本发明属于过程分析技术领域，尤其涉及一种银杏叶提取物粗品柱层析精制方法及应用。
背景技术：
银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L.)的干燥叶，2015年版《中国药典》记载银杏叶具有活血化瘀，通络止痛，敛肺平喘，化浊降脂的功效，主要用于淤血阻络，胸痹心痛，中风偏瘫，肺虚咳嗽，高脂血症的治疗。银杏叶中有效成分主要是黄酮醇苷类化合物和萜类内酯类化合物，具有很高的保健和药用价值。
国内以银杏叶作为原料制成的中药制剂品种繁多，有片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、口服液和注射剂等。目前国家食品药品监督管理总局批准的数十种银杏叶制剂的成药形式均是将银杏叶提取物与其他辅料混合形成，如舒血宁注射液。对于银杏叶提取物的研制开发，已从有效成分的总提取物浓缩制剂发展到了对黄酮醇苷、内酯和银杏酸含量限定标准的新产品。银杏叶提取物是一个比较复杂的化合物富集产品，除主要活性成分外，其含有无机物到有机物、从极性到非极性、从小分子到生物大分子的各种成分，据不完全统计银杏叶中含有240多个化学成分，其提取分离纯化多用到了柱层析。而现有技术中，银杏叶柱层析时洗脱的终点或收集的起点的判断主要依靠操作人员的技术经验，根据颜色来决定何时开始收集，难以准确保证生产过程中批间的稳定性和均一性，容易造成批间差异，从而影响产品质量。
技术实现要素：
针对现有技术中人为判断柱层析过程的收集起点会造成批间差异的问题，本发明提供一种银杏叶提取物柱层析过程中黄酮类成分收集起点的确定方法。
以及，本发明还提供一种银杏叶提取物粗品柱层析精制方法。
以及，本发明还提供按上述精制方法精制得到的银杏叶提取物在制备注射液、片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液领域的应用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下技术方案：
一种银杏叶提取物柱层析过程中黄酮类成分收集起点的确定方法，包括以下步骤：
步骤a、向待精制的银杏叶提取物中加纯化水制成含有所述银杏叶提取物3～5wt％的银杏叶提取物溶液；
步骤b、将所述银杏叶提取物溶液加入到层析柱中，用乙醇溶液洗脱，每0.8～1.2min收集一次洗脱液样品；
步骤c、测定每个所述洗脱液样品中黄酮类成分的含量；
步骤d、测定每个所述洗脱液样品在特定波长的紫外吸光度，所述特定波长为黄酮类成分的最大吸收波长；
步骤e、根据每个所述洗脱液样品中所述黄酮类成分含量以及对应的所述紫外吸光度，紫外吸光度增长率＞10％的洗脱液收集时间点即为洗脱液的收集起点。
本发明采用通过紫外吸光度与黄酮类成分含量的对应关系来确定紫外吸光度的增长与黄酮类成分含量的增加有关，而黄酮类成分的增加代表银杏叶提取物开始被洗脱，故将紫外吸光度开始增加的洗脱液收集时间点作为收集起点，可以使收集的时间范围更加明确，避免人为经验判断的误差。本发明采用紫外分光光度法进行洗脱样品的测定，样品处理简单、分析快速，可以在银杏叶提取物柱层析精制过程中进行实时监测，从而快速判断洗脱的收集起点，从而保证精制后的银杏叶提取物中黄酮类成分的含量稳定性和均一性，得到高品质的精制产品。
以及，本发明还提供一种银杏叶提取物粗品柱层析精制方法，包括以下步骤：
向待精制的银杏叶提取物粗品中加纯化水制成含有所述银杏叶提取物粗品3～5wt％的银杏叶提取物粗品溶液；
将所述银杏叶提取物粗品溶液加入到层析柱中，用乙醇溶液洗脱，并对洗脱液在特定波长进行紫外吸光度的检测，所述特定波长为黄酮类成分的最大吸收波长；
按照上述精制方法确定银杏叶提取物柱层析过程中黄酮类成分的收集起点，从所述收集起点开始收集洗脱液，至洗脱液全部流出，即得柱层析精制后的银杏叶提取物。
本发明通过快速检测判断洗脱液收集起点，避免了人员主观判断间的差异，保证了批间的含量的稳定和均一，也避免了多收集空白洗脱液造成收集体积过大增加浓缩时长等问题。
以及，本发明还提供按上述精制方法精制得到的银杏叶提取物在制备注射液、片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液领域的应用。
由于经过本发明所提供的精制方法精制得到的银杏叶提取物的含量稳定、均一，因此后续根据实际需要进一步进行精制或制剂时，避免加入浓缩、稀释等操作，减少了工艺环节，并可以对后续工序的工艺参数进行标准化制定，保证了终产品的质量稳定性。
