检测生物细胞中两种基因对目标代谢物调控关系的方法与流程

本发明涉及生物技术领域中，检测生物细胞中两种基因对目标代谢物调控关系的方法。

背景技术：

基因电路是将不同基因按一定规则连接在一起，上游基因的蛋白产物调控下游基因的表达，环环相扣，从而完成特定生物学功能，以便进一步控制细胞行为。逻辑电路是以布尔代数为基础的基因电路，其可以用真值表进行非常清晰而简单的描述。用逻辑电路对基因调控进行描述是一种简化手段，复杂的生物学功能被抽象成{0.1}空间的映射关系。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何检测生物细胞中两种基因对目标代谢物调控关系。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测微生物中两种基因对目标代谢物调控关系的方法，所述方法包括：

1)将名称分别为表达盒a和表达盒b的表达盒导入目的生物细胞中，得到重组生物细胞；所述表达盒a含有名称为调控开关a的调控元件和名称为目标基因a的基因，所述调控开关a能调控所述目标基因a的表达；所述表达盒b含有名称为调控开关b的调控元件和名称为目标基因b的基因，所述调控开关b能调控所述目标基因b的表达；所述目的生物细胞能产生目标代谢物；

2)培养所述重组生物细胞，向所述重组生物细胞的培养体系中分别施加物质a和物质b，检测所述目标代谢物的产量，将该产量记为产量1；所述物质a能激活所述调控开关a进而使所述目标基因a得到表达，所述物质b能激活所述调控开关b进而使所述目标基因b得到表达；

培养所述重组生物细胞，向所述重组生物细胞的培养体系中施加所述物质a，检测所述目标代谢物的产量，将该产量记为产量2；

培养所述重组生物细胞，向所述重组生物细胞的培养体系中施加所述物质b，检测所述目标代谢物的产量，将该产量记为产量3；

培养所述重组生物细胞，检测所述重组生物细胞的培养体系中所述目标代谢物的产量，将该产量记为产量4；

比较所述产量1、所述产量2、所述产量3和所述产量4，确定所述目标基因a和所述目标基因b对所述目标代谢物的调控关系：

a1)如所述产量1高于所述产量2、所述产量3和所述产量4，所述产量2和所述产量3均不高于所述产量4，所述目标基因a和所述目标基因b对所述目标代谢物的调控存在或候选存在“与”的关系，即或候选的，所述目标基因a和所述目标基因b对所述目标代谢物的调控存在如下a11)或a12)的关系：

a11)所述目标基因a和所述目标基因b协作促进所述目标代谢物的产生，所述目标基因a和所述目标基因b均不能单独促进所述目标代谢物的产生；

a12)所述目标基因a和所述目标基因b共同存在时对所述目标代谢物的产生无影响，所述目标基因a和所述目标基因b单独存在或均不存在时可以抑制所述目标代谢物的产生；

a2)如所述产量1、所述产量2和所述产量3均高于所述产量4，所述目标基因a和所述目标基因b对所述目标代谢物的调控或候选存在“或”的关系，即或候选的，所述目标基因a和所述目标基因b对所述目标代谢物的调控存在如下a21)或a22)的关系：

a21)所述目标基因a和所述目标基因b均能单独促进所述目标代谢物的产生，也能共同促进所述目标代谢物的产生；

a21)所述目标基因a和所述目标基因b共同存在或单独存在时对所述目标代谢物的产生无影响，所述目标基因a和所述目标基因b均不存在时可以抑制所述目标代谢物的产生；

a3)如所述产量2、所述产量3和所述产量4均高于所述产量1，所述目标基因a和所述目标基因b对所述目标代谢物的调控存在或候选存在“与非”的关系，即或候选的，所述目标基因a和所述目标基因b对所述目标代谢物的调控存在如下a31)或a32)的关系：

a31)所述目标基因a和所述目标基因b不存在或单独存在时可以促进目标代谢物的产生，在共同存在时对所述目标代谢物的产生无影响；

a32)所述目标基因a和所述目标基因b均不能单独抑制所述目标代谢物的产生，但可以共同抑制目标代谢产物产生；

a4)如所述产量1、所述产量2和所述产量3均低于所述产量4，所述目标基因a和所述目标基因b对所述目标代谢物的调控存在或候选存在“或非”的关系，即或候选的，所述目标基因a和所述目标基因b对所述目标代谢物的调控存在如下a41)或a42)的关系：

