本发明涉及蜂王浆检测技术领域，更具体的说，它涉及一种蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法。
背景技术
蜂王浆是工蜂食用花粉后分泌的一种乳状物，蜂王浆中富含多中人体所需的营养成分，如氨基酸、维生素、微量元素和矿物质等，具有降低胆固醇、防衰老、保护肝脏、降血脂、增强免疫力、促进组织再生等功能。
花源植物由于易感染病虫害，常会被喷洒各种农药，现农药中使用较多的是多菌灵杀菌剂，多菌灵是高效低毒内吸性杀菌剂，有内吸治疗和保护作用，它的作用机理是干扰花源植物中病原菌在有丝分裂过程中纺锤体的形成，进而影响病原菌的细胞分裂，起到杀死病菌的作用；与多菌灵作用机理相同的一类杀菌剂有甲基托布津和乙基托布津；工蜂在食用喷洒过农药的花粉后，在分泌蜂王浆时，农药中某些成分会残留在蜂王浆内，若蜂王浆中农药成分过量，会对人体造成不利影响，因此需要对蜂王浆内多菌灵、甲基托布津和乙基托布津进行检测。
现有标准gbt20769《水果和蔬菜中450中农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》中用液相色谱-串联质谱法测定蜂王浆中多菌灵，但并没有记载甲基托布津和乙基托布津的检测方法；现有标准gb/t30771-2008《蜂蜜中486种农药及相关化学拼残留量的测定液相色谱-串联质谱法》中有蜂王浆中多菌灵和甲基托布津的检测方法，但没有乙基托布津的检测方法，且液相色谱-串联质谱法需要使用有机溶剂在分液漏斗中液液萃取2次，浓缩2次，再固液萃取2次，操作较为繁琐。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法，其通过用弱碱性甘氨酸-盐酸缓冲液对蜂王浆进行前处理，能够同时检测多菌灵、甲基托布津和乙基托布津且方法简单、快速、灵敏。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法，包括以下步骤：
(1)标准溶液的配制：
1.1标准储备液：分别称取多菌灵、甲基托布津和乙基托布津，均用乙腈作溶剂定容在100ml的容量瓶中，配制成质量溶度为100mg/l的标准储备液，然后放在4℃下避光保存；
1.2标准工作液：分别量取所述多菌灵标准储备液、甲基托布津标准储备液和乙基托布津标准储备液，并将三种标准储备液混合均匀，再用乙腈进行稀释，配制成1mg/l和0.1mg/l的混合标准溶液，然后放在4℃下避光保存；
1.3内标储备液：分别称取一定量的内标多菌灵d3和内标吡虫啉d4，用适量甲醇作溶剂，并定容在100ml的容量瓶中，配制成质量浓度为100mg/l的内标储备液，然后放在4℃下避光保存；
1.4内标工作液：分别量取一定量的多菌灵d3内标储备液和吡虫啉d4内标储备液，用甲醇定容，将多菌灵d3内标储备液的质量浓度配制成100ng/l，制成多菌灵d3内标工作液，将吡虫啉d4内标储备液的质量浓度配制成100ng/l，制成吡虫啉d4内标工作液；
(2)蜂王浆前处理：称取2g蜂王浆，放置在离心管中，加入0.1ml吡虫啉d4内标工作液和0.1ml多菌灵d3内标工作液，旋涡混匀，再加入质量浓度为30％的乙醇涡旋使溶液充分溶解，再加入ph值为7.5-8的甘氨酸-盐酸缓冲液15ml，旋涡振荡1min，超声波处理15min；
(3)蜂王浆后处理：用活化后的hlb固相萃取柱，取上清液上样，用5ml水润洗小柱，再用5ml乙腈洗脱，洗脱液在40-45℃下水浴下氮气吹干，用5ml体积比为1：1的乙腈和水溶液溶解并定容至1ml，过0.22um油系微孔滤膜，得滤液；
