本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种测定微藻-菌联合体系中微藻和细菌干重的方法。
背景技术：
微藻(micro-algae)和细菌都具有一定的去除水体中营养物质或者有机污染物质的能力，微藻是一种能有效利用光能和二氧化碳的初级生产者，其种类繁多、分布广泛，具有现存量大、生长周期短、易于培养及脂质含量高等特点，它能有效利用生活污水或富营养化水体中的n、p等营养物质，并伴随着生物量的积累，但它的大规模的工业应用主要受限于较慢的生长速率，以及对有机污染物较弱的抗性，在利用微藻净化水体的过程中，细菌不可避免的存在，因此，越来越多关注焦点集中在人工构筑微藻-细菌联合体系去除水体中的污染物质，尤其是有机污染物，在两种微生物共同作用过程中，具有特定功能的细菌能够将污水中的有机污染物降解为n、p等物质，并在此过程中消耗氧气释放二氧化碳，为微藻光合作用过程提供所需的必需得营养物质和二氧化碳气体，而光合作用中所产生的氧气又为细菌好氧降解有机物所利用，而在此过程即“微藻-细菌共生”，并在此过程中，实现对水体或污水的彻底净化。由于细菌与微藻之间的更为高效的营养物质利用关系和气体关系，细菌的存在会增加微藻的现存量的积累，并提高其沉降性能。此外由于微藻较高的脂类物质含量，其已成为生物柴油的有效替代品，当将高油脂含量的微藻与具有木质素降解能力的细菌混合培养时，细菌能够降解广泛存在的并难于为微藻所利用的木质素，并将其转化成生物柴油，在此过程中可以实现对秸秆等农业副产物的利用和高附加值产物的产出。
微藻-细菌联合体系由于其不可比拟的优越性而被广泛研究并期待实现其大规模的工业利用，而在此过程中，如何测定混合体系中细菌和微藻的现存量(干重)尤为重要，因为需要确定系统中微藻和细菌的含量，并由此确定系统是否正常运行。
常见的测定细菌和微藻现存量的方法是测定微藻或细菌的光密度(od)，细菌或微藻的浓度越大，其吸光值越大，在一定浓度范围内，微生物密度(代表现存量的多少)与吸光值呈线性关系，但光密度法不适宜于监测藻类-细菌混合系统中藻类和细菌的现存量，因为混合体系的光密度值可能会引起藻类吸收的偏差，从而忽略了细菌的存在。而在其他专利中还未曾发现测定微藻-细菌联合体系中微藻和细菌的现存量的方法，但在其他的研究中，有发现使用显微镜计数的方式分别测定微藻和细菌浓度的方法，但这种方法工作量极大，且显微镜计数误差较大。
技术实现要素：
本发明为了解决现有技术存在的问题，提供一种测定微藻-细菌联合体系中微藻和细菌现存量的方法，叶绿素(尤其是叶绿素a)作为一类特殊的色素，是藻细胞重要组成部分，微藻浓度越高，其叶绿素浓度也越高，在一定程度下，可由叶绿素a浓度含量代表微藻现存量，因此，将测定微藻现存量的问题转化为测定叶绿素的浓度，而叶绿素在一定波长下具有吸收度，且叶绿素浓度越大，其吸收度越大，通过光密度可以实现对叶绿素浓度，进一步实现对微藻干重的测定。该方法能够有效地快捷地测定混合体系中微藻和细菌的干重，准确度更高且操作更为便捷。
为实现上述目的，具体技术方案如下：
一种用于测定微藻-菌联合体系中微藻和细菌干重的方法，包括如下步骤：
第一步，微藻叶绿素浓度与微藻干重的标准曲线制定：
1.1制备藻悬液：微藻在培养基培养至对数生长期后期，收获藻液；离心后，弃去上清液，使用去离子水重悬并再次离心清洗以去除原培养基的影响，加入去离子水定容至原体积，重悬成为与原始微藻浓度相同的藻悬液；
1.2测定藻悬液的干重：取适当体积的器皿放于干燥箱，烘干直至多次称量为恒重，记录其质量为m*1，取一定体积v*的待测藻悬液于烘干的器皿中，并放于水浴锅中蒸干，蒸干至多次称量为恒重，记为m*2，则藻悬液的干重m*algae＝(m*2-m*1)/v*；测定三组以上包括不同稀释和浓缩倍数的藻悬液干重；
1.3测定微藻叶绿素浓度：将上述不同稀释和浓缩倍数的藻悬液进行萃取、离心，取上清液，通过测定指定波长的吸光值，计算相应藻悬液的叶绿素浓度；
1.4制得微藻叶绿素浓度与微藻干重的标准曲线：根据步骤1.3测定的微藻叶绿素浓度和步骤1.2测定的藻悬液的干重，制作离散曲线，得到线性回归方程，并检测线性回归方程的相关系数r2，若r2>0.99，则可作为标准曲线使用；
第二步，制备待测混合悬液：取微藻-细菌混合液离心得到微生物体，弃去上清液，使用去离子水重悬并再次离心清洗以去除原培养基的影响，最后加入去离子水定容至原体积，重悬成原微生物浓度的混合悬液；
