一种动物毛发中罗红霉素残留量的检测方法与流程

本发明属于药物残留检测技术领域，具体涉及一种动物毛发中罗红霉素残留量的检测方法。

背景技术：

罗红霉素为第二代半合成大环内酯类作抗生素，主要通过抑制菌体蛋白质的合成，而起到杀菌作用，抗菌谱广，起效快，杀菌力强，本品内服在胃酸中稳定体内分布广泛具有较高而持久的组织浓度和细胞浓度，疗效好。主要用于畜禽的呼吸道感染如猪的肺炎、喘气病，流行性感冒、鸡慢呼等，或因传喉、传支、传鼻引起的继发感染等。此外，罗红霉素对肠道病也有较好疗效。

但是，罗红霉素违规用于畜禽养殖，会影响畜禽疫病防治和畜禽产品安全、增加细菌产生耐药性的风险、威胁人类健康。虽然国家明令禁止使用，但养殖环节会带来经济效益受损，因此养殖户仍将抗生素添加于饲料中或通过其他途径使用，从而导致人用抗生素仍被滥用于畜禽，成为威胁畜禽产品安全的新隐患。

为了安全监管，业内开展了大量关于罗红霉素残留的检测方法，但是，但是尚未颁布任何基质中有关阿奇霉素的检测标准。目前，畜禽产品中罗红霉素检测的基质主要是肌肉、肝脏、血液和粪便，而肌肉和肝脏需要宰杀活体动物取得，畜禽血液样品需要专业人员取得，而且在检测前需要冷链保存，防止变质；粪便易受污染，取样也不方便。此外，在休药期后，这些基质中的药物残留难于被检测出来。而毛发因为其结构成分特点和较低的代谢活性，使得药物进入后代谢缓慢，可长期蓄积保留，在畜禽毛发发中具有较长残留时间，而且毛发取样、运输方便，相比肌肉、肝脏、血液和粪便基质更适合作为检测样本为禽产品安全生产中违禁药物监管提供更可靠确证依据。目前尚未见畜禽毛发中罗红霉素残留量检测方法。

技术实现要素：

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的畜禽产品中罗红霉素检测结果不可靠，不利于畜禽产品安全监管，检测样品不易得或难于保存等缺陷，从而提供一种动物毛发中罗红霉素残留量的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种动物毛发中罗红霉素残留量的检测方法，包括以下步骤：

1.供试品溶液的制备

取动物毛发样品置于医用纱布中，清洗，研磨，与氨水和甲醇的混合溶液混合，然后加入罗红霉素-d7工作液，室温超声30～60min，获得毛发水解液，过滤，吹干，用甲醇水溶液和正己烷溶解残渣，离心，作为供试品溶液；

2.高效液相色谱-串联质谱法检测

高效液相色谱条件：色谱柱：c18，2.1mm×100mm，1.8μm；流动相a为体积浓度为0.1％甲酸水溶液，流动相b为甲醇，流速：0.4ml/min；柱温：35℃；进样量：10μl；梯度洗脱程序：0-2min，2％b线性变化至40％b；2～3min，保持40％b，3～4min，40％b线性变化至75％b；4-5min，保持75％b，5～5.1min，75％b线性变化至98％b；5.1-6min，保持98％b；6-6.1min98％降为2％b；6.1～7.0min,维持2％b；

质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式；多反应检测：喷雾电压：3000v，离子源温度，150℃，鞘气温度：300℃；鞘气流量：12l/min。

