本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及一种促肾上腺皮质激素化学发光检测试剂盒。
背景技术：
促肾上腺皮质激素(ACTH)是一种由39个氨基酸组成的肽类激素，分子量约为4.5kD。促肾上腺皮质激素在垂体中产生，作用于肾上腺皮质，具有促进肾上腺皮质组织增生、皮质激素生成和分泌的作用。促肾上腺皮质激素的分泌受下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子(CRH)、皮质醇、自身负反馈等多种因素的调节。
促肾上腺皮质激素检测对于鉴别诊断肾上腺功能减退和分泌亢进很有价值。促肾上腺皮质激素水平增高见于：Addison病(原发性肾上腺功能不全)、促肾上腺皮质激素不敏感综合征及促肾上腺皮质激素受体异常，垂体瘤引起的继发Cushing病，双侧肾上腺皮质增生(Nelson综合征)、脑垂体原发或继发性促肾上腺皮质激素腺瘤，异位促肾上腺皮质激素分泌综合征、肺癌、神经性喂食、妊娠、应激状态等。促肾上腺皮质激素水平降低见于：下丘脑垂体功能减退、垂体卒中，手术切除垂体、垂体柄切除术、垂体促肾上腺皮质激素肿瘤，原发性Cushing病，肾上腺皮质肿瘤、应用大剂量皮质激素，继发于垂体功能减低的肾上腺皮质功能减退症(Simmonds-Sheehan综合征)等。促肾上腺皮质激素水平显现昼夜变化，表现为清晨时浓度高，夜间时浓度低。因此，样本采集时间非常重要，通常为早晨7-10点。
在国内，促肾上腺皮质激素检测在临床上主要以化学发光免疫分析法为主，但由于具有自主知识产权的国产促肾上腺皮质激素检测试剂盒目前还比较少，而且灵敏度较低，试剂成本高，目前一般只在三甲医院有开展，在三甲以下医院开展较少，因此有待开发对促肾上腺皮质激素检测灵敏度高、准确度好并且能降低检测成本的检测技术。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供一种促肾上腺皮质激素化学发光检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括缓冲液、磁微粒、生物素标记的抗促肾上腺皮质激素单克隆抗体和和多羟基醇；和所述试剂2包括缓冲液、吖啶酯标记的抗促肾上腺皮质激素单克隆抗体和多羟基糖。
在一些实施方式中，所述试剂1包括0.2mg/mL～0.4mg/mL磁微粒、2μg/mL～8μg/mL生物素标记的抗促肾上腺皮质激素单克隆抗体和和5g/L～50g/L甘露醇或山梨糖醇；和所述试剂2包括0.1μg/mL～0.4μg/mL吖啶酯标记的抗促肾上腺皮质激素单克隆抗体和5g/L～50g/L海藻糖或蔗糖。在一些实施方式中，所述试剂1包括0.2mg/mL～0.3mg/mL磁微粒或0.3mg/mL～0.4mg/mL磁微粒；2μg/mL～4μg/mL、4μg/mL～6μg/mL或6μg/mL～8μg/mL生物素标记的抗促肾上腺皮质激素单克隆抗体和和5g/L～10g/L、10g/L～20g/L、20g/L～30g/L或40g/L～50g/L甘露醇或山梨糖醇；和所述试剂2包括0.1μg/mL～0.2μg/mL、0.2μg/mL～0.3μg/mL、0.3μg/mL～0.4μg/mL吖啶酯标记的抗促肾上腺皮质激素单克隆抗体和5g/L～10g/L、10g/L～20g/L、20g/L～30g/L或40g/L～50g/L海藻糖或蔗糖。
在一些实施方式中，所述试剂1的缓冲液是pH6.5～7.5、5mM～100mM的PBS缓冲液；所述试剂2的缓冲液是pH5.8～6.7、10mM～100mM的2-吗啡乙磺酸缓冲液。在一些实施方式中，所述试剂1的缓冲液是pH6.5～7.5、10mM～20mM、20mM～40mM、40mM～60mM、60mM～80mM或80mM～100mM的PBS缓冲液；所述试剂2的缓冲液是pH5.8～6.7、10mM～100mM的2-吗啡乙磺酸缓冲液。在一些实施方式中，所述试剂2的缓冲液是pH5.8～6.7、10mM～20mM、20mM～40mM、40mM～60mM、60mM～80mM或80mM～100mM的2-吗啡乙磺酸缓冲液。
