本发明属于稳定同位素测定领域，具体涉及一种硝酸盐氮氧同位素样品分析的前处理方法。
背景技术：
：氮是地球上生命体的必需元素，也是生命代谢活动的核心元素之一。在农业上，氮既是增产的要素也是土壤生产力的主要限制因素。19世纪氮肥工业的发展和农业应用，提高了作物产量，在保障粮食供给和世界人口增长中发挥了及其重要的作用，但与此同时，过高的农业氮肥投入也导致大量的活性氮进入环境，强烈的干扰了氮素的生物地球化学循环。据估算，人类活动导致进入生物圈的活性氮的量由1860年的15tg增加到1990年的156tg，大大超过了自然生态系统生物固氮的量，越来越多的活性氮因而进入到大气、土壤和水体中，造成一系列的生态环境问题诸如大气污染、温室效应、土壤酸化及水体富营养化等。硝化与反硝化作用是土壤氮(n)循环的重要过程，也是土壤氮素输出的关键途径，决定着整个生态系统氮循环的速度和与外界交换的通量。定量表达硝化与反硝化作用强弱、动态及其影响因素是深入理解氮循环的关键，具有重要的科学意义。此外，硝化与反硝化过程均会释放n2o，具有较高的增温潜势和大气驻留时间，是一类主要的温室气体。因此，准确刻画土壤硝化与反硝化过程对于评估温室气体排放和气候变化具有重要的实践价值。在全球变化背景下，土壤氮循环，尤其是硝化与反硝化过程对增温、氮沉降、降雨等的响应受到了广泛关注，并取得了重要成果与进展。然而，由于研究手段与方法的限制，对于硝化与反硝化作用的测量、时空动态刻画和机理研究仍存在较大差异和不足。因此，亟需开展相关研究，以深入认识氮循环对未来气候变化的反馈与机制。由于原子核所含有的中子数不同，具有相同质子数的原子具有不同的质量，这些原子被称为同位素。例如，氮的2个主要同位素分别为14n和15n，它们都有7个质子和7个电子，但中子数分别为7和8。同位素可分为两大类:放射性同位素(radioactiveisotope)和稳定同位素(stableisotope)。凡能自发地放出粒子并衰变为另一种同位素的被称为放射性同位素，无可测放射性的同位素是稳定同位素。其中一部分是放射性同位素衰变的最终稳定产物。例如206pb和87sr等。其余的大部分是天然的稳定同位素，即自核合成以来就保持稳定的同位素，例如12c和13c、14n和15n、16o和18o等。与质子相比，含有太多或太少中子均会导致同位素的不稳定性，如14c。这些不稳定的放射性同位素将会衰变成稳定同位素。某一同位素在所有各种稳定同位素总量中的相对份额即绝对丰度，常以该同位素与1h(取1h＝1012)或28si(28si＝106)的比值表示。绝对丰度一般是由太阳光谱和陨石的实测结果给出元素组成，结合各元素的同位素组成计算的。同一元素各同位素的相对含量称为相对丰度。例如12c＝98.892％，13c＝1.108％。大多数元素由两种或两种以上同位素组成，少数元素为单同位素元素，例如19f＝100％。一般定义同位素比值r为某一元素的重同位素原子丰度与轻同位素原子丰度之比，如d/h、13c/12c、15n/14n等，由于轻元素在自然界中相对丰度很高，而重同位素的相对丰度都很低，r值通常很低且冗长繁琐不便比较，故在实际工作中通常采用样品的δ值来表示样品的同位素成分。样品(sq)的同位素比值rsq与标准物质(st)的同位素比值(rst)比较结果称为样品的δ值。其定义为：δ(‰)＝(rsq/rst-1)×1000，即样品的同位素比值相对于标准物质同位素比值的千分差。δ值的大小显然与所采用的标准有关，所以分析同位素时首先要选择合适的标准，不同的样品间的比较也必须采用统一标准才有意义。对同位素标准物质的一般要求是：组成均一性稳定；数量较多，以便长期使用；化学制备和同位素测量的手续简便；大致为天然同位素比值变化范围的中值，以便用于绝大多数样品的测定；可以作为世界范围的零点。