p<0.05。
图9为ant1第160位半胱氨酸位点突变对tac小鼠心脏anp、bnp表达的调控图：构建ant1野生型腺相关病毒（aav9-ant1wt）及第160位半胱氨酸位点突变的腺相关病毒（aav9-ant1c160a）尾静脉注射c57bl/6小鼠，4周后行tac手术构建小鼠的心肌肥大模型，术后4周，收取小鼠心脏组织，rt-pcr检测肥大基因anp，bnp的表达情况。**p<0.01。##p<0.01。
图10为ant1第160位半胱氨酸位点突变对tac小鼠心脏大小及心肌细胞表面积的调控图：构建ant1野生型腺相关病毒（aav9-ant1wt）及第160位半胱氨酸位点突变的腺相关病毒（aav9-ant1c160a）尾静脉注射c57bl/6小鼠，4周后行tac手术构建小鼠的心肌肥大模型，术后4周，收取小鼠心脏组织，h&e染色检测心脏表面积大小。
图11为ant1第160位半胱氨酸位点突变对tac小鼠心脏组织ant1巯基亚硝基化修饰水平调控图：构建ant1野生型腺相关病毒（aav9-ant1wt）及第160位半胱氨酸位点突变的腺相关病毒（aav9-ant1c160a）尾静脉注射c57bl/6小鼠，4周后行tac手术构建小鼠的心肌肥大模型，术后4周，收取小鼠心脏组织，biotin-switch检测组织内ant1巯基亚硝基化修饰水平。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
1.biotinswitch法检测巯基亚硝基化修饰蛋白水平（主要采用caymanchemical公司的s-nitrosylationproteindetectionkit，货号10006518）
（1）洗贴壁细胞：细胞经过处理后，去除培养基，用预冷的washbuffer洗3遍，再加500μlwashbuffer刮下，并转移至1.5ml离心管里。
（2）500rcf，4℃离心，5min，弃上清。
（3）细胞置于冰上，配制blockingbuffer，具体配制方法如下：
100μldmf和900μlbuffera加入新的blockingreagent配成blockingbuffer原液，混匀后，将这1ml液体加入9mlbuffera中，即为最终blockingbuffer。
（4）每管加入500μlblockingbuffer重悬上述离心所得细胞沉淀，4℃旋转30min。
（5）12,000rpm，4℃离心，10min后，取上清，转移至15ml离心管中。
（6）加入4倍体积-20℃预冷的丙酮，轻轻翻转，颠倒混匀，-20℃静置1h以充分沉淀蛋白。
（7）配制reducing&labelingbuffer，具体配制方法如下：
1mlbufferb加入新的reducingreagent瓶中配成新的reducingbuffer原液，100μldmf和900μlbufferb加入新的labelingreagent中配成新的labelingbuffer原液，根据所需要的量，将reducingbuffer原液、labelingbuffer原液和bufferb按照1:1:8的体积比例配制成最终reducing&labelingbuffer。
（8）将上述-20℃沉淀的蛋白取出3000rcf，4℃离心，10min，弃丙酮，加入500μl上述reducing&labelingbuffer，枪轻吹散，室温静置1h。
（9）加入4倍体积-20℃预冷的丙酮，轻轻翻转，混匀颠倒，-20℃静置1h。
（10）3000rcf，4℃离心，10min，弃丙酮。
（11）500μlwashbuffer溶蛋白沉淀，测蛋白浓度。
（12）根据所测蛋白浓度留取50μg蛋白做input，另取500μg蛋白，加入biotin亲和素珠子，4℃旋转过夜。
（上述步骤均为避光操作）
（13）洗珠子4℃旋转5min，0.5rpm，4℃离心，5min，去上清，加入新鲜ip洗液4℃旋转5min，重复以上操作5遍，最后一遍吸干上清加入与珠子等体积的2×loadingbuffer，震荡离心，煮蛋白100℃，5min。