在一些实施方式中，所述试剂1包括5g/L～50g/L牛血清白蛋白、10～20g/L甘露醇、5mL/L～20mL/L丙三醇、0.05mL/L～0.2mL/L TritonX-100、10mg/L～50mg/L 4-氨基安替比林、0.2～1.0mg/mL阻断剂和0.5mL/L～5mL/L proclin-300。在一些实施方式中，所述试剂1包括5g/L～10g/L、10g/L～20g/L、20g/L～30g/L、30g/L～40g/L或40g/L～50g/L牛血清白蛋白；10～15g/L或15～20g/L甘露醇、5mL/L～10mL/L、10mL/L～15mL/L或15mL/L～20mL/L丙三醇；0.05mL/L～0.1mL/L或0.1mL/L～0.2mL/L TritonX-100、5mg/L～10g/L、10mg/L～20mg/L、20mg/L～30mg/L、或40mg/L～50mg/L 4-氨基安替比林；0.2～0.5mg/mL或0.5～1.0mg/mL阻断剂；和0.5mL/L～5mL/L、0.5mL/L～1mL/L、1mL/L～2mL/L、2mL/L～3mL/L、3mL/L～4mL/L或4mL/L～5mL/L proclin-300。
在一些实施方式中，所述试剂1包括0.4mg/mL磁微粒、4μg/mL生物素标记的抗促肾上腺皮质激素单克隆抗体、0.5mg/mL阻断剂、20mM pH7.4PBS缓冲溶液、10g/L牛血清白蛋白、20g/L甘露醇、10mL/L丙三醇、0.1mL/L TritonX-100、20mg/L 4-氨基安替比林和1mL/L proclin-300；和更优选地所述阻断剂是羊IgG抗体。
在一些实施方式中，所述试剂2还包括5g/L～20g/L酪蛋白、5mL/L～20mL/L丙三醇、0.05mL/L～0.2mL/L TritonX-100、0.5mL/L～5mL/L proclin-300和10mg/L～50mg/L 4-氨基安替比林。在一些实施方式中，所述试剂2还包括5g/L～10g/L、10g/L～15g/L或15g/L～20g/L酪蛋白；5mL/L～10mL/L、10mL/L～15mL/L或15mL/L～20mL/L丙三醇；0.05mL/L～0.2mL/L、0.05mL/L～0.1mL/L或0.1mL/L～0.2mL/L TritonX-100；0.5mL/L～5mL/L、0.5mL/L～1mL/L、1mL/L～2mL/L、2mL/L～3mL/L、3mL/L～4mL/L或4mL/L～5mL/L proclin-300；和10mg/L～50mg/L、10mg/L～15mg/L、15mg/L～20mg/L、20mg/L～30mg/L或40mg/L～50mg/L 4-氨基安替比林。试剂中各组份是组合起来发挥作用，有效降低了试剂背景信号，提高了试剂的灵敏度、稳定性。
在一些实施方式中，所述试剂2包括0.2μg/mL吖啶酯标记的抗促肾上腺皮质激素单克隆抗体、20mM pH6.0 2-吗啡乙磺酸、9.0g/L氯化钠、10g/L酪蛋白、10g/L海藻糖、10mL/L丙三醇、0.1mL/L TritonX-100、1mL/L proclin-300和20mg/L 4-氨基安替比林。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品包括2-吗啡乙磺酸缓冲液、促肾上腺皮质激素抗原、氯化钠、酪蛋白、海藻糖、丙三醇、TritonX-100、proclin-300和4-氨基安替比林。
在一些实施方式中，所述校准品包括25pg/mL或500pg/mL促肾上腺皮质激素抗原、10mM～100mM、pH5.5～pH6.7 2-吗啡乙磺酸缓冲溶液、5g/L～20g/L酪蛋白、5g/L～50g/L海藻糖、5mL/L～50mL/L丙三醇、0.05mL/L～0.5mL/L TritonX-100、0.5mL/L～2mL/L proclin-300和5mg/L～50mg/L 4-氨基安替比林。