a41)所述目标基因a和所述目标基因b共同存在或单独存在时对所述目标代谢物的产生无影响，在不存在时可以促进所述目标代谢物的产生；

a42)所述目标基因a和所述目标基因b均能单独抑制所述目标代谢物的产生，也能共同抑制所述目标代谢物的产生；

a5)如所述产量1和所述产量4均高于所述产量2，且所述产量1和所述产量4均高于所述产量3，所述目标基因a和所述目标基因b对所述目标代谢物的调控存在或候选存在“异或”的关系，即或候选的，所述目标基因a和所述目标基因b对所述目标代谢物的调控存在如下a51)或a52)的关系：

a51)所述目标基因a和所述目标基因b单独存在时对所述目标代谢物的产生无影响，在不存在或共同存在时可以促进所述目标代谢物的产生；

a52)所述目标基因a和所述目标基因b单独存在时均抑制所述目标代谢物的产生，但二者同时存在时或同时不存在时不影响所述目标代谢物的产量；

a6)如所述产量2和所述产量3均高于所述产量1，且所述产量2和所述产量3均高于所述产量4，所述目标基因a和所述目标基因b对所述目标代谢物的调控存在或候选存在“同或”的关系，即或候选的，所述目标基因a和所述目标基因b对所述目标代谢物的调控存在如下a61)或a62)的关系：

a61)所述目标基因a和所述目标基因b均能单独促进所述目标代谢物的产生，但二者同时存在时或同时不存在时对所述目标代谢物的产生无影响；

a62)所述目标基因a和所述目标基因b单独存在时对所述目标代谢物的产生无影响，二者同时存在时或同时不存在时可以抑制所述目标代谢物的产生；

所述目标基因a和所述目标基因b在调控所述目标代谢物时存在拮抗作用；

a7)如所述产量1、所述产量2、所述产量3和所述产量4相同，所述目标基因a和所述目标基因b不调控或候选不调控所述目标代谢物，即或候选的，所述目标基因a和所述目标基因b对所述目标代谢物不存在调控关系。

其中，“与”、“或”、“与非”、“或非”、“异或”和“同或”的逻辑关系具体如表1所示。

表1

表1“逻辑关系”列中，1和0表示所述目标代谢物产量，每种逻辑关系列中1代表的所述目标代谢物产量高于0代表的所述目标代谢物产量，不同逻辑关系列间的所述目标代谢物的产量没有可比性，即不能根据“1”和“0”来比较产量的高低。

在所述重组生物细胞的培养体系中不含有所述物质a时，所述目标基因a不表达。在所述重组生物细胞的培养体系中不含有所述物质b时，所述目标基因b不表达。即所述重组生物细胞中所述目标基因a和所述目标基因b不表达。

上述方法中，在检测所述目标代谢物的产量前，还可对添加了所述物质a和/或所述物质b的所述重组生物细胞的培养体系进行培养。

上述方法中，所述目标代谢物的产量的检测通过向所述重组生物细胞中导入报告基因的表达盒实现，将该表达盒记为表达盒d，所述表达盒d含有所述目标代谢物的调控开关，将该调控开关记为调控开关d，所述目标代谢物能通过所述调控开关d正向调控所述报告基因的表达或负向调控所述报告基因的表达。在所述目标代谢物通过所述调控开关d正向调控所述报告基因的表达时，所述重组生物细胞中所述目标代谢物的含量在大于等于所述调控开关d的激活阈值时，所述报告基因表达；所述重组生物细胞中所述目标代谢物的含量小于所述激活阈值时，所述报告基因不表达。在所述目标代谢物通过所述调控开关d负向调控所述报告基因的表达时，所述重组生物细胞中所述目标代谢物的含量在大于等于所述调控开关d的激活阈值时，所述报告基因不表达；所述重组生物细胞中所述目标代谢物的含量小于所述激活阈值时，所述报告基因表达。所述激活阈值可通过实验获得，根据具体的目标代谢产物与对应调控开关的不同而不同。