目前国际通用的同位素标准是由国际原子能委员会(iaea)和美国国家标准和技术研究所(nist)颁布的，其中氮同位素的标准为空气中的氮气，15n/14n＝(3.6765±8.1)×10-6，定义其δ15n＝0‰。质谱是按照原子(分子)质量的顺序排列的图谱。利用光谱法、核感应法或微波吸收法都可以构成试验装置，进行质谱研究；而历史上把基于电磁学原理设计而成的仪器叫做质谱仪(massspectrometer或massspectrograph)。因为这种仪器中采用的质量分析器只能对带电粒子起分离作用，所以，要求将被研究的原子(分子)转变成离子，而仪器所获得的信息则是离子的质量m与电荷e之比m/e。近百年来，人们利用质谱仪进行了原子量测定、同位素分离与分析、有机物结构分析和其他科学实验，形成质谱法(massspectrometry或massspectroscopy)，其在现代分离、分析研究领域中占有重要地位。稳定同位素质谱仪的基本原理是首先将样品转化为气体(如co2、n2、so2或h2)，在离子源中将气体分子离子化(从每个分子中剥离一个电子，导致每个分子带有一个正电荷)，然后将离子化气体打入飞行管中。飞行管是弯曲的，其上方置有磁铁，带电分子依质量不同而分离，含有重同位素的分子弯曲程度小于含轻同位素的分子。在飞行管的末端有一个法拉第收集器，用以测量经过磁体分离之后，具有特定质量的离子束强度。由于它是把样品转化为气体才能测定，所以又叫气体稳定同位素比率质谱仪。以n2为例，需要有两个法拉第收集器来收集质量分别是28和29的离子束。不同质量离子同时收集，从而可以精确测定不同质量离子之间的比率。稳定同位素的测定大致分为3个步骤：1)样品的采集、制备和前处理；2)将样品转化成具有所测元素的纯气体；3)用质谱仪测定同位素比率。近年来，随着稳定同位素质谱技术的飞速发展，样品进行前处理后，可使用商业化的同位素质谱联用装置完成后续的气体转化和测定步骤。例如，元素分析仪-稳定同位素质谱仪(ea-irms)，气相色谱仪-燃烧炉-稳定同位素质谱仪(gc-c-irms)，多用途气体制备及导入装置-稳定同位素质谱仪(gasbenchii-irms)，痕量气体预浓缩装置-稳定同位素质谱仪(precon-irms)，痕量气体-稳定同位素质谱仪(tracegas-irms)，液相色谱仪-稳定同位素分析仪(lc-irms)，总有机碳氮分析仪-稳定同位素质谱仪(toc-irms)等，可以测定固体、液体、气体多种形态样品中稳定氮同位素比值。现有硝酸盐同位素样品分析的前处理方法主要有氨蒸馏法、铵扩散法、离子色谱法、细菌反硝化法和化学转化法。各种方法的主要特点及优缺点简介如下：1)氨蒸馏法：建立于20世纪60年代，主要是利用戴氏合金将硝酸盐还原为铵盐，次溴酸钠氧化生产氮气进行分析，优点是可分析各形态的氮元素、方法成熟稳定，缺点是样品用量大、需要大量硅酸盐器材、易交叉污染、效率低、只能测n同位素。2)氨扩散法：建立于20世纪80年代，利用吸收装置吸收水样中原有和转化的铵根离子，进行分析，后期改进为三明治夹膜结构，效率有所提高，优点是方法简单、不受水体性质的影响，缺点是吸收过程影响测量精密度、分析过程易产生分馏且分析过程长、只能测n同位素。3)离子交换法：建立于1999年，通过离子交换柱将硝酸盐转化为硝酸银，再利用高温裂解和高温转化分别测量n/o同位素组成。优点是可以分析硝酸盐中的氮氧同位素。缺点是不适用于土壤盐浸提液等含盐度较高的水体，分析时不能同时分析氮氧同位素、成本较高。4)细菌反硝化法：建立于2001年，是利用特定的缺少氧化亚氮还原酶的细菌进行反硝化反应，生成氧化亚氮。优点是分析不受水体性质的影响，富集样品的本底值低，方法检出限低。缺点是需要培养特定细菌、反硝化细菌转化no3-效率的稳定性不好控制、反硝化细菌培养与维持复杂性高。5)化学转化法：建立于2005年，是利用化学试剂将硝酸盐还原为亚硝酸盐，再经叠氮化钠反应生成氧化亚氮进行分析。