本发明属于免疫检测领域，尤其是涉及一种基于微流控芯片的降钙素原检测试剂盒及其制备和检测方法。
背景技术：
降钙素原(procalcitonin，pct)作为降钙素的前体蛋白，是由116个氨基酸组成的激素原，分子量约为13千道尔顿。pct在甲状腺、肺部和胰腺组织的c细胞中表达，经酶分解后会分解为降钙素(32个氨基酸)、抗钙素(21个氨基酸)和氨基端肽(57个氨基酸)。健康人群血液中仅有极少量的pct。人体感染细菌后，pct水平会有明显升高，体内的多种组织中会分泌表达pct。pct在感染后2～3小时浓度水平即可上升，6～12小时达到顶峰，48小时内保持较高的水平，2天后下降至基线水平。
pct用于细菌性脓毒症的早期诊断及监测，尤其是重症脓毒症和感染性休克，其pct浓度水平与感染程度成正比。pct也可用作脓毒症的预后评估指标，作为临床治疗及监控的措施之一。对于急性重症胰腺炎及相关并发症，pct也是一个良好的监测指标。对于呼吸道相关炎症及感染，pct对抗生素选择、使用及疗效判断起到指导作用。pct除了感染类相关病症的诊断及监测外，以下情况下会造成pct水平的升高。例如：外科手术和严重烧伤创伤、肝移植和心脏移植、肾功能不全、甲状腺髓样细胞癌或甲状腺滤泡癌、白血病、b细胞淋巴瘤、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎。
pct与传统炎性指标对比，更具有特异性和灵敏度。pct与wbc计数相比，wbc在不同细菌感染下可以是升高的，甚至有些是降低的，且影响wbc计数的因素较多；pct与esr相比，esr在风湿性疾病、结核分枝杆菌感染、心血管疾病的患者血清中也会明显升高；pct与crp相比，pct在全身严重细菌感染时，比crp更早、更快速的出现，且感染控制后也比crp更快回到正常水平；pct与il-6相比，il-6的半衰期较短(几分钟至几小时内)，检测结果受采样时机的影响，稳定性差[4]。因此它可能成为一项快捷、有效的常规实验指标，帮助临床诊断、鉴别诊断、疗效观察与指导用药，使患者能早日康复。
降钙素原急诊临床应用专家共识组于2012年发表了的《降钙素原(pct)急诊临床应用的专家共识》，建议了pct参考值范围，pct急诊临床应用的专家共识推荐的参考范围如下：
在中国专利文献cn104614521a中公开了一种微流控芯片，包括柔性聚合物层和基片，柔性聚合物层和基片键合在一起，所述芯片中设有微沟道系统，所述微沟道系统包括缓冲液入口、样品入口、磁珠入口、废液出口、微阀、微泵区、磁珠塞区、循环区及检测区。
上述技术方案采用灵敏度较低的比浊法，检测免疫磁珠和待测物之间的免疫反应所形成的络合物进行反应物前后的浊度变化，来进行判定待测物的浓度。相对而言，在采用免疫比浊这一方法学来说，由于不需要额外的配对抗体以及发光标记物，因此整体芯片结构设计较为简单。通过磁场在芯片沟道中形成的特定区域富集磁珠，样品持续通过此部分磁珠塞后与另一测磁珠结合，从而形成两个以上的磁珠团聚。
采用其他现有技术或(1)芯片的结构过于复杂，无法对反应做出精确的调控，清洗步骤以及液体传导存在较大的污染；或(2)使用了多个液体腔室和固相载体(磁珠以及荧光微球同时使用)，试剂整体设计过于复杂；或(3)免疫反应采用了非均相反应，意为固相载体与固相载体的表面进行反应，反应不充分，灵敏度和重复性受到限制。