所述目标代谢物可为c-di-gmp或l-赖氨酸。所述调控开关d可为c-di-gmp或l-赖氨酸的调控开关。所述c-di-gmp的调控开关具体可为序列表中序列3的第172-653位所示的dna片段。所述l-赖氨酸的调控开关具体可为序列表中序列4的第172-477位所示的dna片段。在实际研究中可替换为需要研究的目标代谢产物与对应调控开关的组合。

所述报告基因具体可为荧光蛋白基因。所述荧光蛋白基因具体可为amcyan基因。

上述方法中，所述表达盒a、所述表达盒b和所述表达盒d还含有启动子和/或终止子。

所述启动子可为启动子p/otac或启动子pbe。所述启动子p/otac的序列具体可为序列表中序列1的第7-127位。所述启动子pbe的序列具体可为序列表中序列3的第7-165位。

所述终止子可为thebacteriophageλtr1transcriptionterminator。所述终止子的序列具体可为序列表中序列1的第3304-3464位。

将所述表达盒a和所述表达盒b导入目的生物细胞中可通过将含有所述表达盒a和所述表达盒b的重组载体导入所述目的生物细胞中获得，也可通过将分别含有所述表达盒a和所述表达盒b的两个重组载体导入所述目的生物细胞中获得。

在本发明的一个实施例中，将所述表达盒a和所述表达盒b导入目的生物细胞中通过将含有所述表达盒a和所述表达盒b的重组载体导入所述目的生物细胞中获得。所述重组载体为将saci和xhoi间的识别序列替换为所述表达盒a和所述表达盒b连接得到的dna片段得到。

上述方法中，所述调控开关a和所述调控开关b均可为核糖开关。

上述方法中，所述核糖开关a可为核糖开关m6；所述核糖开关b可为核糖开关adda。

上述方法中，所述核糖开关m6可为序列表中序列1的第134-243位所示的dna片段；所述核糖开关adda可为序列表中序列1的第1949-2058位所示的dna片段。

上述方法中，所述物质a可为amm配体(三聚氰酸二酰胺)，所述物质可b为2-ap配体(2-氨基嘌呤)。

上述方法中，所述生物细胞可为微生物。所述微生物可为细菌。所述细菌具体可为大肠杆菌。

本发明还提供了成套试剂，所述成套试剂为下述x1)、x2)或x3)：

x1)由所述表达盒a和所述表达盒b组成的成套试剂；

x2)由所述表达盒a、所述物质a、所述表达盒b和所述物质b组成的成套试剂；

x3)由所述表达盒a、所述物质a、所述表达盒b和所述物质b以及所述表达盒d组成的成套试剂。

所述成套试剂可用于检测生物细胞中两种基因对目标代谢物调控关系。

本发明还提供了所述成套试剂在检测生物细胞中两种基因对目标代谢物调控关系中的应用。

本发明提供的检测生物细胞中两种基因对目标代谢物调控关系的方法，可以在大量不同种类细菌中应用，通过理论形成的基因逻辑电路种类从而推断出基因对这一代谢物及代谢通路的影响,使多基因调控机制验证更加简单快捷，并通过上游载体调控目标基因的表达使目标代谢物直接作用于下游载体中目标代谢物的感应元件，使输出可视化显示。本发明具有细菌基因分析的通用性，m6及adda核糖开关元件在多种菌株体内都是可用的，只需改变目的宿主菌启动子及代谢产物感应元件即可搭建该电路；多基因验证的简捷性，严谨的逻辑运算关系可使基因调控机制一目了然，与传统多基因验证方法相比减少了载体的构建和验证的步骤。1.传统多基因验证方法首先要分别构建目标基因a和b的表达载体，其后构建同时表达a，b的载体，载体构建复杂且耗时。2.a、b两目标基因同时验证时，传统方法需要4个步骤，只让目标基因a表达，目标基因b不表达；目标基因b表达，目标基因a不表达；目标基因a与b同时表达；目标基因a与b同时不表达。且该方法需要分别测定代谢产物的表达情况，实验设计复杂，需要多次测定。本发明中所述基因电路的验证方法不仅步骤减少，通过加入报告基因，使得输出可视化显示，通过均不加入目标基因a、b激活物，分别加入目标基因a、b激活物，共同加入目标基因a、b激活物，得到四组数据，将这四组数据对照逻辑关系真值表，可判断目标基因a、b与目标代谢物的调控关系。3、使用本发明中所述的方法进行基因调控关系分析验证，可显著提高效率，可比传统方法缩短四分之三的实验周期。

