一种橄榄油中小分子化合物的测定方法与流程

本发明涉及分析检测的技术领域，特别涉及一种橄榄油中小分子化合物的测定方法。

背景技术

橄榄油是由新鲜的油橄榄果实直接冷榨而成的，不经加热和化学处理，保留了天然营养成分。橄榄油被认为是迄今所发现的油脂中最适合人体营养的油脂。橄榄油的品质在植物油中居首位，因此具有“食用植物油皇后”的美称，可见橄榄油在植物油脂中拥有不可替代的地位。近几年来，人们所关注的橄榄油的品质问题已经由以往的假冒伪劣上升到了以次充好，以次掺好，以及橄榄油原产地的问题，因此传统的以脂肪酸的测定来鉴别橄榄油真伪的方法已经日益受到挑战。而以橄榄油中小分子化合物作为鉴定依据将成为鉴别橄榄油真伪以及产地的主要研究方向。

目前橄榄油中小分子化合物主要包括有机酚类物质、有机酸、生物黄酮、萜类物质、其它含氧化合物等，这几类物质的测定方法主要有高锰酸钾滴定法、普鲁士蓝法、folin-denis比色法、folin-ciocalteus比色法、酒石酸亚铁法、紫外分光光度计法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。而这些方法的样品预处理过程基本上都需要经过称样、提取、去油脂、净化、浓缩等复杂的过程，检测单个样品的耗时时长为2～3h，面临大批量样品时，该项目的检测将成为实验室的负担，成本较高，溶剂消耗量较大，且很难在短时间内完成大批量样品的检测。而且在不了解所研究橄榄油的成分组成时，化合物的确定就成为了一个难题，将需要消耗大量的时间和精力。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明目的在于提供一种橄榄油中小分子化合物的测定方法。本发明提供测定方法不仅能够准确测定橄榄油中小分子化合物的成分，而且能够大大缩短操作时间，整个测定流程的时间仅为20～30min。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种橄榄油中小分子化合物的测定方法，包括以下步骤：

(1)将橄榄油样品加入到有机溶剂中进行提取，得到提取物；

(2)将所述提取物进行实时直接分析离子化处理，得到离子化样品；

(3)将所述离子化样品进行飞行时间质谱分析，得到质谱图，通过软件得到质谱图中化合物的精准质量数；

(4)将质谱图以及精准质量数结合进行分析，确定小分子化合物名称。

优选的，所述步骤(1)中橄榄油样品与有机溶剂的体积比例为1:10～5:1；所述有机溶剂为乙腈和/或甲醇。

优选的，所述步骤(1)中提取的时间为1～30min。

优选的，所述步骤(2)中实时直接分析离子化处理的进样速率为0.1～0.5mm/s。

优选的，所述步骤(2)中实时直接分析离子化处理的离子化温度为50～550℃，栅极电压为50～530v。

优选的，所述步骤(2)中实时直接分析离子化处理的离子化气为氦气，流速为2～3l/min。

优选的，所述步骤(3)中飞行时间质谱分析的离子源温度为80～150℃，锥孔电压为10～60v，碰撞池1的碰撞能量为2～6v，碰撞池2的碰撞能量为2～6v，检测器电压为1500～1900v。

优选的，所述步骤(4)中对质谱图以及精准质量数结合分析具体为：先使用软件对精准质量数进行确证，再进行同位素匹配，然后推算出元素组成，最后根据元素组成确定小分子化合物名称。

本发明提供了一种橄榄油中小分子化合物的测定方法，采用实时直接分析、飞行时间质谱分析联用技术，可以省略预处理步骤，缩短对样品的采集时间，整个测定流程时间仅为20～30min，能够大大提高分析效率；利用软件对质谱图以及精准质量数结合进行分析，能够准确测定橄榄油中小分子化合物的成分，且该技术在分析过程中不使用任何流动相，可以减少溶剂污染。实施例结果表明，本发明提供的测定方法能够准确检测出橄榄油中的有机酚类物质、有机酸、生物黄酮类、萜类物质以及其它含氧化合物，且整个测定时间仅为30min。