方法的优点是流程可控性好、有效避免了细菌反硝化法的不稳定、氮氧同位素可以同时测定。缺点是化学转化法分析流程耗时长、易造成氧同位素交换、使用剧毒、易爆试剂，操作危险性高。鉴于上述各种技术的优缺点，国内科研院所采用的硝酸盐氮氧同位素样品前处理方法也不尽相同，因此，急需一种操作流程简化、转化效率高、适用范围广、反应稳定、机理简单、相关操作便于掌握的硝酸盐氮氧同位素样品前处理方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种硝酸盐氮氧同位素样品分析的前处理方法，解决现有的硝酸盐氮氧同位素样品分析的前处理方法存在操作流程相对复杂，转化效率低，适用范围较窄，反应不稳定，机理复杂等问题。本发明为实现上述目的，采用以下技术方案实现：一种硝酸盐氮氧同位素样品分析的前处理方法，包括以下步骤：步骤1、样品稀释：对批次样品分别进行稀释，并确保批次样品稀释后体积均在40ml以上；步骤2、ph值调节：将稀释后的样品溶液的ph值调节至6.0～8.0；步骤3、金属还原：向步骤2中完成ph值调节的样品溶液中加入还原性金属，振荡，使还原性金属与样品溶液充分反应，振荡结束后，得到溶液a，将溶液a转入顶空瓶中并加盖密封；步骤4、化学转化：将乙酸溶液和nan3溶液混合，然后向混合溶液中通入惰性气体，吹扫nan3中含n杂质反应生成的n2o气体，并得到溶液b，再向装有溶液a的顶空瓶中注入溶液b，充分振荡顶空瓶，再注入naoh溶液，终止反应，将顶空瓶内得到的n2o气体送入气体质谱仪进行氮氧同位素比值测定。进一步地，作为优选技术方案，所述步骤1中，每批次样品含有至少40个样本，包括3个标准品、2个质控、1个空白以及至少34个实际样品。进一步地，作为优选技术方案，所述步骤1的具体过程为：用0.2～0.7mol/l氯化钠溶液稀释样品，使样品中的no3--n降至15～25μmol/l，并确保批次样品稀释后体积均在40ml以上。进一步地，作为优选技术方案，所述步骤2的具体过程为：先加入数滴0.5～1.0mol/lhcl使溶液ph值降至2.0～3.0，然后再加入1.0～2.0mol/l咪唑使ph值升至6.0～8.0。进一步地，作为优选技术方案，所述步骤1中，先通过公式vd＝vs×(d-1)，计算得到需要加入的稀释液的体积，其中，vd为稀释液的体积，vs为待稀释液的体积，d为稀释倍数。进一步地，作为优选技术方案，所述步骤2中，通过公式ph＝lgc(h+)与计算出需要加入的ph调节液的体积v2，其中，ph1为初始测得的溶液的ph值，ph2为溶液目标ph值，c为加入调节液中h+/oh-的浓度mol/l，v1为初始溶液的体积ml，v1＝vd+vs。进一步地，作为优选技术方案，所述步骤3中的还原性金属为镀铜镉粒，向完成ph值调节的溶液中加入5～10粒镀铜镉粒，在200～300rpm、30～35℃的条件下振荡2～5h，使no3-充分还原转化为no2-。进一步地，作为优选技术方案，所述步骤3中的还原性金属为铁片，所述铁片卷曲呈圆筒状。进一步地，作为优选技术方案，所述步骤4的具体过程为：将体积百分比为20％的乙酸溶液和2mol/lnan3溶液按体积1:1混合，然后向混合溶液中通惰性气体超声20～30min，吹扫nan3中含n杂质反应生成的n2o气体，并得到溶液b，然后向装有溶液a的顶空瓶中注入0.8～2.0ml溶液b，剧烈震动1～2min后在200～300rpm、30～35℃的条件下振荡0.5～1h，注入0.5～1.0ml6mol/lnaoh，终止反应，上机分析顶空瓶内n2o气体的氮氧同位素比值。进一步地，作为优选技术方案，所述惰性气体为氦气或氩气。