(4)色谱检测：用sepaxgp-c18色谱柱(150mm×4.6mm，5um)进行检测；
(5)质谱检测：离子源：电喷雾离子源(esi)；扫描方式：正离子扫描模式；检测模式：多反应检测模式；喷雾电压：3000v；毛细管温度：350℃；雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气；雾化气压为450kpa；辅助加热气压：350kpa；气帘气压70kpa，碰撞气压：40kpa。
通过采用上述技术方案，先用乙醇溶解蜂王浆，使蜂王浆完全溶解，无颗粒物，蜂王浆本身偏酸性，溶于水后也呈酸性，本发明所要检测的三个成分偏碱性，在蜂王浆的乙醇溶液中呈分子状态，难以被提取到有机溶剂中，用乙醇先溶解蜂王浆，能够使蜂王浆溶解完全，再用ph在7.5-8之间呈弱碱性的甘氨酸-盐酸缓冲液溶解和稀释蜂王浆，保证溶液在ph为7.5-8之间，待检测物质呈分子状态，有利于后续有机溶剂提取或固相萃取净化，利用超声波处理，溶解残渣，提高有机溶剂的提取；
因为蜂王浆中含有大量的糖类，会影响目标物的提取，分散固相萃取并不能去除蜂王浆中的各种杂质，从而导致基质抑制，而使回收率较低，且多菌灵、甲基托布津和乙基托布津的分子结构中均含氨基，且多菌灵具有一定的极性，甲基托布津和乙基托布津的极性较小，用hlb固相萃取柱进行净化，同时使用同位素内标法定量，净化效果好，回收率更高、更稳定；
在质谱检测中，使用正离子模式进行电离，因为多菌灵、甲基托布津和乙基托布津和同位素内标多菌灵d3和吡虫啉d4的分子结构中，均含有氨基，容易分解成正离子，所以需要采用正离子模式进行电离。
本发明进一步设置为：所述ph值为7.5-8的甘氨酸-盐酸缓冲液溶液的配制方法为：取50ml浓度为0.2mol/l的甘氨酸和5ml浓度为0.2mol/l的盐酸，加水稀释至200ml，再用5mol/l的氨水调节至ph值为7.5-8，加水至1000ml。
通过采用上述技术方案，50ml浓度为用0.2mol/l的甘氨酸和5ml浓度为0.2mol/l盐酸，加水稀释至200ml，用氨水调节后ph能够为7.7-8之间，使待检测物呈分子状态，有利于后续有机溶剂的提取和固相萃取净化。
本发明进一步设置为：所述步骤(3)中小柱润洗后用2ml空气吹干。
通过采用上述技术方案，用压缩空气吹干时，风压较大，气流量比较大，可以把水珠吹掉，提高效率。
本发明进一步设置为：所述步骤(2)中超声波处理后的溶液要在转速为5000r/min，离心半径为6cm的条件下离心5min。
通过采用上述技术方案，利用超声波处理后的溶液进行离心处理，可进一步去除蜂王浆中的杂质和残渣。
本发明进一步设置为：所述步骤(3)中活化hlb萃取柱的方法为：先用5ml的甲醇活化，再用5ml的水活化。
通过采用上述技术方案，用甲醇先活化，能够打开键合在萃取柱上的碳基团链，使碳基团链充分发生作用，与碳链互溶，再用水活化，能够和待检测液相溶。
本发明进一步设置为：所述步骤(2)中加入ph值为7.5-8的甘氨酸-盐酸缓冲液前，加入15g无水硫酸钠，用力振摇6min。
通过采用上述技术方案，因为样品中含有水，用乙醇溶解后，上层样液中仍然含有水，溶于水的极性化合物会影响样品的净化效果，添加无水硫酸钠，可完全脱除样液中的水，提高样品的净化效果。
本发明进一步设置为：所述步骤(3)中上样速率为5ml/min。
通过采用上述技术方案，控制上样速率为5ml/min，能够使样品溶液滴加速度较慢，使样品充分得到检测。