附图说明

图1为本发明实施例1中橄榄油提取物经实时直接分析离子化处理、飞行时间质谱分析后m/z60～m/z225的放大质谱图；

图2为本发明实施例1中橄榄油提取物经实时直接分析离子化处理、飞行时间质谱分析后m/z255～m/z345的放大质谱图；

图3为本发明实施例1中橄榄油提取物经实时直接分析离子化处理、飞行时间质谱分析后m/z345～m/z487的放大质谱图；

图4为本发明对比例1中橄榄油提取物经液相色谱-电喷雾-质谱联用法检测的色谱图；

图5为本发明对比例1中橄榄油提取物经液相色谱-电喷雾-质谱联用法检测得到的scan模式下的质谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种橄榄油中小分子化合物的测定方法，包括以下步骤：

(1)将橄榄油样品加入到有机溶剂中进行提取，得到提取物；

(2)将所述提取物进行实时直接分析离子化处理，得到离子化样品；

(3)将所述离子化样品进行飞行时间质谱分析，得到质谱图，通过软件得到质谱图中化合物的精准质量数；

(4)将质谱图以及精准质量数结合进行分析，确定小分子化合物名称。

本发明将橄榄油样品加入到有机溶剂中进行提取，得到提取物。本发明对橄榄油的来源没有特殊要求，市售或是自行制备的橄榄油均可以使用本发明的方法进行测定。本发明优选采用震荡提取的方式对橄榄油样品进行提取，所述震荡提取的时间优选为1～30min，更优选为5～10min；在本发明中，所述橄榄油样品与有机溶剂的体积比优选为1:10～5:1，更优选为1:2～2:1；在本发明中，所述有机溶剂优选为乙腈和/或甲醇。

本发明优选在震荡之后进行离心分层，收集有机溶剂层，得到提取物。

得到提取物后，本发明将所述提取物进行实时直接分析离子化处理(dart离子化处理)，得到离子化样品。本发明优选使用ionsense公司、型号为svp的dart离子源进行dart离子化处理处理；本发明优选使用吸液器具吸取提取物，然后将提取物点放入实施直接分析离子源所配的tip头上后进样，使带有样品的tip头依次通过dart源取样口。在本发明中，所述吸液器具的吸入量优选为1～10μl，更优选为3～8μl；所述进样的速率优选为0.1～0.5mm/s，更优选为0.2～0.4mm/s；所述进样模式优选为12dip-itsamplers模式。本发明使用实时直接分析离子化处理提取物替代传统的预处理，可以大幅度降低整个流程时间。在本发明中，实时直接分析离子源几乎不产生加合离子和源外电离，因此谱图上所显示的每一个质荷比就对应的是某一化合物的分子离子峰，所以图谱简单，便于解析。

在本发明中，所述实时直接分析离子化处理的模式优选为负离子模式；所述实时直接分析离子化处理的离子化温度优选为50～550℃，更优选为100～400℃，最优选300℃；所述实时直接分析离子化处理的栅极电压优选为50～530v，更优选为150～400v；所述实时直接分析离子化处理的离子化气优选为氦气，所述离子化气的流速优选为2～3l/min，更优选为2.2～2.8l/min。

得到离子化样品后，本发明将所述离子化样品进行飞行时间质谱分析，得到质谱图。本发明对飞行时间质谱仪的品牌和型号没有要求，使用本领域常规的飞行时间质谱仪即可。在本发明中，实时直接分析离子源的出口与飞行时间质谱的进口的距离优选为0.5～4cm，更优选为2～3cm；在本发明中，所述飞行时间质谱分析的离子源温度优选为80～150℃，更优选为100～130℃；所述飞行时间质谱分析的锥孔电压优选为10～60v，更优选为20～50v；所述飞行时间质谱分析的碰撞池1的碰撞能量优选为2～6v，更优选为3～5v；所述飞行时间质谱分析的碰撞池2的碰撞能量优选为2～6v，更优选为3～5v；所述飞行时间质谱分析的检测器电压优选为1500～1900v，更优选为1600～1800v。