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种选取高灵敏度的时间分辨荧光物作为标记物，在荧光微球上进行抗体的标记，利用抗体对的免疫反应进行分析检测，所制备的试剂性能可达同等化学发光试剂的水平，免疫反应效率更高更充分的基于微流控芯片的降钙素原pct试剂盒的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该基于微流控芯片降钙素原pct试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)微流控芯片包被：取pct抗体m7402，加入至ph9.6的cb缓冲液中，按照单个芯片25μl加入微流控芯片的反应腔室内，温浴后对芯片进行清洗；
(2)荧光微球标记：取pct抗体m7413加入至荧光微球溶液中，并涡旋混匀，其中，荧光微球是经过活化处理的，反应结束后，加入终止液对反应进行终止，后离心清洗，加入封闭液进行封闭，封闭后的荧光微球进行离心清洗，使用微球储存液进行保存；
(3)微流控芯片组装：向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理，封闭液添加后在烘箱下进行烘干处理，在封闭后的中层芯片背部反应腔室下部内加入所述步骤(2)中的荧光微球溶液，于真空烘箱中真空干燥，荧光微球在芯片中呈现小液滴形态，不发生扩散；
芯片准备完毕后采用超声键合的方式，依据芯片结构依次将滤血垫，加样密封垫，导电橡胶，吸水纸以及密封圈加入芯片内部，将三层芯片按照超声键合线完成合并；
(4)定标品的制备：定标品由a组分和b组分构成；
根据抗原浓缩液的估算浓度，用定标品稀释液将抗原浓缩液稀释作为定标品抗原母液备用；
定标品稀释液即为定标品a组分，浓度为0.5ng/ml，2-8℃保存；
定标品b组分：用定标品稀释液将pct抗原母液稀释至2ng/ml，2-8℃保存；
(5)得基于微流控芯片的降钙素原pct试剂盒。
在上述技术方案中，试剂基于微流控芯片作为载体，在微流控芯片内部的微流道反应器中进行免疫检测反应，单个芯片供单人份测试使用；制备得到的试剂盒进行检测，在手动加样后，仪器实现待测物在微流控芯片内的液体流动控制，免疫反应的调控以及反应结束后的清洗步骤，仪器通过收集荧光信号并计算出具体的反应值；该制备得到的试剂盒用于细菌性脓毒症的早期诊断及监测，尤其是重症脓毒症和感染性休克，其pct浓度水平与感染程度成正比。pct也可用作脓毒症的预后评估指标，作为临床治疗及监控的措施之一。对于急性重症胰腺炎及相关并发症，pct也是一个良好的监测指标。对于呼吸道相关炎症及感染，pct对抗生素选择、使用及疗效判断起到指导作用。
在本发明中定标品稀释液主要为tris-hcl的缓冲体系，浓度为50mm，ph8.5，包含牛血清、bsa、表面活性剂rpe1740、rpe2520以及叠氮钠。
其中，在上述步骤(3)中，稀释标记crp抗体微球，预先将微球水浴超声混匀，取20微升微球+80微升抽干保存液，混匀水浴超声，在封闭好的芯片下层反应槽正中间加5微升微球，真空干燥30min，将处理好的芯片组装起来，超声键合，最后铝箔袋保存并加入干燥剂。
本发明技术方案制备得到的pct试剂盒采用双抗体夹心法进行测定，一支抗pct抗体包被在芯片反应腔内，作为固定相，另一支抗pct抗体包被在荧光微球上，免疫微球预先抽干固定在微流控芯片内，当样本加入微流控芯片加样口时，通过气泵样本流进微流道内部，样本中的pct抗原待测物先后与荧光微球上包被抗体和芯片上捕获抗体反应。在反应腔室内超声混匀反应后，清洗除去多余未结合的抗原和荧光微球，通过对芯片在360nm波长下激发，检测捕获的荧光微球在615nm下的荧光，测定其产生的荧光信号，以相对发光单位(rlu)进行表示。样本中的pct抗原浓度与仪器测定的rlu成一定的函数关系，通过自动计算获得浓度值。