本发明进一步设置为：所述步骤(4)中检测条件为：柱温：30；进样量：20ul；流速：0.25ml/min；流动相：a相为0.5mmol/l乙酸铵水溶液，含有1％的甲酸，b相为甲醇；采用梯度洗脱方式：0-6.5min，95％a-50％a；6.5-7.5min，50％a-5％a；7.5-12min，5％a；12-12.1min，5％a-95％a；12.1-16min，95％a。
通过采用上述技术方案，a相采用含有甲酸的乙酸铵水溶液，b相采用甲醇，灵敏度较好，可以达到基线分离，采用梯度洗脱方式，可以使样品中三个组分差异较大的组分有各自适宜的容量因子，且使三个组分从样品中在最短时间内分离。
综上所述，本发明相比于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明通过采用甘氨酸-盐酸缓冲液，对蜂王浆进行溶解和稀释，且甘氨酸-盐酸缓冲液的ph值为7.5-8，能够使待检测物质呈分子状态，便于后续有机溶剂的萃取和固相萃取净化；
(2)本发明通过使用正离子模式进行电离，能够使多菌灵、甲基托布津和乙基托布津以及同位素内标多菌灵d3、吡虫啉d4中的氨基电离完全；
(3)本发明通过使用梯度洗脱方式，能够使三个待检测物质快速从样品溶液中脱离，达到较好的脱离效果；
(4)本发明采用含有甲酸的乙酸铵水溶液作为a相，以甲醇作为b相，三种待检测物的色谱检测中缝形对称。
附图说明
图1为多菌灵在蜂王浆中的标准曲线图；
图2为甲基托布津在蜂王浆中的标准曲线图；
图3为乙基托布津在蜂王浆中的标准曲线图；
图4为实施例1中流动相检测蜂王浆中多菌灵、甲基托布津和乙基托布津的总离子流色谱图；
图5为对比例7中流动相检测蜂王浆中多菌灵、甲基托布津和乙基托布津的总离子流色谱图。
具体实施方式
实施例1：一种蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)标准溶液的配制：
1.1标准储备液：分别称取多菌灵、甲基托布津和乙基托布津，均用乙腈作溶剂定容在100ml的容量瓶中，配制成质量溶度为100mg/l的标准储备液，然后放在4℃下避光保存；
1.2标准工作液：分别量取所述多菌灵标准储备液、甲基托布津标准储备液和乙基托布津标准储备液，并将三种标准储备液混合均匀，再用乙腈进行稀释，配制成1mg/l和0.1mg/l的混合标准溶液，然后放在4℃下避光保存；
1.3内标储备液：分别称取一定量的内标多菌灵d3和内标吡虫啉d4，用适量甲醇作溶剂，并定容在100ml的容量瓶中，配制成质量浓度为100mg/l的内标储备液，然后放在4℃下避光保存；
1.4内标工作液：分别量取一定量的多菌灵d3内标储备液和吡虫啉d4内标储备液，用甲醇定容，将多菌灵d3内标储备液的质量浓度配制成100ng/l，制成多菌灵d3内标工作液，将吡虫啉d4内标储备液的质量浓度配制成100ng/l，制成吡虫啉d4内标工作液；
(2)蜂王浆前处理：称取2g蜂王浆，放置在离心管中，加入0.1ml吡虫啉d4内标工作液和0.1ml多菌灵d3内标工作液，旋涡混匀，再加入质量浓度为30％的乙醇涡旋使溶液充分溶解，加入15g无水硫酸钠，用力振摇6min；
再加入ph值为7.5的甘氨酸-盐酸缓冲液15ml，旋涡振荡1min，超声波处理15min；在转速为5000r/min，离心半径为6cm的条件下离心5min；先用5ml的甲醇活化hlb固相萃取柱，再用5ml的水活化hlb固相萃取柱，取上清液上样，上样速率为5ml/min，用5ml水润洗小柱，小柱润洗后用2ml空气吹干，再用5ml乙腈洗脱，洗脱液在40℃下水浴下氮气吹干，用5ml体积比为1：1的乙腈和水溶液溶解并定容至1ml，过0.22um油系微孔滤膜，得滤液；其中ph值为7.5的甘氨酸-盐酸缓冲液溶液的配制方法为：取50ml浓度为0.2mol/l的甘氨酸和5ml浓度为0.2mol/l的盐酸，加水稀释至200ml，再用5mol/l的氨水调节至ph值为7.5，加水至1000ml；