优选的，所述氨水和甲醇的混合溶液中，氨水在混合溶液中的体积分数为2-4％。

优选的，所述氨水和甲醇的混合溶液中还含有二硫苏糖醇。

优选的，以氨水，甲醇和二硫苏糖醇的总质量计，所述二硫苏糖醇的质量浓度为0.3-1.2％。

优选的，所述研磨步骤之前，还包括液氮冻干处理。

优选的，以动物毛发的用量为基准，所述氨水和甲醇的混合溶液的用量为40-60ml/g；或者，氨水，甲醇和二硫苏糖醇的总用量为40-60ml/g。

优选的，以动物毛发的用量为基准，所述罗红霉素-d7工作液的用量为60-120μl/g。

优选的，所述罗红霉素-d7工作液的浓度为0.5～2.0mg/l。

优选的，所述甲醇水溶液和正己烷的体积比为0.8～1.2:1；所述甲醇水溶液的体积浓度为40～60％。

优选的，所述质谱条件中罗红霉素的定量离子为m/z837.5>679.4，定性离子为m/z837.5>158，罗红霉素-d7的定量离子为m/z844.4>686.3。

本发明按照内标法以峰面积计算罗红霉素在毛发中的残留量，计算公式为：

x--样品中罗红霉素残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；

c--罗红霉素标准工作液的浓度，单位为微克每升(μg/l)；

csi--标准工作溶液内标物罗红霉素-d7的浓度，单位为微克每升(μg/l)；

ci--样品中溶液内标物罗红霉素-d7的浓度，单位为微克每升(μg/l)；

as--罗红霉素标准工作溶液的峰面积；

a--样品中罗红霉素的峰面积；

asi--罗红霉素标准工作溶液内标物罗红霉素-d7的峰面积；、

ai--样品中罗红霉素-d7的峰面积；

v--样品定容体积，单位为毫升(ml)；

m--样品称样量，单位为克(g)。

计算结果需要扣除空白值，结果少于0.3μg/kg时，视为未检出。

以上所述畜禽毛发中罗红霉素残留量的检测方法，所述方法在检测畜禽毛发中的应用，所述畜禽优选为鸡、猪、牛等畜禽类，最佳优选为鸡。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的动物毛发中罗红霉素残留量的检测方法，以动物毛发为检测对象，无需宰杀鸡、猪、牛等畜禽，实现畜禽活体检测；毛发样品较肌肉、肝脏，粪便等获取方便，且由于毛发生长周期长，更能准确监控畜禽生长过程是否使用罗红霉素，从而实现畜禽等食品安全生产监管目的，检测结果准确，不会出现假阳性、假阴性等情况，灵敏度高。

2.本发明提供的动物毛发中罗红霉素残留量的检测方法，通过选用特定比例氨水和甲醇的混合溶液，能够使得毛发样品在室温下进行水解，缩短药品前处理时间；此外，添加一定量的二硫苏糖醇能更进一步的缩短水解时间，毛发样品水解提取条件温和，简便，省时。

3.本发明提供的畜禽毛发中氧氟沙星残留量的检测方法。该检测方法使用医用纱布包裹毛发清洗、过滤，极大节约了前处理时间，操作简便。此外，使用医用纱布避免了清洗过程中毛发损失，取样量最低可达到0.1g，对畜禽伤害少。

4.本发明提供的动物毛发中罗红霉素残留量的检测方法，选用“三级梯度洗脱”，通过对色谱洗脱梯度的调整以及样品水解条件等的选择，提高了该方法的检测灵敏度，检出限为0.3μg/kg。

附图说明

图1阳性畜禽毛发样品及内标物多反应检测(mrm)色谱图；

图2阴性畜禽毛发样品及内标物多反应检测(mrm)色谱图；

图3罗红霉素标准品及内标物多反应检测(mrm)色谱图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例

1、仪器设备

仪器设备：高校液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源、高速离心机、氮吹仪，分析天平(0.1mg)、超声波发生器等。