此外，上述制备方法中采用的微流控芯片为在中国专利文献cn107219360a中公布的技术方案，申请人在此予以引入；选取高灵敏度的时间分辨荧光物作为标记物，在荧光微球上进行抗体的标记，利用抗体对的免疫反应进行分析检测，所制备的试剂性能可达同等化学发光试剂的水平。反应采用均相反应，在微流控芯片腔室内通过超声混合，避免了单线程的层析流动反应，使得反应效率更高更充分。免疫反应后，使用清洗液将多余组分完全去除后，对免疫反应结合上的荧光微球进行检测读数，避免了引入显色液进入芯片内部反应不充分或者显色后读数不及时的问题。
在微流控芯片的中层芯片中段固定荧光标记物，在下层芯片包被抗体，微流控芯片预先使用隔离缓冲液进行涂覆并烘干，在塑料芯片的表层形成一层保护膜后再加入荧光微球标记物，两者均通过烘干的方式固定在芯片内部，在加入样本以及稀释液后，可重新复溶并与待测物反应，而隔离组分(即封闭液)不参与反应，并且可放置荧光标记物以及免疫磁珠在烘干过程中保持生物活性，并避免与芯片发生非特异结合。
进一步的改进在于，在所述步骤(2)中，所述荧光微球活化处理的方法为：称取edc使用mes缓冲液配置成为1mg/ml的溶液，量取1mg羧基荧光微球，微球固含量为10mg/ml，体积即为50μl，置于ep管中，加入0.45mlmes缓冲液稀释，从1mg/ml的edc活化剂溶液中取5μl迅速加入微球溶液中，涡旋混匀，于超声清洗器中超声10min，后置于滚轴混匀器上震荡反应20min，总反应时间为30min。
进一步的改进在于，在所述步骤(3)中，所述封闭液含有2％bsa、0.5％tween-20、10％海藻糖以及0.2％甘露醇。
进一步的改进在于，在所述步骤(3)中，封闭处理的方法为：向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理，其中中层芯片的背面反应腔室内需要添加6μl+6μl的封闭液进行封闭，下层正面的反应腔室内，分别需要添加5μl+5μl+5μl的封闭液进行封闭。
进一步的改进在于，在所述步骤(3)中，所述微流控芯片为三片式结构，包括由上到下依次层叠的上层芯片、中层芯片以及下层芯片；上层芯片、中层芯片以及下层芯片两两之间均通过定位柱、定位孔配合连接的方式实现相互间的层叠。
本发明要解决的另一个问题是提供一种基于微流控芯片的降钙素原pct试剂盒，包括有微流控芯片，还包括有定标品，所述定标品由a组分和b组分构成，其中，定标品稀释液即为定标品a组分，浓度为0.5ng/ml；定标品b组分为用所述定标品稀释液将pct抗原母液稀释至2ng/ml；荧光微球标记的抗体试剂在所述微流控芯片内进行干燥存放；另一pct抗体包被在微流控芯片反应腔内。
上述技术方案中的试剂盒即是采用本发明方法制备得到的pct试剂盒，采用双抗体夹心法进行测定，一支抗pct抗体包被在芯片反应腔内，作为固定相，另一支抗pct抗体包被在荧光微球上，免疫微球预先抽干固定在微流控芯片内，当样本加入微流控芯片加样口时，通过气泵样本流进微流道内部，样本中的pct抗原待测物先后与荧光微球上包被抗体和芯片上捕获抗体反应。在反应腔室内超声混匀反应后，清洗除去多余未结合的抗原和荧光微球，通过对芯片在360nm波长下激发，检测捕获的荧光微球在615nm下的荧光，测定其产生的荧光信号，以相对发光单位(rlu)进行表示。样本中的pct抗原浓度与仪器测定的rlu成一定的函数关系，通过自动计算获得浓度值。
