注射液及参麦注射液中聚山梨酯80的鉴别方法与流程

本发明涉及质量标准
技术领域：
，尤其是涉及注射液及参麦注射液中聚山梨酯80的鉴别方法。
背景技术：
：2015年中国药典增加了聚山梨酯80(供注射用)质量标准，该标准与聚山梨酯80质量标准物质基础上有较大的区别。聚山梨酯80(供注射用)标准脂肪酸组成规定：油酸组成不低于98％，肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸含量均不得过0.5％。聚山梨酯80标准物质标准脂肪酸组成规定：油酸组成不低于58％，肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸分别不得大于5.0％、16.0％、8.0％、6.0％、18.0％、4.0％。上述两种聚山梨酯80市场价格差别很大，聚山梨酯80(供注射用)价格约2000元/kg；聚山梨酯80价格约40元/kg。中药注射剂使用聚山梨酯80的品种较多，如：参麦注射液、生脉注射液、鱼腥草注射液等，主要用于药液的增溶。目前还没有关于中药注射剂中聚山梨酯80辅料的鉴别报道(是否为供注射用聚山梨酯80)。因此建立中药注射剂中添加的聚山梨酯80是否为供注射用辅料的方法，有助于中药注射剂中辅料添加规范性，为质量评价提供依据。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于注射液中聚山梨酯80的鉴别方法，该方法能够有效提取出注射液中的聚山梨酯80，为准确鉴别聚山梨酯80的质量建立了可靠基础。本发明的第二目的在于参麦注射液中聚山梨酯80的鉴别方法，该方法能够有效提取出参麦注射液中的聚山梨酯80，为准确鉴别聚山梨酯80的质量建立了可靠基础，并且方法专属性强，结果可靠。为了实现以上目的，本发明提供了以下技术方案：注射液中聚山梨酯80的鉴别方法，包括下列步骤：步骤a：将待测注射液在90～150℃下加热，然后倒置装所述待测注射液的容器，冷却至75℃以上时，再骤冷至50℃以下，静置至聚山梨酯80完全析出；步骤b：对所述步骤a析出的聚山梨酯80皂化、柱前衍生化，然后采用色谱法检测聚山梨酯80中油酸的含量。首先，本发明以油酸含量作为鉴别聚山梨酯80质量的依据，是根据市场上注射用和普通用聚山梨酯80的质量差别而定的，研究中发现两种产品的油酸含量有显著差别。检测市售聚山梨酯80油酸组成(三个厂家)，结果见下表1。从表中可以看出，不同厂家市售聚山梨酯80油酸组成含量差异大，在77％～88％范围内。表明市售聚山梨酯80油酸组成比例差异较大。表1市售聚山梨酯80油酸组成含量检测结果(n＝3)编号油酸组成含量厂家a77.9％±0.20％厂家b83.2％±0.15％厂家c85.7％±0.18％检测市售聚山梨酯(供注射用)油酸组成，结果该品油酸含量为98.8％±0.12％(n＝3)。供注射用聚山梨酯80油酸组成比例极高。综上，将油酸含量作为鉴别聚山梨酯80质量的依据。其次，现有技术仅仅公开了鉴别聚山梨酯80中脂肪酸含量的方法，并没有公开从实际药品中提取聚山梨酯80的方法。然而，对于实际产品中聚山梨酯80的鉴别，提取过程才是保证鉴别结果准确性、专属性的基础。本发明的以上方法克服了注射液中聚山梨酯80提取难的问题，利用聚山梨酯80起昙后在药液中分层的原理，可以轻易地将聚山梨酯80从药液中分离出来。具体地，聚山梨酯80溶液(以注射液为例)高温加热后出现起昙现象(溶液混浊)，温度恢复时可以变澄清。在实际灭菌后，起昙后的聚山梨酯80溶液，经静置，冷却，药液中会出现聚山梨酯80分布不均，出现下层多、上层少的现象，利用此现象将聚山梨酯80分离出。此外，对于鉴别标准，根据目前市场上注射液聚山梨醇80的生产情况，可采用如下标准：油酸含量大于97％时，为添加聚山梨酯80(供注射用)辅料参麦注射液；油酸含量小于90％为添加聚山梨酯80普通辅料参麦注射液。通常为了避免化学成分变质，高温加热宜采用蒸汽灭菌的手段。在本发明中，为提取出高纯度的聚山梨酯80，需要掌控加热温度、冷却温度等关键参数。本发明从注射液中提取聚山梨酯80时，宜采用安瓿瓶装，具体过程为：将待测注射液在90～150℃下加热，然后倒置装所述待测注射液的安瓿瓶，冷却至75℃以上时，再骤冷至50℃以下，静置至聚山梨酯80完全析出，此时聚山梨酯80附着于安瓿瓶头，取出即可(通常用溶剂溶解)。本发明步骤a的目的是使注射液的聚山梨酯80完全分层析出，因此加热时间、冷却温度区间以及静置时间均为完全析出为考察目的。本发明中柱前衍生化的过程与色谱法的手段相匹配，不同色谱法匹配不同的柱前衍生化法。