（14）western-blot检测ant1巯基亚硝基化修饰水平（anti-ant1抗体：abcam公司，货号ab102032、anti-gapdh抗体：巴傲德公司，货号ap0063、anti-β-actin抗体：嘉暄生物公司，货号jx2001）。
2.细胞免疫荧光
（1）原代乳大鼠心肌细胞经相应处理后，去除细胞培养基，用pbs洗涤细胞3次，5min/次。
（2）4%多聚甲醛室温固定细胞20min。
（3）弃去多聚甲醛，用pbs洗涤细胞3次，10min/次。
（4）加入0.1%tritonx-10处理，在室温下，摇床上通透处理25min。
（5）弃去液体，pbs洗3遍，10min/次，加入3%bsa室温封闭45min。
（6）弃去液体，加入α-actinin（sigmaaldrich公司，货号7811）抗体，4度孵育过夜。
（7）弃去一抗，pbs洗涤细胞3次，每次15min。
（8）加入荧光标记二抗，37度避光孵育1h后，pbs洗涤3次，每次15min，加入dapi（santa公司，货号sc-24941）染液，染细胞核，室温避光处理5min。
（9）置于显微镜下，观察拍照。
3.腺病毒转染原代心肌细胞
（1）提取乳大鼠原代心肌细胞，细胞种板培养于含10%胎牛血清的dmem培养液中。
（2）细胞培养过夜后，采用腺病毒法进行转染。
（3）转染前pbs液洗涤细胞2次以去除培养基中剩余的血清，给以ant1野生型（adc160a）及位点突变（adc160a）或者对照（adgfp）的腺病毒（moi=50）处理8h。
（4）将细胞置于标准培养条件下，8h后更换新鲜正常培养基继续培养。
（5）ant1半胱氨酸位点突变及野生型腺病毒及对照腺病毒合成于上海汉恒生物有限公司。
4.c56bl/6小鼠心肌组织特异性过表达腺相关病毒
（1）取4周龄、雄性c56bl/6小鼠，小鼠尾静脉注射ant1野生型腺相关病毒（aav9-ant1wt）及第160位半胱氨酸位点突变的腺相关病毒（aav9-ant1c160a），病毒滴度为1011/只。
（2）小鼠spf级饲养环境饲养4周，使腺相关病毒aav9稳定表达于心肌组织。
（3）小鼠8周龄时，统一行心脏主动脉缩窄术（tac）或对照假手术（sham）。
（4）术后4周进行小鼠心脏超声检测心脏功能和心脏肥厚情况，并统一提取心脏组织，测量体重、心脏重量、左心室重量和胫骨长度等指标。
（5）ant1野生型腺相关病毒（aav9-ant1wt）及第160位半胱氨酸位点突变的腺相关病毒（aav9-ant1c160a）合成于深圳百恩维生物有限公司。
5.western-blot
（1）sds-page（聚丙烯酰氨凝胶）电泳：配制12%的分离胶和3%的浓缩胶。取15μl样品液和3μl6×加样缓冲液，混匀。煮沸5min使蛋白变性后上样，每孔上样量约为30μg。110v恒压电泳约90min，至溴酚蓝完全消失。
sds-page的配制：
成分分离胶(12%)浓缩胶(3%)
去离子水1.6ml1.8ml
30%aa母液2.0ml0.3ml
1.5mtris-hcl(ph8.8)1.3ml
1mtris-hcl(ph6.8)0.75ml
10%sds50μl30μl
10%过硫酸胺(aps)50μl50μl
temed5μl5μl
总体积5ml约3ml
（2）转膜：电泳完毕后，切去浓缩胶，将胶浸于蛋白转移缓冲液（3.6g/ltris，300ml/l甲醇，17.3g/l甘氨酸）中平衡10～20min。用湿转的方法将蛋白条带转移至pvdf膜上(sds-凝胶位于负极，pvdf膜位于正极)，0.3a恒流电泳80min。
（3）封闭：转膜结束后，取下pvdf膜，pbs浸泡5min后将膜浸于含5%脱脂奶粉的pbs(mpbs)中1h。
（4）一抗孵育：封闭结束后将膜置于杂交袋内，加入抗体，4℃摇动下过夜。
（5）二抗结合：pbs-t（pbs中加入tween-20，浓度为0.05%）快速洗膜一遍后，pbs-t洗膜10min×3遍。加入辣根过氧化物酶标记的兔抗羊第二抗体(1%mpbs1:2000稀释)，室温下孵育1h。pbs-t快速洗膜一遍，再洗膜10min×3遍。