采用时间分辨荧光作为荧光标示物，检测信号在受到外界光源时才产生荧光信号，因此检测步骤与清洗混匀步骤可以独立存在，互相不受影响。时间分辨荧光物质的荧光强度以及量子产率不受激发次数荧光，可以多次读数。微流控芯片反应腔室的设计采用透明的光学器件，无需额外添加搅拌子就可实现混匀效果，可以有效的检测光信号；将试剂的废液舱集成在芯片内部，反应结束后，无需额外的废液收集瓶或者排水装置，大大降低了样本的污染性，并且缩小了仪器的体系；全血过滤的加样口，通过水滴形的滤血纸以及通孔回气装置，全血样本可以有效过滤形成血浆样本进行检测，避免了额外的离心对血样的处理步骤。
本发明要解决的另一个问题是提供一种基于微流控芯片检测降钙素原pct的方法，采用前述基于微流控芯片的降钙素原pct试剂盒的制备方法得到的试剂盒，包括以下步骤：
(1)移液器加样，吸取100μl的样本加入加样孔内，将微流控芯片进入检测仪器内，气路装置缓慢充气，推动样本往前移动，气体由透气口流出，液体在以ps为基材的微流控芯片内流入反应腔室内，样本接触反应舱室末端的导电橡胶，电容变化会触动，关闭流道阀门，同时关闭气路开关，停止加压；
(2)仪器开启超声装置，超声混匀3-10分钟，超声探头置于三层芯片底部，位于反应腔室的前端部分，避免直接超声芯片包被抗体的影响，反应结束后气体推动样本进行向前移动，吹干加样孔和流道样本，清洗液路装置启动，进入反应腔室内，混匀1-3分钟，进行清洗；加样口处的气体推动清洗液继续进行移动，吹干反应腔室和流道液体；
(3)开启激发光源，对免疫反应结合固定的荧光微球进行测定，仪器读取芯片反应腔室的下面部分荧光强度，获得数据后通过计算并给出相应结果报告。
样本或样本稀释液通过加样口(微流控芯片的中层)进入微流控芯片内部，对加样口附加一定的压力，液体流入反应腔室后，预先接触烘干状态的荧光微球标记物，通过导电橡胶控制反应腔室内的液体总量，停止加样口的压力，对芯片的反应舱室进行超声处理，使得芯片上包被抗体与荧光微球标记物待测物质进行混合反应，反应时间在5-10分钟即可达到反应的平台期；反应结束后，通过微流控芯片的侧口对芯片内部注入清洗液，将多余的样本以及荧光标记物清洗至废液回收区，清洗后，再由芯片侧口注入一段空气，排除腔室内的清洗液；清洗步骤重复三次，待清洗结束后，直接对芯片进行激光激发检测，通过计算免疫反应结合上的荧光微球含量，推算出样本中待测物的含量，因此可以分析计算样本中待测物的浓度。
具体实施方式
下面结合本发明的实施方式进一步详细说明：
本发明的基于微流控芯片的降钙素原pct试剂盒，包括有微流控芯片，还包括有定标品，所述定标品由a组分和b组分构成，其中，定标品稀释液即为定标品a组分，浓度为0.5ng/ml；定标品b组分为用所述定标品稀释液将pct抗原母液稀释至2ng/ml；荧光微球标记的抗体试剂在所述微流控芯片内进行干燥存放；另一pct抗体包被在微流控芯片反应腔内。
在本实施例中，基于微流控芯片降钙素原pct试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)微流控芯片包被：取pct抗体m7402(北京中科京达生物技术有限公司)，加入至ph9.6的cb缓冲液中，按照单个芯片25μl加入微流控芯片的反应腔室内，温浴后对芯片进行清洗；
(2)荧光微球标记：取pct抗体m7413(北京中科京达生物技术有限公司)加入至荧光微球溶液中，并涡旋混匀，其中，荧光微球是经过活化处理的，反应结束后，加入终止液对反应进行终止，后离心清洗，加入封闭液进行封闭，封闭后的荧光微球进行离心清洗，使用微球储存液进行保存；