本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：(1)本发明通过采用盐酸+咪唑组成的缓冲体系，能够实现对多种样品的ph值调节，相对于传统采用单一溶液作为缓冲剂，本发明能够测定的对象更多，适用范围更广，比如，本发明可对土壤浸提液、污泥、生活污水、河流水、海水、湖泊水、冰川水等进行前处理，而传统的方法往往只能处理一般的河流水、海水、湖泊水、冰川水。(2)本发明通过预先计算所需稀释液、调节液的体积，并通过三维机械臂和蠕动泵对各个样品实现稀释、ph值调节，只需要分别加入一次稀释液、一次ph调节液，即可快速地实现样品稀释以及溶液的ph值调节，无需不断地试加、振荡、测量，省去了大量的操作时间，有效提高了稀释、ph调节阶段的工作效率，尤其是针对大量样品的稀释、ph值调节，本发明能够有效缩短前样品的处理时间。(3)本发明通过用铁片来取代镀铜镉粒，能够规避健康危害和安全隐患，同时铁片相对于镀铜镉粒来说价格便宜很多，能够大大降低实验及测试成本；另外，由于铁片为一整片结构，相对于传统的镀铜镉粒来说，不会像镀铜镉粒那样出现残留物，更容易实现较为彻底的固液分离，固液分离效率更高。(4)本发明通过采用化学转化的方式得到n2o气体，相对于细菌反硝化来说，机理更简单，无需微生物反应来得到n2o气体，尽可能地规避了不可靠的情况，以确保获得可靠、准确的测试结果。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。实施例1本实施例所述的一种硝酸盐氮氧同位素样品分析的前处理方法，包括以下步骤：步骤1、样品稀释：对批次样品分别进行稀释，每批次包括至少40个样本，包括3个标准品、2个质控、1个空白以及至少34个实际样品，具体地，先采用0.2～0.7mol/l氯化钠溶液分别稀释各个样品，使样品中的no3--n降至15～25μmol/l，并确保各个样品稀释后体积均在40ml以上；步骤2、ph值调节：将稀释后的样品溶液的ph值调节至6.0～8.0，具体地，先加入数滴0.5～1.0mol/lhcl使溶液ph值降至2～3.0，然后再加入1.0～2.0mol/l咪唑使ph值升至6.0～8.0；步骤3、金属还原：向步骤2中完成ph值调节的样品溶液中加入还原性金属，这里的还原性金属可以是镀铜镉粒，向完成ph值调节的溶液中加入5～10粒镀铜镉粒，在200～300rpm、30～35℃的条件下振荡2～5h，使no3-充分还原转化为no2-，得到溶液a，将溶液a转入顶空瓶中并加盖密封；步骤4、化学转化：将体积百分比为20％的乙酸溶液和2mol/lnan3溶液按体积1:1混合，然后向混合溶液中通惰性气体超声20～30min，这里的惰性气体优选氦气或者氩气，吹扫nan3中含n杂质反应生成的n2o气体，并得到溶液b，再向装有溶液a的顶空瓶中注入0.8～2.0ml溶液b，充分振荡顶空瓶，这里可以采用涡旋仪进行剧烈震荡，然后再在在200～300rpm、30～35℃的条件下振荡0.5～1h，再注入0.5～1.0ml6mol/l的naoh溶液，终止反应，将顶空瓶内得到的n2o气体送入气体质谱仪进行氮氧同位素比值测定。上述前处理方法中，步骤1采用氯化钠作为稀释溶液对样品进行稀释，并对稀释体积作了进一步限定，使得稀释后溶液中的氮含量保持在一个可控的范围内，以使溶液中的氮能够实现较为彻底的还原，为后面的测定结果更为准确、可靠。本发明的步骤2创新性地采用了盐酸+咪唑组成的缓冲体系，能够实现对多种样品的ph值调节，相对于传统采用单一溶液作为缓冲剂，本发明能够测定的对象更多，适用范围更广，比如，本发明可对土壤浸提液、污泥、生活污水、河流水、海水、湖泊水、冰川水等进行前处理，而传统的方法往往只能处理一般的河流水、海水、湖泊水、冰川水。在步骤3中，本发明采用直接加入镀铜镉粒然后振荡的方式实现还原反应，相对于传统的将镉粒装入还原柱的方式，本发明效率更高，且镀铜镉粒的用量更少，由于镀铜镉粒本身较贵，因此本方法也有效降低了测试成本。