附图说明

图1为各重组载体的结构示意图。prp0122-lys表示pvla，prp0122-cmp表示pvca，lysc²表示lysc^for。

图2为m-p-m6-amcyan和m-p-adda-amcyan的相对荧光强度。

图3为基因电路中上游载体受控基因表达产物分析。左图为e-pvmap的体系中的c-di-gmp产物的产量，右图为e-pvmac的体系中的l-赖氨酸产物的产量。

图4为两种逻辑关系下荧光信号强度的结果。左图为实施例1步骤四中“或”逻辑关系(e-pvmap-pvca的体系)，右图为实施例1步骤四中“或非”逻辑关系(e-pvmac-pvla的体系)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna的3′末端核苷酸。

载体pbluescriptiiks(+)：北京华越洋，vcet9002。

下述实施例中的载体prp0122为文献(zhouetal.,characterizationofanaturaltripletandemc-di-gmpriboswitchandapplicationoftheriboswitch-baseddual-fluorescencereporter,scientificreports|6:20871|doi:10.1038/srep20871)figures8.中的prp0122，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的e.coli(mg1655)和e.coli(wmr)均记载在(wangetal.,evolutionofachimericaspartatekinaseforl-lysineproductionusingasyntheticrnadevice,applmicrobiolbiotechnol(2015)99:8527–8536)一文中，公众可从申请人处获得这两种生物材料，这两种生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。e.coli(wmr)为降低了e.coli(mg1655)的l-赖氨酸下游消耗的水平的改造菌株。

实施例1、两种基因对目标代谢物的调控的检测

本实施例通过两个基因电路实验检测两种目标基因对目标代谢物的调控关系：1、目标基因a和b分别为pled基因和ydam基因，调控开关a和b分别为核糖开关m6和核糖开关adda，目标代谢物为c-di-gmp，报告基因为amcyan基因，pled基因和ydam基因均能独立也能共同在大肠杆菌中促进c-di-gmp的产生，c-di-gmp能通过调控调控开关c-di-gmp以使调控开关c-di-gmp下游的amcyan基因得到表达；2、目标基因a和b分别为lysc^for基因和lysa基因，调控开关a和b分别为核糖开关m6和核糖开关adda，目标代谢物为l-赖氨酸，报告基因为amcyan基因，lysc^for基因和lysa基因均能独立也能共同在大肠杆菌中促进l-赖氨酸的产生，l-赖氨酸能抑制调控开关lysc以使调控开关lysc下游的amcyan基因不表达。具体方法如下：

一、重组载体的构建

pvmap：将载体pbluescriptiiks(+)的saci和xhoi间的识别序列间的dna片段替换为序列表中序列1所示的dna片段m6-pled-adda-ydam，得到重组载体，将该重组载体命名为pvmap。pvmap的结构示意图如图1所示，pvmap中含有pled表达盒和ydam表达盒，pled表达盒依次包括启动子p/otac、核糖开关m6、pled基因和终止子(thebacteriophageλtr1transcriptionterminator)，该表达盒中pled基因的表达由启动子p/otac驱动，由核糖开关m6调控，由终止子终止；ydam表达盒依次包括启动子p/otac、核糖开关adda、ydam基因和终止子，该表达盒中ydam基因的表达由启动子p/otac驱动，由核糖开关adda调控，由终止子终止。

序列1中，第7-127位为启动子p/otac的序列，第134-243位为核糖开关m6的序列，第250-1652位为pled基因的序列，第1661-1821位为终止子的序列，第1822-1942位为启动子p/otac的序列，第1949-2058位为核糖开关adda的序列，第2065-3297位为ydam基因的序列，第3304-3464位为终止子的序列。

pvmac：将载体pbluescriptiiks(+)的saci和xhoi间的识别序列间的dna片段替换为序列表中序列2所示的dna片段m6-lysc^for-adda-lysa，得到重组载体，将该重组载体命名为pvmac。pvmac的结构示意图如图1所示，pvmac中含有lysc^for表达盒和lysa表达盒，lysc^for表达盒依次包括启动子p/otac、核糖开关m6、lysc^for基因和终止子，该表达盒中lysc^for基因的表达由启动子p/otac驱动，由核糖开关m6调控，由终止子终止；lysa表达盒依次包括启动子p/otac、核糖开关adda、lysa基因和终止子，该表达盒中lysa基因的表达由启动子p/otac驱动，由核糖开关adda调控，由终止子终止。