在一些实施方式中，所述校准品包括25pg/mL或500pg/mL促肾上腺皮质激素抗原、20mM pH6.0 2-吗啡乙磺酸缓缓冲液、9.0g/L氯化钠、10g/L酪蛋白、20g/L海藻糖、10mL/L丙三醇、0.1mL/L TritonX-100、1mL/L proclin-300和20mg/L 4-氨基安替比林。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液；所述A液为H2O2溶液，所述B液为NaOH溶液。
本发明中通过试剂1和试剂2中各个组分的选择，不仅使本发明试剂盒在使用中信号背景大大降低，而且信号强度显著增加；试剂盒的灵敏度、稳定性、准确性显著增加。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例一:促肾上腺皮质激素单克隆抗体包被的亲和素化的磁微粒(试剂1)的制备
1.生物素化的促肾上腺皮质激素单克隆抗体制备
取1.0mg的促肾上腺皮质激素单克隆抗体，用磷酸盐缓冲液(20mM pH7.4)稀释至0.5mg/mL，然后加入25μL浓度为2.5mM/L的生物素酯，室温下反应30min，再加入20μL浓度为1M的Tris溶液，室温下反应10min，最后用磷酸盐缓冲液(20Mm pH 7.4)透析16-24小时，取透析后的液体即得到生物素化的促肾上腺皮质激素单克隆抗体。
2.生物素化抗体包被亲和素磁微粒
取100mg亲和素化的磁微粒悬浮液，磁分离去上清，用连接缓冲液(20mM PBS，10g/L BSA，20g/L甘露醇，10mL/L丙三醇，0.1mL/L TritonX-100，1mL/L proclin-300，20mg/L 4-氨基安替比林)清洗三次，然后用25mL连接缓冲液重悬，加入1.0mg生物素化的促肾上腺皮质激素单克隆抗体，室温下混悬30min，磁分离去上清，用连接缓冲液清洗一次后再重悬至25mL，然后加入0.2mL磁微粒封闭液(10μM/mL生物素，封闭液中按体积是50％丙三醇，50％二甲基亚砜)室温下混悬30min，磁分离去上清，用连接缓冲液清洗三次后重悬至250mL，即得到0.4mg/mL促肾上腺皮质激素单克隆抗体包被的亲和素化的磁微粒。类似地，依照上述方法也制备了得到0.2mg/mL和0.3mg/mL促肾上腺皮质激素单克隆抗体包被的亲和素化的磁微粒。
实施例二:吖啶酯标记的促肾上腺皮质激素单克隆抗体(试剂2)的制备
取1.0mg促肾上腺皮质激素单克隆抗体，用磷酸盐缓冲液(20mM pH7.4)稀释至1.0mg/mL，然后加入100μL浓度为2mM/L的吖啶酯，室温下避光混匀反应30min，然后加入100μL浓度10mg/mL的赖氨酸溶液，室温下避光混匀反应10min，然后用脱盐柱离心脱盐纯化。收集离心管中的液体，即得到吖啶酯标记的促肾上腺皮质激素单克隆抗体。然后将上述得到的吖啶酯标记的促肾上腺皮质激素单克隆抗体用标记物稀释液稀释至浓度为2μg/mL，即得到试剂2。标记物稀释液是20mM pH6.0的2-吗啡乙磺酸溶液，含有9g/L氯化钠、10g/L酪蛋白、10g/L海藻糖、10mL/L丙三醇、0.1mL/L TritonX-100、1mL/L proclin-300和20mg/L 4-氨基安替比林。类似地，依照上述方法也制备了4μg/mL和8μg/mL吖啶酯标记的促肾上腺皮质激素单克隆抗体。
实施例三:促肾上腺皮质激素校准品制备
用校准品稀释液将促肾上腺皮质激素抗原配制成浓度为0pg/mL、5pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、125pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL。校准品稀释液是20mM pH6.0的2-吗啡乙磺酸溶液，含有9g/L氯化钠、10g/L酪蛋白、20g/L海藻糖、10mL/L丙三醇、0.1mL/L TritonX-100、proclin-300 1mL/L和20mg/L 4-氨基安替比林。
实施例四:促肾上腺皮质激素测定试剂盒的性能测试