(3)色谱检测：用sepaxgp-c18色谱柱(150mm×4.6mm，5um)进行检测，检测条件为：柱温：30；进样量：20ul；流速：0.25ml/min；流动相：a相为0.5mmol/l乙酸铵水溶液，含有1％的甲酸，b相为甲醇；采用梯度洗脱方式：0-6.5min，95％a-50％a；6.5-7.5min，50％a-5％a；7.5-12min，5％a；12-12.1min，5％a-95％a；12.1-16min，95％a；
(4)质谱检测：离子源：电喷雾离子源(esi)；扫描方式：正离子扫描模式；检测模式：多反应检测模式；喷雾电压：3000v；毛细管温度：350℃；雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气；雾化气压为450kpa；辅助加热气压：350kpa；气帘气压70kpa，碰撞气压：40kpa。
实施例2：一种蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法，与实施例1的区别在于，甘氨酸-盐酸缓冲液的ph值为7.8。
实施例3：一种蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法，与实施例1的区别在于，甘氨酸-盐酸缓冲液的ph值为8。
对比例1：一种蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法，与实施例1的区别在于，甘氨酸-盐酸缓冲液的ph值为4.3。
对比例2：一种蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法，与实施例1的区别在于，甘氨酸-盐酸缓冲液的ph值为12.7。
对比例3：一种蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法，与实施例1的区别在于，ph值为7.5的甘氨酸-盐酸缓冲液用ph值为7.5的三氨基甲烷-盐酸缓冲液。
对比例4：一种蜂王浆多菌灵类成分的检测方法，与实施例1的区别在于，所用提取液为体积比为1:1的正己烷-丙酮。
对比例5：一种蜂王浆多菌灵类成分的检测方法，与实施例1的区别在于，所用提取液为体积比为1:1的正己烷-二氯甲烷。
对比例6：一种蜂王浆多菌灵类成分的检测方法，与实施例1的区别在于，使用c18固相萃取柱代替hlb固相萃取柱。
对比例7：一种蜂王浆多菌灵类成分的检测方法，与实施例1的区别在于，步骤(3)色谱检测中使用的a相和b相参考食品安全质量检测学报低7卷第11期《全自动固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中3中农药残留》中所用的a相0.1％甲酸水溶液，b相甲醇。
1、标准曲线的绘制：按照实施例1中的方法检测蜂王浆，多菌灵、甲基托布津和乙基托布津均采用内标法定量，多菌灵的内标物为多菌灵d3内标物，甲基托布津和乙基托布津的内标物为吡虫啉d4内标物，以标准品的峰面积和内标物的峰面积的比值为纵坐标，以标准品的质量浓度(mg/l)为横坐标，绘制标准曲线，图1为多菌灵在蜂王浆中的标准曲线，图2为甲基托布津在蜂王浆中的标准曲线，图3为乙基托布津在蜂王浆中的标准曲线。