附图说明
图1为洗脱溶剂的紫外扫描图；
图2为实施例1聚酰胺树脂柱精制所得洗脱液的紫外扫描图；
图3为实施例2大孔吸附树脂柱精制所得洗脱液的紫外扫描图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种银杏叶提取物柱层析过程中黄酮类成分收集起点的确定方法，包括以下步骤：
步骤a、向待精制的银杏叶提取物中加纯化水制成含有所述银杏叶提取物3～5wt％的银杏叶提取物溶液；
步骤b、将所述银杏叶提取物溶液加入到层析柱中，用乙醇溶液洗脱，每0.8～1.2min收集一次洗脱液样品；
步骤c、测定每个所述洗脱液样品中黄酮类成分的含量；
步骤d、测定每个所述洗脱液样品在特定波长的紫外吸光度，所述特定波长为黄酮类成分的最大吸收波长；
步骤e、根据每个所述洗脱液样品中所述黄酮类成分含量以及对应的所述紫外吸光度，紫外吸光度增长率＞10％的洗脱液收集时间点即为洗脱液的收集起点。
由于层析柱中固定相的材质、层析柱的内径、洗脱液的极性、洗脱流速等均会影响黄酮类成分洗脱下来的速度，若仅凭人为经验来判断洗脱液的收集时间，则会造成收集到的溶液中含量不均匀。若从头开始收集，则会收集到大量空白洗脱液，会降低收集所得到的洗脱液中黄酮类成分的含量，后续还需增加浓缩等工序以提高含量来满足生产所需。本发明将紫外吸光度增长率＞10％的洗脱液收集时间点作为收集起点，可以使收集起点更加明确，避免人为经验判断的误差。本发明采用紫外分光光度法进行洗脱样品中黄酮成分的含量测定，可以在银杏叶提取物柱层析精制过程中进行实时监测，快速判断洗脱的收集起点，从而保证精制后的银杏叶提取物中黄酮类成分的含量稳定性和均一性，得到高品质的精制产品。
具体的，上述步骤b中所述柱层析使用的层析柱主要包括聚酰胺树脂柱、大孔吸附树脂柱。黄酮类化合物富含酚羟基，酚羟基与聚酰胺分子中的酰胺基能够形成氢键缔合而产生吸附，当移动相中的溶剂分子与聚酰胺或黄酮类化合物形成氢键缔合时，聚酰胺与黄酮类化合物之间的氢键缔合则随之减弱而被洗脱。大孔吸附树脂有多孔性结构使其对分子大小不同的物质具有筛选作用，还有巨大的比表面，通过它与待分离物质的分子之间的范德华引力大小以及待分离物质的分子量，经一定的溶剂洗脱来进行分离、纯化、除杂。
进一步优选的，所述乙醇溶液为体积浓度为40～80％的乙醇溶液。该浓度的乙醇溶液对于层析柱和银杏叶提取物中的黄酮类成分，极性适中，可以更好地进行洗脱，并且乙醇残留相对于其他极性溶剂而言，更容易控制和去除，对人体更为安全。
进一步优选的，所述黄酮类成分为总黄酮醇苷，该成分为银杏叶提取物中的重要有效成分，且极性较大，更容易被洗脱，因此可以代表银杏叶提取物洗脱的情况，当黄铜总醇苷开始被洗脱时，可以认为银杏叶提取物开始被洗脱。
进一步优选的，测定黄酮类成分含量的方法为高效液相色谱法。由于黄酮类化合物中的黄酮醇苷存在紫外吸收，因此可以用高效液相色谱法进行含量测定，用所得测定结果与紫外吸光度进行对比，可以得知紫外吸光度与含量之间的对应关系，从而可以根据该对应关系来确定洗脱液的收集起点。
进一步优选的，所述高效液相色谱法的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇与0.4wt％磷酸溶液的混合液为流动相，检测波长为360nm，其中所述甲醇与所述0.4wt％磷酸溶液的体积比为50:50，该色谱条件分离度良好、流动相与银杏叶提取物不相互作用、检测波长接近黄酮类成分的最大吸收波长。
上述步骤d中所述测定每个所述洗脱液样品在特定波长的紫外吸光度的方法为：对所述洗脱液样品进行全波长扫描，确定黄酮类成分存在的最大吸收波长；用纯化水稀释所述洗脱液样品，在所述最大吸收波长下测定稀释后的洗脱液样品的紫外吸光度。由于银杏叶为植物，其黄酮类各成分的含量受采集时间、采集地点、提取方法等多因素的影响，故紫外吸光度可能会有所波动，通过全波长扫描，可以确定待测批次的银杏叶提取物黄酮类成分的最大吸收波长，进而可以在该波长处进行紫外吸光度的测定，快速得出待测洗脱液中黄酮类成分的含量变化趋势。用纯化水进行稀释，对测定结果不会产生影响。
以及，本发明实施例还提供一种银杏叶提取物粗品柱层析精制方法，包括以下步骤：
向待精制的银杏叶提取物粗品中加纯化水制成含有所述银杏叶提取物粗品3～5wt％的银杏叶提取物粗品溶液；