本发明所述试剂盒适用于迈克生物的化学发光免疫分析仪：maccura i3000、maccura i3000L、maccura i3000S、maccura i2000、maccura i2000L、maccura i2000S、maccura i1000、maccura i1000L和maccura i1000S。方法学模式为双抗体夹心法，具体地：仪器依次加入50ul样品(样本)和50ul试剂1，混匀、反应15min后，洗涤3次，再加入100ul试剂2，混匀、反应15min，磁分离、洗涤3次后，仪器将反应杯送入暗室，依次加入发光底物液A液(H2O2溶液)、B液(NaOH溶液)进行发光反应，最后记录相对发光值(RLUs)。校准品信息通过条码扫描到分析仪上，分析仪通过扫描读取的校准品信息自动校准检测系统。
1.试剂盒的热稳定性实验
将试剂盒(包括试剂1、试剂2、校准品A(25pg/mL)、校准品B(500pg/mL))于37℃环境里分别处理7天和14天后，检测相应条件下的相对发光值(RLUs)，并与对照组2～8℃环境里的试剂盒比较，计算RLUs保留率。RLUs保留率与试剂盒效价呈正相关。
表1本发明试剂盒热稳定性结果
由以上数据可知，试剂盒在37℃的条件下处理7天后，RLUs保留率为(100±5)％，效价几乎不变；热处理14天后，RLUs保留率约80％，可见本发明试剂盒的稳定性性能非常好。
2.试剂盒的灵敏度(最低检测限)实验
参照CLSI EP17-A文件推荐实验方案，计算促肾上腺皮质激素化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度。具体方法如下：检测零浓度校准品20次，得到20次测定结果的信号值(RLUs)，计算其平均值M和标准差SD，得出M+2SD所对应的RLUs，根据零浓度校准品与相邻浓度校准品(5pg/mL)之间的浓度-RLUs值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的RLUs值带入上述方程中，计算得出对应的浓度，即最低检测限(LOB)。
按上述方法检测试剂最低检测限(LOB)为0.1394pg/mL，结果如下：
表2本发明试剂盒灵敏度结果1
当试剂1中含有甘露醇试剂2中无海藻糖，试剂盒中其它成分保持不变时，根据上述相同方法得当的试剂盒灵敏度为0.1512pg/mL；当试剂1中无甘露醇试剂2中含有海藻糖，试剂盒中其它成分保持不变时，试剂盒灵敏度为0.2372pg/mL；当试剂1无甘露醇试剂2无海藻糖，试剂盒中其它成分保持不变时，试剂盒灵敏度为0.4729pg/mL。结果如下表所示：
表3本发明试剂盒的灵敏度结果2
由以上数据可知，在试剂中加入甘露醇和海藻糖后试剂的灵敏度有明显提高。
依照上述方法，当试剂盒中其它组分不变时，改变试剂1中甘露醇浓度时，试剂盒灵敏度数据如下：
表4本发明试剂1中含不同浓度甘露醇的灵敏度结果
依照上述方法，当试剂盒中其它组分不变时，改变试剂2中海藻糖浓度时，试剂盒灵敏度数据如下：
表5本发明试剂2中含不同浓度海藻糖的灵敏度结果
由以上结果可见，当甘露醇和海藻糖浓度为5g/L～50g/L时，试剂盒灵敏度较好。
3.本发明试剂盒的准确度实验
在2份已知促肾上腺皮质激素浓度的临床人血浆样本中按1:9的体积比分别加入浓度为500pg/mL和2000pg/mL的校准品，计算回收率(公式：回收率＝(添加后样本浓度-临床样本浓度*0.9)/(添加校准品浓度*0.1))。结果显示，回收率在100～105％。
表6本发明试剂盒准确度结果
4.本发明试剂盒的特异性实验
促肾上腺皮质激素(1-24)是促肾上腺皮质激素的N端24肽，具有生物活性，在各类哺乳动物和人之间的氨基酸相同。促肾上腺皮质激素(1-24)具有高效、快速、剂量小的特点，非常适合于突发事件急救中使用。目前，促肾上腺皮质激素(1-24)已经用于癫痫、老年性痴呆及类风湿性关节炎等疾病的临床治疗上。所以，研究促肾上腺皮质激素(1-24)的交叉干扰是必要的。
具体方法如下：将高浓度促肾上腺皮质激素(1-24)按体积比1:9添加到已知促肾上腺皮质激素浓度的临床样本中，检测添加后的样本浓度，计算添加后样本浓度与添加前样本浓度的偏差，将偏差在±10％范围内判定为无交叉反应。结果表明，1×105pg/mL的促肾上腺皮质激素(1-24)与试剂盒无明显交叉反应，能满足测试要求。