(3)微流控芯片组装：向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理，封闭液添加后在烘箱下进行烘干处理，在封闭后的中层芯片背部反应腔室下部内加入所述步骤(2)中的荧光微球溶液，于真空烘箱中真空干燥，荧光微球在芯片中呈现小液滴形态，不发生扩散；
芯片准备完毕后采用超声键合的方式，依据芯片结构依次将滤血垫，加样密封垫，导电橡胶，吸水纸以及密封圈加入芯片内部，将下层芯片按照超声键合线完成合并；
(4)定标品的制备：定标品由a组分和b组分构成；
根据抗原浓缩液的估算浓度，用定标品稀释液将抗原浓缩液稀释作为定标品抗原母液备用；
定标品稀释液即为定标品a组分，浓度为0.5ng/ml，2-8℃保存；
定标品b组分：用定标品稀释液将pct抗原母液稀释至2ng/ml，2-8℃保存；
(5)得基于微流控芯片的降钙素原pct试剂盒。
在本实施例中，定标品稀释液主要为tris-hcl的缓冲体系，浓度为50mm，ph8.5，包含牛血清、bsa、表面活性剂rpe1740、rpe2520以及叠氮钠。
其中，在上述步骤(3)中，稀释标记crp抗体微球，预先将微球水浴超声混匀，取20微升微球+80微升抽干保存液，混匀水浴超声，在封闭好的芯片下层反应槽正中间加5微升微球，真空干燥30min。将处理好的芯片组装起来，超声键合。最后铝箔袋保存并加入干燥剂。
在所述步骤(2)中，所述荧光微球活化处理的方法为：称取edc使用mes缓冲液配置成为1mg/ml的溶液，量取1mg羧基荧光微球，微球固含量为10mg/ml，体积即为50μl，置于ep管中，加入0.45mlmes缓冲液稀释，从1mg/ml的edc活化剂溶液中取5μl迅速加入微球溶液中，涡旋混匀，于超声清洗器中超声10min，后置于滚轴混匀器上震荡反应20min，总反应时间为30min。
在所述步骤(3)中，所述封闭液含有2％bsa、0.5％tween-20、10％海藻糖以及0.2％甘露醇。
在所述步骤(3)中，封闭处理的方法为：向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理，其中中层芯片的背面反应腔室内需要添加6μl+6μl的封闭液进行封闭，下层正面的反应腔室内，分别需要添加5μl+5μl+5μl的封闭液进行封闭。
在所述步骤(3)中，所述微流控芯片为三片式结构，包括由上到下依次层叠的上层芯片、中层芯片以及下层芯片；上层芯片、中层芯片以及下层芯片两两之间均通过定位柱、定位孔配合连接的方式实现相互间的层叠。
在本实施例中，定标品的制备：根据抗原浓缩液的估算浓度，用定标品稀释液将抗原浓缩液稀释至一定浓度(如500ng/ml)，作为定标品抗原母液备用。抗原母液-20℃以下保存，有效期十二个月。
取定标品抗原母液，将其用定标品稀释液以一定的稀释比例稀释，稀释比例至少为2个以上(如稀释比例为1:10,1:100)。将上述配制好的两个pct定标品抗原母液稀释度用参比体系的试剂进行定值或上一批次pct校准品建立的曲线测定定标品抗原母液各稀释度的pct浓度，测定至少复孔，将结果乘以各自的稀释倍数后得出各自的定标品抗原母液浓度，将所有定标品抗原母液浓度结果取平均值后得到定标品抗原母液的估算浓度。
使用bsa(一种牛血清白蛋白，分子量67kd，与人血清中主要成分has较为类似)作为主要成本，配制成一种稀释液，为了对比该稀释液与血清之间的差距，进行稀释梯度和稳定性的对比，首先将pct抗原稀释到终浓度为100ng/ml附近，然后使用上述对应稀释液分别梯度稀释，比较稀释梯度，如下：