第三步，测定待测混合悬液的干重m总：取适当体积的器皿放于干燥箱，烘干直至多次称量为恒重，记录其质量为m1，取一定体积v的待测混合悬液于烘干的器皿中，并放于水浴锅中蒸干，蒸干至多次称量为恒重，记为m2，则混合体系的干重m总＝(m2-m1)/v；
第四步，测定混合悬液中叶绿素的浓度：使用水系抽滤膜抽滤待测混合悬液，将所得到的附着微藻的滤膜剪碎放入离心管中，加入二甲基亚砜，并在黑暗条件下在水浴锅中萃取两小时，待凉后加入丙酮溶液定容，将所得萃取液离心得到上清液，通过测定指定波长的吸光值，计算相应混合悬液中的叶绿素浓度；
第五步，通过第一步得到的微藻叶绿素浓度与微藻干重的标准曲线结合第四步得到的混合悬液中的叶绿素浓度，计算混合体系中微藻的干重malgae，再通过第三步得到的混合悬液的干重m总，计算得到混合体系中细菌的干重mbacteria＝m总-malgae。
进一步地，上述步骤1.3和第四步中通过测定指定波长的吸光值，计算相应藻悬液的叶绿素浓度，其中叶绿素浓度包括叶绿素a、叶绿素b或者叶绿素a与叶绿素b的总和；具体方法为：
使用紫外-可见分光光度计分别测定663.6nm和646.6nm波长处上清液吸光值，并根据以下公式计算出微藻的叶绿素浓度：
ca＝12.27a663.6–2.52a646.6(1)
cb＝20.1a663.6–4.92a646.6(2)
ctotal＝ca+cb＝7.35a663.6–17.58a646.6(3)
其中:ca是叶绿素a浓度(mg/l)；cb是叶绿素b浓度(mg/l)；ctotal是叶绿素a与叶绿素b的总和浓度(mg/l)；a663.6和a646.6分别是663.6nm和646.6nm波长处吸光值。
本发明的有益效果：
1)本发明方法提供了一种测定微藻-菌联合体系微藻和细菌干重的方法，与直接测定混合体系的光密度相比，具有准确度高的优点。
2)而与常见的直接使用显微镜计数方法测定混合体系中微藻与细菌的数量的方法相比，又具有操作简单、快捷，准确度高等优势
附图说明
图1是本发明的方法流程图。
图2是不同微藻干重-微藻叶绿素标准曲线，其中(a)微藻干重-微藻叶绿素a标准曲线；(b)微藻干重-微藻叶绿素b标准曲线；(c)微藻干重-微藻总叶绿素标准曲线。
具体实施方式
实施例：
一种测定用于降解生活污水营养物质的人工构建的微藻-菌联合体系中细菌干重的方法，具体步骤如下：
1.测定微藻干重与叶绿素浓度的标曲：将该联合体系中的微藻在相同条件下单独培养7～10天至对数生长期后期，收获藻液。离心后，使用去离子水清洗，再次离心后重悬，配制成为具有相同微藻现存量浓度的藻悬液，取100ml该藻悬于250ml锥形瓶中，水浴蒸干，并测定其干重340(mg/l)，则其0.25倍、0.5倍、0.75倍微藻稀释液以及2倍微藻浓缩液的干重分别为85(mg/l)、170(mg/l)、255(mg/l)、680(mg/l)。同时，将上述藻悬液原液分别稀释或浓缩至原液的0.25倍、0.5倍、0.75倍和2倍，进行萃取、离心操作，并分别测定萃取液在663.6nm和646.6nm波长处上清液吸光值，按上述公式(1)或(2)或(3)计算其叶绿素a浓度分别为0.236(mg/l)，0.612(mg/l)，0.754(mg/l)，1.16(mg/l)，2.55(mg/l)，绘制离散曲线，得到线性回归方程y＝0.00388x-0.12595，并检测线性回归方程的相关系数r2＝0.99，可作为标准曲线使用。
2.测定待测混合液微生物干重：取待测混合液在8000rpm，4℃条件下离心10min得到生物体，弃去上清液，使用去离子水重悬并再次离心清洗以去除原培养基的影响，最后加入去离子水定容至原体积，重悬成原现存量浓度的混合悬液，取上述混合悬液100ml水浴蒸干，测定混合体系的干重m总＝780(mg/l)。
3.测定待测混合液微藻干重：使用水系抽滤膜抽滤10ml上述混合悬液，将所得到的附着微藻的滤膜剪碎放入15ml离心管中，加入2ml二甲基亚砜，并在黑暗条件下在65℃水浴锅中萃取两小时，待凉后加入约8ml80％丙酮溶液定容至10ml，将所得萃取液置于800rpm，4℃条件下离心10min得到上清液，使用紫外-可见分光光度计分别测定663.6nm和646.6nm波长处上清液吸光值，并根据叶绿素计算公式(公式(1)或(2)或(3))计算得到微藻的叶绿素含量ca＝0.956(mg/l)，由叶绿素a-细胞干重标曲得到malgae＝278(mg/l)，并由此得到混合体系中细菌的细胞干重mbacteria＝m总-malgae＝502(mg/l)。