将所述银杏叶提取物粗品溶液加入到层析柱中，用乙醇溶液洗脱，并对洗脱液在特定波长进行紫外吸光度的检测，所述特定波长为黄酮类成分的最大吸收波长；
按照上述精制方法确定银杏叶提取物柱层析过程中黄酮类成分的收集起点，从所述收集起点开始收集洗脱液，至洗脱液全部流出，即得柱层析精制后的银杏叶提取物。
本发明从确定好的收集起点开始收集洗脱液，收集至洗脱液全部流出，使收集所得的银杏叶提取物溶液的含量稳定而均一，可以避免后续通过增加浓缩或稀释操作来调整含量，从而可以提高生产效率。
以及，本发明还提供按上述精制方法精制得到的银杏叶提取物在制备注射液、片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液领域的应用。
为了更好的说明本发明实施方式，下面通过实施例做进一步的举例说明。
实施例1
本实施例提供了一种银杏叶提取物粗品柱层析精制方法及其在舒血宁注射液生产过程中的应用。
步骤a、向待精制的银杏叶提取物中加纯化水制成含有所述银杏叶提取物3wt％的银杏叶提取物溶液；
步骤b、将所述银杏叶提取物溶液加入到聚酰胺树脂柱中，用40％乙醇溶液洗脱，每0.8min收集一次洗脱液样品；
步骤c、将洗脱液样品稀释5倍后，用高效液相色谱法测定每个稀释后的洗脱液样品中黄酮类成分含量(按标示量0.84mg/ml来计算)，色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇与0.4wt％磷酸溶液的混合液为流动相，检测波长为360nm，其中所述甲醇与所述0.4wt％磷酸溶液的体积比为50:50；
步骤d、对前3个洗脱液样品进行全波长扫描，扫描图如图2所示，确定黄酮类成分存在的最大吸收波长；用纯化水将各洗脱液样品稀释4000倍后，在所述最大吸收波长处测定稀释后的洗脱液样品的紫外吸光度；黄酮类成分含量以及对应的所述紫外吸光度明显变化处的检测结果见表1；
表1 聚酰胺柱洗脱过程含量及紫外吸光度
以紫外吸光度增长率＞10％的洗脱液收集时间点作为洗脱液的收集起点；
步骤e、从上述收集起点开始收集洗脱液，收集至洗脱液全部流出，得到提取物重量的6～10倍体积的洗脱液，即得柱层析精制后的银杏叶提取物药液。
步骤f、将精制后的银杏叶提取物药液经进一步加工，再进一步制备得到舒血宁注射液。
实施例2
本实施例提供了一种银杏叶提取物粗品柱层析精制方法及其在舒血宁注射液生产过程中的应用。
步骤a、向待精制的银杏叶提取物中加纯化水制成含有所述银杏叶提取物5wt％的银杏叶提取物溶液；
步骤b、将所述银杏叶提取物溶液加入到大孔吸附树脂柱中，用80％乙醇溶液洗脱，每1.2min收集一次洗脱液样品；
步骤c、将洗脱液样品稀释5倍后，用高效液相色谱法测定每个稀释后的洗脱液样品中黄酮类成分含量(按标示量0.84mg/ml来计算)，色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇与0.4wt％磷酸溶液的混合液为流动相，检测波长为360nm，其中所述甲醇与所述0.4wt％磷酸溶液的体积比为50:50；
步骤d、对前3个洗脱液样品进行全波长扫描，扫描图如图3所示，确定黄酮类成分存在的最大吸收波长；用纯化水将各洗脱液样品稀释4000倍后，在所述最大吸收波长处测定稀释后的洗脱液样品的紫外吸光度；黄酮类成分含量以及对应的所述紫外吸光度明显变化处的检测结果见表2；
表2 大孔吸附树脂柱洗脱过程含量及紫外吸光度
以紫外吸光度增长率＞10％的洗脱液收集时间点作为洗脱液的收集起点；
步骤e、从上述收集起点开始收集洗脱液，得到提取物重量的12～15倍体积的洗脱液，即得柱层析精制后的银杏叶提取物药液。
步骤f、将精制后的银杏叶提取物药液经进一步加工，再进一步制备得到舒血宁注射液。
实施例3
本实施例以总黄酮醇苷含量为考察指标，对精制后的银杏叶提取物含量进行批间一致性考察，结果见表3；
表3 精制后的银杏叶提取物药液含量的批间一致性考察
由表3结果可见，采用本发明所提供的银杏叶提取物粗品柱层析精制方法所得到的10批精制后的银杏叶提取物中总黄酮醇苷含量均值为2.70mg/ml，RSD为2.56％，说明本发明所提供的银杏叶提取物粗品柱层析精制方法能在对银杏叶精制溶液的含量以及银杏叶制剂的中间过程起到良好的控制作用，保证了精制后的银杏叶提取液批间含量的一致性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。