根据上述方法及实验的结果，确定使用该稀释液作为人血清的替代品，并且符合实验要求。
定标品a的制备
定标品稀释液即为定标品a，浓度为0.5ng/ml，2-8℃保存。
定标品b的制备
用定标品稀释液将pct抗原母液稀释至2ng/ml，2-8℃保存。
另外，在本实施例中，微球标记抗体时，使用不同的标记缓冲液差异显著，通过对比优选50mmol/lph＝5.6的mes缓冲液为标记缓冲液，具体实验数据整理如下：
基于微流控芯片检测降钙素原pct的方法，采用上述基于微流控芯片的降钙素原pct试剂盒的制备方法得到的试剂盒，包括以下步骤：
(1)移液器加样，吸取100μl的样本加入加样孔内，将微流控芯片进入检测仪器内，气路装置缓慢充气，推动样本往前移动，气体由透气口流出，液体在以ps为基材的微流控芯片内流入反应腔室内，样本接触反应舱室末端的导电橡胶，电容变化会触动，关闭流道阀门，同时关闭气路开关，停止加压；
(2)仪器开启超声装置，超声混匀3-10分钟，超声探头置于三层芯片底部，位于反应腔室的前端部分，避免直接超声芯片包被抗体的影响，反应结束后气体推动样本进行向前移动，吹干加样孔和流道样本，清洗液路装置启动，进入反应腔室内，混匀1-3分钟，进行清洗；加样口处的气体推动清洗液继续进行移动，吹干反应腔室和流道液体；
(3)开启激发光源，对免疫反应结合固定的荧光微球进行测定，仪器读取芯片反应腔室的下面部分荧光强度，获得数据后通过计算并给出相应结果报告。
通过对反应温度，反应时间等实验参数进行优化，依照灵敏度以及信噪比的结果进行确认反应参数，反应温度优化检测记录：
反应温度优化检测记录：
在本实施例中，使用微流控芯片作为检测平台，进行了pct项目的检测，与免疫层析平台的pct项目对比，检测试剂的灵敏度有极大的提高，并且由于在免疫反应采用了均相的反应体系，超声混匀的反应模式对比层析试纸上的单一反应线性，在检测准确度上有了极大的改善；将荧光微球标记抗体试剂在芯片内进行干燥存放，采用了隔离缓冲液组分，可以有效隔断液体试剂，使其不易发生随意的流动，同时在加入样本以及稀释液时可以迅速溶解并保持原有的生物活性。隔离缓冲液同时还起到防止荧光标记物在芯片内的吸附的作用，荧光标记物由于不直接与芯片接触，因此降低了非特异性的吸附。
使用了探头超声作为微流控芯片的混匀方法，超声作用于芯片的左侧方，在不影响芯片的光洁度的光学性能前提上，超声的能量传递又将在反应腔室内将荧光微球标记抗体进行复溶并反应，在单一腔室内单一液体的反应保证了无交叉污染。超声处理的作用可将免疫反应的效率大大的提高，由常规反应的30分钟或以上降低至5-10分钟即达反应的平台期。
在微流控芯片上使用了侧路气体清洗以及液体清洗的清洗模式，使用密封垫圈，在保证侧口不发生漏液的前提下，通过外压将清洗液或者压缩空气注入反应芯片腔室内部的方法，一方面简化了芯片的结构，避免芯片内出现多个腔室，另一方面消除了微流控芯片内产生气泡，并在反应腔室内起到充分清洗的效果，有效避免了液体的回流以及样本交叉污染；采用时间分辨荧光作为荧光标示物，检测信号在受到外界光源时才产生荧光信号，因此检测步骤与清洗混匀步骤可以独立存在，互相不受影响。时间分辨荧光物质的荧光强度以及量子产率不受激发次数荧光，可以多次读数。芯片反应腔室的设计采用透明的光学器件，无需额外添加搅拌子就可实现混匀效果，可以有效的检测光信号。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。