（6）ecl显色：临用前将ecl显色液a与b混和，均匀滴加至膜表面，避光曝片，观察结果。
实施例1
为了探索ant1蛋白巯基亚硝基化修饰在心肌肥大中的作用，我们培养新生乳大鼠原代心肌细胞，angii（100nm）刺激48h引起心肌细胞肥大，相比于生理盐水组，angii（100nm）刺激48h可以明显增加ant1的巯基亚硝基化水平（图1）。接着，我们在野生型c57bl/6小鼠行假手术（sham）以及主动脉缩窄（tac）手术，术后4周提取小鼠心肌组织巯基亚硝基化修饰蛋白。通过biotin-switch检测了小鼠心肌组织中的ant1蛋白巯基亚硝基化修饰水平。发现与对照组相比，tac手术组小鼠心肌组织中ant1蛋白巯基亚硝基化修饰水平明显增加（图2）。以上实验结果提示：在心肌肥大的细胞和动物模型中，ant1蛋白巯基亚硝基化修饰水平都明显增高。
实施例2
为了进一步明确ant1蛋白巯基亚硝基化修饰在心肌肥大中的作用，我们结合液相色谱串联质谱（lc-ms/ms）技术，在shr及对照鼠wky中筛选ant1的巯基亚硝基化修饰位点，发现在shr心脏组织中，ant1的第57、129及160位半胱氨酸位点（cys57、cys129、cys160）可发生巯基亚硝基化修饰（图3a-图3c）。将ant1的第57、129及160位半胱氨酸位点突变为丙氨酸（c57a、c129a、c160a）后转染293t细胞，进一步得出ant1的cys160位点发生了巯基亚硝基化修饰（图4）。构建ant1野生型腺病毒（adwt）、第160位半胱氨酸位点突变的腺病毒（adc160a）及对照组腺病毒（adgfp）感染原代心肌细胞，给予angii刺激，检测心肌肥大相关基因anp、bnp的表达情况，cys160位点突变后可明显降低由angii所导致的心肌肥大水平（图5）；α-actinin免疫荧光染色检测也显示，cys160位点突变后可明显降低心肌细胞表面积（图6），以上实验结果可以有力证明：通过突变ant1第160位半胱氨酸位点来抑制ant1蛋白的巯基亚硝基化修饰水平可有效抑制心肌肥大。
实施例3
为了进一步验证ant1蛋白巯基亚硝基化修饰在心肌肥大中的作用，我们分别给予4周龄c57bl/6小鼠，尾静脉注射心脏特异性过表达的ant1野生型（aav9-ant1wt）和ant1半胱氨酸160位点突变型（aav9-ant1c160a）的腺相关病毒，4周后行sham和tac术，术后4周，心脏超声仪检测小鼠心功能和心脏相关指标，结果发现tac术后心脏肥大水平明显增加（ivs-室间隔厚度，ivpw-左室后壁厚度），而ant1半胱氨酸160位点突变后行tac术，心脏肥大水平明显减低（图7）。收取心脏组织测量心脏重量，左心室重量，小鼠胫骨长度等指标，结果显示ant1半胱氨酸160位点突变后行tac术，左心室重量明显减轻（图8）。利用rt-pcr检测了心脏组织内肥大相关基因anp，bnp的表达水平，结果显示：ant1半胱氨酸160位点突变后行tac术，组织内anp，bnp的表达水平明显降低（图9）。同时对心脏石蜡切片进行h&e染色，检测心肌组织面积大小，结果可以发现在ant1半胱氨酸160位点突变后行tac术，可以减少小鼠心肌组织的面积（图10）。最后我们检测了小鼠心脏组织中，ant1蛋白巯基亚硝基化修饰水平，结果显示注射了ant1半胱氨酸160位点突变的腺相关病毒可以有效降低心肌组织内ant1蛋白巯基亚硝基化修饰水平（图11）。以上实验结果可以进一步证明：ant1第160位半胱氨酸位点突变可以降低ant1蛋白的巯基亚硝基化修饰水平，从而有效抑制心肌肥大。
以上的实验结果充分证明，心肌细胞中ant1蛋白巯基亚硝基化修饰在心肌肥大的进程中发挥重要调控作用，能够促进心肌肥大的发生。通过转染ant1半胱氨酸160位点突变的腺病毒或腺相关病毒的方式，下调心肌细胞和组织内ant1蛋白巯基亚硝基化修饰水平后，可以有效抑制心肌肥大。因此，我们认为ant1蛋白巯基亚硝基化修饰可以作为临床上治疗心肌肥大的一个新的重要靶标，在心肌肥大的防治中具有潜在的临床应用价值。