上述方法操作流程简单，采用直接加入镀铜镉粒到装有样品的试管中的方式，相对于传统的还原柱，不仅操作更简单，易于掌握，而且能够较快地实现镀铜镉粒与溶液的还原反应，转化效率高，能够大大节约整个前处理的时间。实施例2传统的稀释、ph值调节方法是，先测试溶液的初始浓度，然后加入稀释液(一般为水)，再测量稀释后的浓度，然后再加入稀释液，这样重复多次，直至得到所需的稀释浓度，或者接近所需的稀释浓度；同理，先测量溶液的初始ph值，然后加入调节液，测量此时的ph值，然后再加入调节液，重复多次，直至得到所需的ph值，在稀释和调节ph值得过程中，需要不断地振荡、不断地测试，这样的人工效率非常低，严重影响实验进度，甚至是实验的时效性以及实验结果的准确性和可靠性。为此，本实施例在实施例1的基础上，为了提高硝酸盐氮氧同位素样品分析的前处理效率，本实施例对溶液的稀释以及ph值得调节进行了相关研究并进行了设计，首先，通过公式vd＝vs×(d-1)，计算得到需要加入的稀释液的体积，其中，vd为稀释液的体积，vs为待稀释液的体积，d为稀释倍数，再通过公式ph＝lgc(h+)与计算出需要加入的ph调节液的体积v2，其中，ph1为初始测得的溶液的ph值，ph2为溶液目标ph值，c为加入调节液中h+/oh-的浓度mol/l，v1为初始溶液的体积ml，v1＝vd+vs。通过上述方法，本发明只需要分别加入一次稀释液、一次ph调节液，即可快速地实现样品稀释以及溶液的ph值调节，无需不断地试加、振荡、测量，省去了大量的操作时间，有效提高了稀释、ph调节阶段的工作效率。以每批次40个样品为例，由于每个样品的量各不相同，因此，需要加入的稀释液、ph调节液的量也各不相同，现有的人工操作方法差不多需要一天时间，而通过本实施例改进后，可通过电脑对每个样品的体积及浓度进行记录，并将各个装有样品的试管放在试管盘上，然后通过电脑计算出每个样品分别需要加入的稀释液、ph调节液的体积，然后通过电脑控制三维机械臂以及蠕动泵将分别稀释液、ph调节液注入到对应的样品中，比如，电脑计算出1号试管中需要加入30ml稀释液、2ml调节液，2号试管中需要加入32ml稀释液、3ml调节液，电脑控制三维机械臂带动针头运动到1号试管的正上方，然后控制液体泵将30ml稀释液注入1号试管内，再控制三维机械臂带动针头运动到2号试管的正上方，然后控制液体泵将32ml稀释液注入2号试管内，以此类推，将稀释液分别按量注入到对应的试管中，同理，将ph调节液按量注入到对应的试管内，这样即可一次性完成所有样品的稀释，然后一次性完成样品的ph值调节，工作效率提高10倍以上。实施例3本实施例在实施例2的基础上，创新性地将步骤3中的还原性金属由镀铜镉粒改为铁片，且将铁片卷曲成圆筒状，圆筒状的铁片的外径小于装样品的试管的内径。传统方法采用镀铜镉粒作为还原金属时，由于镀铜镉粒本身价格昂贵，一般只用数粒(5～10粒)，导致镀铜镉粒与溶液的接触面有限，还原反应缓慢且有所受限，而本实施例的铁片与传统的镀铜镉粒相比，与溶液的接触面大很多，反应更充分，能够使no3-更为充分地还原转化为no2-，而且铁片相对于镀铜镉粒来说，反应更稳定；同时，由于镀铜镉粒具有剧毒性，操作中的不当很可能带来一定的健康危害和安全隐患，本实施例通过用铁片来取代镀铜镉粒，铁片属于安全无毒材料，能够规避健康危害和安全隐患，同时铁片相对于镀铜镉粒来说价格便宜很多，能够大大降低实验及测试成本。另外，传统方法采用镀铜镉粒来作为还原反应物，镀铜镉粒与溶液反应过程中会产生大量的微粒残渣，导致固液分离时无法将溶液中的镀铜镉粒清除干净，而本发明采用铁片取代镀铜镉粒后，由于铁片为一整片结构，相对于传统的镀铜镉粒来说，不会像镀铜镉粒那样出现残留物，更容易实现较为彻底的固液分离，固液分离效率更高。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12