序列2中，第7-127位为启动子p/otac的序列，第134-243位为核糖开关m6的序列，第250-1613位为lysc^for基因的序列，第1622-1782位为终止子的序列，第1783-1903位为启动子p/otac的序列，第1910-2019位为核糖开关adda的序列，第2026-3288位为lysa基因的序列，第3295-3455位为终止子的序列。

pvca：将载体prp0122的hindiii和xhoi间的dna片段替换为序列表中序列3所示的dna片段c-di-gmp-amcyan，得到重组载体，将该重组载体命名为pvca。pvca的结构示意图如图1中prp0122-cmp所示，pvca中含有amcyan表达盒，amcyan表达盒包括启动子pbe、调控开关c-di-gmp和amcyan基因，该表达盒中amcyan基因的表达由启动子pbe驱动，受调控开关c-di-gmp调控，调控开关c-di-gmp受c-di-gmp的调节。

序列3中，第7-165位为启动子pbe的序列，第172-653位为调控开关c-di-gmp的序列，第660-1365位为amcyan基因的序列。

pvla：将载体prp0122的hindiii和xhoi间的dna片段替换为序列表中序列4所示的dna片段lysc-amcyan，得到重组载体，将该重组载体命名为pvla。pvla的结构示意图如图1中prp0122-lys所示，pvla中含有amcyan表达盒，amcyan表达盒包括启动子pbe、调控开关lysc和amcyan基因，该表达盒中amcyan基因的表达由启动子pbe驱动，受调控开关lysc调控，调控开关lysc受l-赖氨酸的调节。

序列4中，第7-165位为启动子pbe的序列，第172-477位为调控开关lysc的序列，第484-1189位为amcyan基因的序列。

二、核糖开关配体浓度确定

1、载体的构建

将载体pbluescriptiiks(+)的xhoi和saci识别序列间的dna片段替换为序列表中序列5所示的dna分子，得到重组载体，将该重组载体命名为p-m6-amcyan。其中，序列5的第7-127位为启动子p/otac的序列，第134-243位为核糖开关m6的序列，第250-955位为荧光蛋白amcyan编码基因的序列。

将载体pbluescriptiiks(+)的xhoi和saci识别序列间的dna片段替换为序列表中序列6所示的dna分子，得到重组载体，将该重组载体命名为p-adda-amcyan。其中，序列6的第7-127位为启动子p/otac的序列，第134-243位为核糖开关adda的序列，第250-955位为荧光蛋白amcyan编码基因的序列。

2、核糖开关配体浓度确定

将p-m6-amcyan导入e.coli(mg1655)中，得到重组载体，将该重组载体命名为m-p-m6-amcyan；将p-adda-amcyan导入e.coli(mg1655)中，得到重组载体，将该重组载体命名为m-p-adda-amcyan。

amm配体(三聚氰酸二酰胺)可以调控核糖开关m6诱导下游基因的表达，2-ap配体(2-氨基嘌呤)可以调控核糖开关adda诱导下游基因的表达，确定最佳配体浓度的操作步骤如下：

m6和adda核糖开关是激活型开关，所以依次提高相应配体物浓度其荧光表达升高。将m-p-m6-amcyan在含有1mmiptg的m9培养基中培养一小时后，分别加入不同量的amm配体(m6核糖开关配体物)，amm配体在培养体系中的浓度分别为0μm、1μm、10μm、50μm、100μm、200μm，培养10h后取100μl来自不同配体物浓度诱导下的菌液，检测荧光强度与od620，计算rfi。利用pbluescriptiiks(+)作为对照。

按照上述方法，将m-p-m6-amcyan替换为m-p-adda-amcyan，将amm替换为2-ap，其他步骤均不变，检测不同浓度2-ap对核糖开关adda的影响。