本发明的鉴别方法适用于各类注射液中注射用聚山梨酯80的鉴别，例如常见的参麦注射液、生脉注射液、参附注射液等。在以上基础上，本发明的鉴别方法还可以进一步改进，具体如下。优选地，所述色谱法气相色谱法，色谱条件为：色谱柱：85～95％氰丙基聚硅氧烷为固定液的石英毛细管柱，起始柱温为85～95℃，以每分钟15～25℃的速率升温至150～170℃，再以每分钟1.5～2.5℃的速率升温至210～230℃，进样口温度320～360℃，检测器为氢火焰离子化检测器，温度310～350℃，理论板数按油酸甲酯峰计算在10000以上。以上气相色谱法的专属性、精密度、重现性更好，并且具有较高的回收率，检出限低。因此采用以上方法鉴别聚山梨酯80更灵敏、准确、可靠。优选地，所述色谱条件为：色谱柱：85～88％氰丙基聚硅氧烷为固定液的石英毛细管柱，优选地，起始柱温为85～90℃，以每分钟15～20℃的速率升温至160～170℃，再以每分钟1.5～2℃的速率升温至210～220℃，优选地，进样口温度320～340℃，优选地，检测器为氢火焰离子化检测器，温度310～330℃。优选地，所述检测时，采用面积归一化法计算油酸含量。采用面积归一化法计算含量简单、快捷。优选地，所述检测时所用的对照品为：肉豆蔻酸甲酯、棕榈酸甲酯、棕榈油酸甲酯、硬脂酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯以及油酸甲酯。优选地，所述皂化的方法为：在含1.5～2.5％氢氧化钠的甲醇溶液环境中，加热回流反应。采用此皂化法反应完全，能使聚山梨酯80更完全皂化。更优选地，在含2～2.5％氢氧化钠的甲醇溶液环境中，加热回流反应。优选地，所述柱前衍生化的方法为：三氟化硼甲酯化法，优选为：在含10～15％三氟化硼甲醇溶液中加热回流反应；优选地，在含10～14％三氟化硼甲醇溶液中加热回流反应；在以上条件下的柱前衍生化酯化率更高，可达到98％以上。优选地，在所述柱前衍生化之后和所述检测之前还包括：用正庚烷萃取。优选地，检测所述对照品时所用的溶剂为正庚烷。聚山梨酯80在正庚烷中的溶解度高，并且正庚烷对色谱检测的干扰小，使检测结果更准确。本发明上文所述的各种方案的鉴别方法适宜任意类型的注射液，例如常见的参麦注射液。对于参麦注射液，所述步骤a中的加热时间优选为10min以上；优选地，所述步骤a中所述冷却至75℃以上为冷却至75～95℃；优选地，所述步骤a中所述静置的时间为0.5小时以内。综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：(1)从注射液中提取聚山梨酯80的方法简单，提取率高，纯度高；(2)鉴别注射液中聚山梨酯80的专属性强，灵敏度高、精密度高、重复性好，适用范围广，可用于参麦注射液、生脉注射液、参附注射液中聚山梨酯80的鉴别。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例提供的加热后参麦注射液安瓿瓶瓶头聚山梨酯80的附着状态图；图2为本发明实施例提供的聚山梨酯80参麦提取物油酸组成图谱；图3为本发明实施例提供的聚山梨酯80(供注射用)参麦提取物油酸组成图谱。具体实施方式下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实验例1研究加热时间对提取聚山梨酯80的影响取参麦注射液9支(10ml规格，安瓿瓶装)，分成3组，每组3支，倒置，于115℃下分别加热5min、10min、20min，待药液冷却至80℃时，倒置取出，用30℃左右水淋洗冷却，等待0.5小时后将安瓿瓶正放，观察安瓿瓶头聚山梨酯80附着量。结果上述3种加热时间的样品安瓿瓶头聚山梨酯80附着量基本一致。实验例2研究加热温度对提取聚山梨酯80的影响取参麦注射液9支(10ml规格，安瓿瓶装)，分成3组，每组3支，倒置，于100℃、115℃、121℃下分别加热10min，待药液冷却至80℃时，倒置取出，用30℃左右水淋洗冷却，等待0.5小时后将安瓿瓶正放，观察安瓿瓶头聚山梨酯80附着量。结果上述3种加热温度的样品安瓿瓶头，100℃加热条件聚山梨酯80附着量较少、115℃和121℃加热条件下聚山梨酯80附着量多且附着量基本一致。说明加热温度对聚山梨酯80吐温的提取量有一定影响，选择115℃为最佳加热温度。实验例3研究自然冷却时间对提取聚山梨酯80的影响取参麦注射液9支(10ml规格，安瓿瓶装)，分成3组，每组3支，倒置，于115℃下加热10min，上述三组样品，分别冷却至50℃、75℃、95℃时，倒置取出，用30℃左右水淋洗冷却，等待0.5小时后将安瓿瓶正放，观察安瓿瓶头聚山梨酯80附着量。