表7试剂盒特异性实验结果
检测
实施例五:促肾上腺皮质激素不同组分对性能的影响实验
1.试剂1中BSA浓度对于试剂性能的影响实验
在试剂1组份不变，比较试剂1中含不同浓度BSA时校准品结果的信号值和信噪比，筛选出其中信号值和信噪比最优的条件。分别选用BSA浓度为0.5g/L、5g/L、10g/L、50g/L、100g/L的PBS(20mM pH7.4)缓冲液配制免疫标记物。搭配试剂2检测零浓度校准品、校准品A和校准品B的RLUs。结果如下：
表8不同浓度BSA时检测校准品结果
由以上结果可知，BSA浓度为5g/L-50g/L时校准品A和校准品B的信噪比较好，10g/L时最大，因此选择BSA浓度为10g/L的标记物缓冲液作为配制免疫标记物的最佳PBS缓冲液体系。
2.试剂1中TritonX-100浓度对于试剂性能的影响实验
在试剂1组份不变，比较试剂1中含有不同浓度TritonX-100时检测校准品结果的信号值和信噪比，筛选出其中信号值和信噪比最优的条件。分别选用TritonX-100浓度为0.025mL/L、0.05mL/L、0.1mL/L、0.2mL/L、0.4mL/L的PBS缓冲液(20mM pH7.4)配制的免疫标记物。搭配试剂2检测零浓度校准品、校准品A和校准品B的RLUs。结果如下：
表9不同浓度TritonX-100时检测校准品结果
由以上结果可知，TritonX-100浓度为0.05mL/L-0.2mL/L时校准品A和校准品B的信噪比较好，0.1mL/L时最佳，因此选择TritonX-100浓度为0.1mL/L的缓冲液作为配制免疫标记物的最佳TritonX-100浓度缓冲液体系。
3.试剂2中缓冲液对于试剂盒性能影响的实验(不同缓冲体系比较)
在试剂2中其他组分不变和其他实验条件不变的情况下，改变缓冲液，观察不同缓冲液对试剂2稳定性的影响。具体地：将用不同缓冲液配置的试剂2在37℃条件下处理7天后，搭配试剂1检测校准品A和校准品B的RULs,与对照组2～8℃比较，计算RLUs保留率。RLUs保留率与试剂2效价呈正相关。结果如下：
表10不同缓冲体系时稳定性试验结果
由以上结果可知，HEPES作为缓冲体系时，尽管校准品的信号值有明显的增加，但试剂2的热稳定性差；MES、PBS和Tris作为缓冲体系时，校准品的信号值相近，但MES配置的试剂2的热稳定性最好。
4.试剂2中缓冲液PH值对试剂性能影响的实验
以MES作为缓冲体系时，在试剂2组份不变的条件下，观察不同pH值对试剂2热稳定的影响。具体的：将用不同pH值的MES缓冲液(20mM)配制的试剂2与37℃条件下处理7天。搭配试剂1检测校准品A和校准品B的RULs,与对照组2～8℃比较，计算RLUs保留率。RLUs保留率与试剂2效价呈正相关。结果如下：
表11不同pH值缓冲体系时稳定性试验结果
由以上结果可知，以MES作为缓冲体系时，当pH值过低，如pH5.5时，校准品的信号值偏低；从校准品的信号值和RLUs保留率方面考虑，MES缓冲液的可用缓冲范围为pH5.8～6.7。
5.本发明试剂盒的类风湿因子(RF)样本干扰试验
RF是常见的免疫检测干扰物之一，对免疫检测产生的干扰具有随机性，且发生干扰的频率和强度与RF浓度无直接关系。本发明通过在包有抗促肾上腺皮质激素单克隆抗体中添加阻断剂，可在一定程度上消除或减弱RF的干扰效应。
具体方法：先用未加阻断剂的试剂盒检测100份RF临床样本，根据样本的测定浓度值，从中筛选出疑似出现干扰的样本37份，用加有0.5mg/mL阻断剂的试剂盒复测，并以罗氏的“促肾上腺皮质激素检测试剂盒(电化学发光法)”(Lot 19942501)检测的结果做参考。
表12类风湿因子(RF)样本干扰试验
综上所述，本发明所述试剂盒具有稳定性良好、灵敏度高、准确度高、不受类风湿因子干扰、操作使用简便、且成本较低的优点。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。