检测m-p-m6-amcyan和m-p-adda-amcyan的相对荧光强度，相对荧光强度的计算方法如下：读取诱导孔荧光值(w)和对照孔荧光值(z)，然后除以相应孔620nm处的吸光度(u)，以使细胞密度标准化，得到每个孔的相对荧光强度，利用如下公式计算相对荧光强度(rfi)：rfi＝(w/uw-z/uz)/(z/uz)，uw为诱导孔的吸光度，uz为对照孔的吸光度。结果(图2)显示，在m6与adda核糖开关调控下报道基因(amcyan基因)的相对荧光强度随着配体浓度的增加而增加。在amm配体浓度达到100μm时，由m6核糖开关诱导的荧光强度接近饱和；在2-ap配体浓度达到100μm时，由adda核糖开关诱导的荧光强度接近饱和。所以利用浓度为100μm的amm配体和浓度为100μm的2-ap配体进行进一步的实验。

三、两种基因对产物的调控分析

将pvmap导入e.coli(mg1655)中，将pvmac导入e.coli(wmr)中，将载体pbluescriptiiks(+)导入e.coli(mg1655)中，将得到的重组菌分别命名为e-pvmap、e-pvmac和e-pb。已知，在大肠杆菌中，pled基因和ydam基因均可正向调控c-di-gmp的产生；在大肠杆菌中，lysc^for基因和lysa基因均可正向调控l-赖氨酸的产生。利用如下方法分别检测e-pvmap和e-pvmac中c-di-gmp和l-赖氨酸的产量，并利用e-pb作为对照。c-di-gmp通过lc-ms/ms检测，l-赖氨酸通过hplc检测。

将e-pvmap在含有1mmiptg的m9培养基中培养一小时后，分别按照如下任一组合方式加入amm配体和2-ap配体：①100μmamm配体和100μm2-ap配体；②0μmamm配体和100μm2-ap配体；③100μmamm配体和0μm2-ap配体；④0μmamm配体和0μm2-ap配体，各浓度均为相应物质在培养体系中的浓度，培养10h后取100μl菌液，检测c-di-gmp。利用e-pb作为对照。

c-di-gmp检测方法如下：

仪器：hp1100高效液相色谱仪：hpdegasser(在线脱气机),hpquatpμmp(四元梯度泵)，hpals(自动进样器)，hpcolcomp(柱温箱)，hpdad(二极管阵列检测器)。

色谱条件：色谱柱及规格：eclipseaaa4.6×150mm3.5μm；流动相：a：40mmnah2po4(6.24gnah2po4溶解于1000ml水中，naoh调节ph为7.8)；b：h2o:meoh:ch3cn＝10:45:45(体积比)；流速：2ml/min；检测波长：340nm；柱温：40℃。

将e-pvmac在含有1mmiptg的m9培养基中培养一小时后，分别按照如下任一组合方式加入amm配体和2-ap配体：①100μmamm配体和100μm2-ap配体；②0μmamm配体和100μm2-ap配体；③100μmamm配体和0μm2-ap配体；④0μmamm配体和0μm2-ap配体，各浓度均为相应物质在培养体系中的浓度，培养10h后取100μl菌液，检测l-赖氨酸。利用e-pb作为对照。

l-赖氨酸检测方法如下：

采用外标法，配置100pmol/μl的l-赖氨酸标准品制成对照样品，与待测样品一起处理并检测。对照样品与待测样品必须在相同的色谱条件下测定，将对照样品的峰面积图谱与被测样品的峰面积图谱进行比较求得被测样品中l-赖氨酸的含量，其最终浓度单位为pmol/μl。

实验结果(图3)表明，在e-pvmap的体系中，amm与2-ap都加入或只加入其一时，其c-di-gmp的含量显著高于最后一种情况(即amm与2-ap均不添加)，最后一种情况下体系中c-di-gmp的含量与e-pb的体系无显著差异，表明，pled基因和ydam基因对c-di-gmp的调控符合表2中的“或”的逻辑关系，构成相关逻辑关系，与已知内容一致。