结果上述冷却温度的样品安瓿瓶头，冷却至50℃样品聚山梨酯80附着量几乎不见、冷却至75℃和95℃样品聚山梨酯80附着量多且附着量基本一致。说明冷却温度对聚山梨酯80吐温的提取量有一定影响，选择75℃以上为最佳冷却终点温度。实验例4研究静置时间对提取聚山梨酯80的影响取参麦注射液9支(10ml规格，安瓿瓶装)，分成3组，每组3支，倒置，于115℃下加热10min，待冷却至80℃时，倒置取出，用30℃左右水淋洗冷却，分别等待0.5小时、1小时、2小时后将安瓿瓶正放，观察安瓿瓶头聚山梨酯80附着量。结果上述等待时间的样品安瓿瓶头，等待0.5小时样品聚山梨酯80附着量最多、等待1小时样品聚山梨酯80附着量减少、等待2小时样品聚山梨酯80附着量进一步减少。说明等待时间对聚山梨酯80吐温的提取量有一定影响，选择等待0.5小时为最佳等待时间。通过以上实验例可确定，提取聚山梨酯80的较佳工艺参数为：加热时间为10min，加热温度为115℃，自然冷却终点温度为75℃以上，冷却后倒置等待时间为0.5小时。采用该条件提取参麦注射液中的聚山梨酯80，进行质量鉴别，具体见实施例1。实施例11、配制两种参麦注射液，一种辅料添加为0.5％聚山梨酯80，另一种辅料添加为0.5％聚山梨酯80(供注射用)。上述两种参麦注射液均经115℃、32min灭菌。2、样品处理：取参麦注射液60支(10ml规格，安瓿瓶装)，分成6组，每组10支，倒置，于115℃下加热10min，待冷却至80℃时，倒置取出，用30℃左右水淋洗冷却，分别等待0.5小时后将安瓿瓶正放(结果如图1所示)。每组分别用5ml的2％氢氧化钠甲醇溶液溶解，即得。吸取2ml溶液，置于50ml锥形瓶中，置水浴中加热回流30分钟，放冷，加14％三氟化硼甲醇溶液2ml，在水浴中加热回流30分钟，放冷，加正庚烷4ml，继续在水浴中加热回流5分钟，放冷，加饱和氯化钠溶液10ml，振摇，静置使分层，取上层，用水洗涤3次，每次用蒸馏水4ml，作为供试品溶液。3、对照品：分别取肉豆蔻酸甲酯、棕榈酸甲酯、棕榈油酸甲酯、硬脂酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯以及油酸甲酯对照品适量，加正庚烷溶解并制成每1ml中各含0.01g的溶液。4、色谱条件及检测法：照气相色谱法(通则0521)试验。以88％氰丙基聚硅氧烷为固定液(液膜厚度0.20μm)的石英毛细管柱(100m×0.25mm)为色谱柱，起始柱温为90℃维持0分钟，以每分钟20℃的速率升温至160℃，维持1分钟，再以每分钟2℃的速率升温至220℃，维持20分钟；进样口温度340℃检测器为氢火焰离子化检测器，温度330℃。理论板数按油酸甲酯峰计算不低于10000。检测：精密吸取供试品溶液和对照品溶液各1μl，注入气相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法以峰面积计算(忽略峰面积小于0.05％的峰)油酸含量。5、检测结果上述样品油酸组成检测结果见下表，从表2中可知聚山梨酯80提取的油酸组成重复性很好。表2参麦注射液提取油酸组成稳定性考察表(2)参麦注射液提取聚山梨酯80油酸组成测定样品的制备：取市售三个厂家聚山梨酯80，和一家聚山梨酯80(供注射用)，分别按参麦注射液法定制法配制得到4种不同辅料添加的参麦注射液，即得(10ml规格)。供试品的制备：取参麦注射液30支，分成3组，每组10支，照重复性研究供试品制备方法进行制备，即得。对照品溶液的制备、色谱条件及检测法与重复性研究相同。检测结果上述样品油酸组成检测结果见下表，从表中可知三个厂家的聚山梨酯80配制的参麦注射液油酸组成含量低，在77％～86％范围内；采用聚山梨酯80(供注射用)配制的参麦注射液油酸含量高，大于97.0％。说明两种聚山梨酯80辅料制成的参麦注射液提取物油酸组成存在显著差别，可以很好的将二者区分开来。表3不同辅料添加的参麦注射液提取油酸组成检测结果(n＝3)注：市售聚山梨酯80(供注射用)仅一个厂家，因此仅研究该厂家辅料。4、小结(1)市场售聚山梨酯80的油酸组成有一定的差异，在77％～88％范围内。(2)聚山梨酯(供注射用)油酸组成大于98％。(3)从参麦注射液中提取的聚山梨酯80油酸组成检测稳定。(4)提取参麦注射液中加入的聚山梨酯80和聚山梨酯80(供注射用)的油酸组成存在很大区别，且其油酸组成与原始辅料油酸组成基本一致。(5)针对上述研究，可确定采用油酸组成指标，可以轻易的鉴别出从参麦注射液中提取出的聚山梨酯80为供注射用还是非注射液。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12