标准品和试剂：罗红霉素标准品：纯度>98.5％；内标：罗红霉素-d7；甲醇和二硫苏糖醇：色谱纯；其余试剂为分析纯，实验用水为二次水。

标准溶液的制备：准确称取适量的罗红霉素和罗红霉素-d7标准品，用甲醇溶解制成100.0～1000.0mg/l标准溶液。

标准储备溶液制备：移取适量的标准溶液至10.0ml容量瓶，用甲醇稀释至刻度，配置1.0mg/l标准储备溶液。

标准工作溶液制备：将标准储备溶液，用甲醇-水溶液(1:1)进行适当稀释。

2、线性回归方程与检测限

配置浓度为0.05μg/l～100.0μg/l的一系列罗红霉素标准工作溶液，内标罗红霉素-d7浓度为20.0μg/l，以峰面积比(y)对含量(x)作图，结果表明，在0.05μg/l～100.0μg/l范围内，峰面积比(y)与罗红霉素浓度呈良好的线性关系。罗红霉素的线性方程为y＝0.05521x-0.01575，相关系数r²＝0.9980。

在空白畜禽毛发样品中添加罗红霉素标准溶液，使样品中罗红霉素浓度为1.0μg/l，按建立的方法进行检测，根据得到的罗红霉素色谱峰的性噪比计算出方法的最低检测限(s/n＝3)为0.3μg/kg，定量限(s/n＝10)为1.0μg/kg。

3、回收率与精密度

以未检出罗红霉素的空白畜禽毛发作为样品基质，在5.0μg/kg、10.0μg/kg、50.0μg/kg三个含量水平添加罗红霉素标样，按前述试验方法测定并计算回收率，每个添加水平平行测定6次。试验测得罗红霉素回收率在97.3％～105.2％范围，相对标准偏差在3.8％～4.9％，结果符合《gb27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测》关于残留分析要求。罗红霉素的测定方法回收率与相对标准偏差见表1。

表1畜禽毛发中罗红霉素测定方法回收率与相对标准偏差(n＝6)

4、样品测定

取口服罗红霉素胶囊得到的6份阳性鸡毛样品、5份未喂给罗红霉素的鸡毛样品按照下面方法检测。

供试品溶液的制备：a.清洗：称取鸡毛样品0.2g，精确到0.1mg，置于二层医用纱布中，用15ml甲醇，15ml0.1％(v/v)甲酸水溶液，15ml二次水依次清洗，在40℃～50℃烘干后，在液氮冷冻20min，研磨粉碎；b.水解：取粉碎后的鸡毛样品剪碎，置于50ml塑料离心管中，加入50.0μl1.0mg/l罗红霉素-d7工作液和15.0ml氨水，甲醇和二硫苏糖醇的混合水解液，其中1％(w/v)二硫苏糖醇和4.0％(v/v)氨化甲醇溶液，室温超声40min,获得鸡毛水解液；c.浓缩净化：鸡毛水解液用二层医用纱布过滤，滤液在40℃～50℃氮吹近干，加入2.0ml1:1(v/v)甲醇水溶液和2.0ml正己烷溶解残渣，转移到5ml离心管，12000转/分离心5min，取下层液过0.22μm滤膜，作为供试品溶液。

高效液相色谱-串联质谱法检测：

液相色谱条件：色谱柱：agilenteclipseplusc18，2.1mm×100mm,1.8μm；流动相a为含0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相b为甲醇，流速：0.4ml/min；柱温：35℃；进样量：10.0μl；梯度洗脱程序：：0-2min，2％b线性变化至40％b；2～3min，保持40％b，3～4min，40％b线性变化至75％b；4-5min，保持75％b，5～5.1min，75％b线性变化至98％b；5.1-6min，保持98％b；6-6.1min98％降为2％b；6.1～7.0min,维持2％b。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式；多反应检测：喷雾电压：3000v，离子源温度，150℃，鞘气温度：300℃；鞘气流量：12l/min。罗红霉素的定量离子为m/z837.5>679.4，定性离子为m/z837.5>158和罗红霉素-d7的定量离子为m/z844.4>686.3。

检出上述样品中含有罗红霉素残留量在36.8μg/kg～336.3μg/kg之间，未喂养罗红霉素的鸡毛样品未检出罗红霉素残留，部分色谱图见图1-3，说明该检测方法具有可行性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。