在e-pvmac的体系中，只有amm与2-ap同时加入时，其l-赖氨酸含量最高，并均分别显著高于amm与2-ap只添加其一或都不添加的e-pvmac的体系，且amm与2-ap只添加其一或都不添加的e-pvmac的体系中l-赖氨酸的含量与e-pb的体系均无显著差异，表明，lysc^for基因和lysa基因对l-赖氨酸的调控符合表2中的“或”的逻辑关系，构成相关逻辑关系，与已知内容一致。

表2、基因电路构成逻辑关系真值表

注：“逻辑关系”列中，1和0表示目标代谢物产量，每种逻辑关系列中1代表的目标代谢物产量高于0代表的目标代谢物产量，不同逻辑关系列间的目标代谢物的产量没有可比性，即不同逻辑关系列间的目标代谢物不能根据“1”和“0”来比较产量的高低。

四、两种基因对产物的调控分析

通过m6，adda核糖开关配体amm，2-ap的最佳诱导浓度添加来测量报告基因(即amcyan基因)表达的amcyan的相对荧光强度，从而确定两种基因对产物的调控情况。其中，c-di-gmp可以激活pvca载体中的调控开关c-di-gmp从而使amcyan基因得到表达，l-赖氨酸可以激活pvla载体中的调控开关lysc从而抑制amcyan基因的表达。

将pvmap和pvca导入e.coli(mg1655)中，将得到的重组菌命名为e-pvmap-pvca；将pvmap和载体pbluescriptiiks(+)导入e.coli(mg1655)中，将得到的重组菌命名为e-pvmap-pb；将pvmac和pvla导入大肠杆菌e.coli(wmr)中，将得到的重组菌命名为e-pvmac-pvla；将pvmac和载体pbluescriptiiks(+)导入大肠杆菌e.coli(wmr)中，将得到的重组菌命名为e-pvmac-pb。

按照如下方法通过检测amcyan的相对荧光强度确定两种基因对产物的调控的情况，并分别利用e-pvmap-pb和e-pvmac-pb作为对照。

将e-pvmap-pvca在含有1mmiptg的m9培养基中培养一小时后，分别按照如下任一组合方式加入amm配体和2-ap配体：①100μmamm配体和100μm2-ap配体；②0μmamm配体和100μm2-ap配体；③100μmamm配体和0μm2-ap配体；④0μmamm配体和0μm2-ap配体，各浓度均为相应物质在培养体系中的浓度，培养10h后取100μl菌液，检测荧光强度与od620，计算rfi。利用e-pvmap-pb作为对照。

将e-pvmac-pvla在含有1mmiptg的m9培养基中培养一小时后，分别按照如下任一组合方式加入amm配体和2-ap配体：①100μmamm配体和100μm2-ap配体；②0μmamm配体和100μm2-ap配体；③100μmamm配体和0μm2-ap配体；④0μmamm配体和0μm2-ap配体，各浓度均为相应物质在培养体系中的浓度，培养10h后取100μl菌液，检测荧光强度与od620，计算rfi。利用e-pvmac-pb作为对照。

实验结果表明(图4)，在e-pvmap-pvca的体系中，amm与2-ap单独加入或都加入时，amcyan的相对荧光强度均较高，且均显著高于二者均不加入的体系，二者均不加入的体系中amcyan的相对荧光强度与e-pvmap-pb的体系均无显著差异，表明，pled基因和ydam基因对c-di-gmp及amcyan的调控符合表3中的“或”的逻辑关系，构成相关逻辑关系，与已知内容一致。

在e-pvmac-pvla的体系中，只有amm与2-ap都不加入时，amcyan的相对荧光强度最高，并均分别显著高于amm与2-ap只添加其一或都添加的e-pvmac-pvla的体系，且amm与2-ap只添加其一或都添加的e-pvmac-pvla的体系中amcyan的相对荧光强度与e-pvmac-pb的体系均无显著差异，表明，lysc^for基因和lysa基因对amcyan的调控符合表3中的“或非”的逻辑关系，lysc^for基因和lysa基因对l-赖氨酸的调控符合表3中的“或”的逻辑关系，构成相关逻辑关系，与已知内容一致。

表3、电路构成逻辑关系真值表

注：“逻辑关系”列中，0表示报告基因不表达，1表示报告基因表达。

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>检测生物细胞中两种基因对目标代谢物调控关系的方法

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>3464

<212>dna

<213>人工序列

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