由图1可以看出，多菌灵在0.002-0.01mg/l范围内线性关系良好，线性方程为y＝0.0855x+0.0976，相关系数r2为1。
由图2可以看出，甲基托布津在0.001-0.01mg/l范围内线性关系良好，线性方程为y＝0.0707x+0.0329，相关系数r2为0.9998。
由图2可以看出，乙基托布津在0.001-0.01mg/l范围内线性关系良好，线性方程为y＝0.118x+0.0542，相关系数r2为0.9996。
检出限为3倍信噪比，定量限为10倍信噪比，多菌灵、甲基托布津和乙基托布津的定量限为0.005mg/kg。
2、前处理对蜂王浆中多菌灵、甲基托布津和乙基托布津回收率和精密度的影响检测：对市售的50批蜂王浆样品进行检测，选择5ug、10ug、20ug/kg的三个添加水平对按照实施例1-3和对比例1-3中的检测方法对蜂王浆样品进行加标实验，检测步骤(2)中ph至为7.5-8的甘氨酸-盐酸缓冲液对蜂王浆中多菌灵、甲基托布津和乙基托布津回收率和精密度的影响，测试结果如表1所示。
表1蜂王浆中多菌灵、甲基托布津和乙基托布津的加标回收率和相对标准偏差测试结果
由表1可知实施例1-2中利用ph值为7.5-8之间的甘氨酸-盐酸缓冲液，蜂王浆中多菌灵、甲基托布津和乙基托布津的回收率和精密度较高，而对比例1和对比例2中分别利用酸性和碱性的甘氨酸-盐酸缓冲液，蜂王浆中多菌灵、甲基托布津和乙基托布津的回收率和精密多较低。
3、提取液对蜂王浆中多菌灵、甲基托布津和乙基托布津回收率和精密度的影响检测：选择5ug、10ug、20ug/kg的三个添加水平对按照实施例1和对比例4和对比例5中的检测方法对蜂王浆样品进行加标实验，检测结果如表2所示。
表2利用实施例1和对比例4-5中检测方法检测三种待测物的回收率和精密度
由表2可知，实施例1中以乙腈作为提取液时，蜂王浆中多菌灵、甲基托布津和乙基托布津的回收率较高，精密度即相对标准偏差较小，说测试偏差小，测试准确，对比例4中以正己烷-丙酮的混合液作为提取液，对比例5中以正己烷-二氯甲烷的混合液作为提取液，按照对比例4和对比例5中的测试方法测试多菌灵、甲基托布津和乙基托布津的回收率较低，且相对标准偏差较大，因为正己烷-丙酮和正己烷-二氯甲烷，、容易提取出蜂王浆中的脂质成分，与蜂王浆形成乳液，不易分层，导致待测物被包裹在蛋白质中吗，难以实现分离。
4、净化方式对蜂王浆中多菌灵、甲基托布津、乙基托布津回收率和精密度影响的检测：选择5ug、10ug、20ug/kg的三个添加水平对按照实施例1和对比例6的检测方法对蜂王浆样品进行加标实验，检测结果如表3所示。
表3净化方式对蜂王浆中待测物回收率和精密度的影响测试结果
由表3中数据可以看出，用hlb固相萃取柱时，多菌灵、甲基托布津和乙基托布津的回收率更高，精密度更小，用c18固相萃取柱时，多菌灵、甲基托布津和乙基托布津的回收率较小，且精密度较差。
按照实施例1中的流动相检测蜂王浆中的多菌灵、甲基托布津和乙基托布津，并制成总离子流色谱图，如图4所示，按照对比例7中流动相检测蜂王浆中多菌灵、甲基托布津和乙基托布津，并制成总离子流色谱图，如图5所示。
图4中1为多菌灵；2为甲基托布津；3为乙基托布津，由实施例1中a相和b相进行色谱检测，检测的多菌灵、甲基托布津和甲基托布津的峰响应较强，灵敏度较高，达到基线分离。
图5中1为多菌灵；2为甲基托布津；3为乙基托布津，对比例7中以甲酸作为流动相，三种待测物的峰形对称，但峰响应、灵敏度不如实施例1。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。