得到质谱图后，本发明通过软件得到质谱图中化合物的精准质量数。在本发明中，所述软件优选使用masslynx软件中lockmass功能，得到样品中化合物的准确质量数。

得到质谱图和精准质量数后，本发明将质谱图以及精准质量数结合进行分析，确定小分子化合物名称。在本发明中，所述分析优选具体为：先使用软件对精准质量数进行确证，再进行同位素匹配，然后推算出元素组成，最后根据元素组成确定小分子化合物名称。在本发明中，所述对精准质量数进行确证使用的软件优选为massworks软件，massworks的autocaltm自动校正系统可获得化合物的精准质量数，与飞行时间质谱仪交叉确定精准质量数，准确度和可信度更高，同时massworks软件借助图谱准确度，可以直接给出化合物母离子或锁片离子的正确分子式，从而减小化合物的匹配范围。本发明将质谱仪得出的谱图以及精准质量数结合massworks软件经同位素匹配后可以推算出元素组成。

得到元素组成后，本发明优选在chemicalspider网站确定化合物名称，将得到的化合物名称与相关文献报道的方案进行匹配，可以最终确认成分。

下面结合实施例对本发明提供的橄榄油中小分子化合物的测定方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

称取1g祥宇橄榄油样品，用5ml乙腈震荡提取5分钟。使用吸液器具准确吸取2μl提取物点放入实施直接分析离子源所配的tip头上后进样，进样速度为0.2mm/s，经实时直接分析离子化处理后，进入飞行时间质谱进行分析得到质谱图，通过masslynx软件中lockmass功能得到质谱图中化合物的精准质量数。将得到的谱图以及精准质量数结合massworks软件经同位素匹配后推算出元素组成，最后在chemicalspider网站确定化合物名称，并与国外的橄榄油中文献报道的方案进行匹配，最终确认成分。本次测定使用了ionsense公司、型号svp的实时直接分析离子源，waters公司、型号synrpt的单四级杆串接飞行时间质谱仪。

本次测定dart离子化处理的参数为：离子化气为氦气，流速为2ml/min；dart离子化处理的模式为负离子模式；进样模式为12dip-itsamplers模式；离子化温度为300℃；栅极电压为150v；离子源出口距离质谱进口2.4cm。

本次测定飞行时间质谱参数为：离子源温度为100℃；锥孔电压为40v；碰撞池1的碰撞能量为6.0v；碰撞池2的碰撞能量为4.0v；检测器电压为1700v。

橄榄油提取物经实时直接分析离子化处理、飞行时间质谱分析后所得m/z60～m/z225的放大质谱图如图1所示，m/z255～m/z345的放大质谱图如图2所示，m/z345～m/z487的放大质谱图如图3所示。根据图1～3可以看出，本发明提供的方法得到的质谱图简单清晰，便于解析。

本次测定整体用时30min，测定出的物质及化合物结构见下表：

表1实施例1测定出的小分子化合物的名称和结构

对比例1

称取1g橄榄油样品，用5ml乙腈震荡提取5分钟，对提取物进行液相色谱-电喷雾-质谱联用法(huplc-esi-q-tof)进行分析，所用分析时间花费100分钟，所得色谱图如图4所示，所得scan模式下的质谱图如图5所示。从图4～5中可以看出，橄榄油中的成分并没有进行完全分离，而且esi源由于源外电离影响，在scan模式下质谱图较为复杂，无法确定分子离子峰，很难解析，无法进行最终化合物的判断。

对实施例1和对比例1比较可知，本发明提供的橄榄油中小分子化合物的测定方法不仅能够准确测定出橄榄油中小分子化合物的成分，而且能够缩短对样品的采集时间，提高分析效率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。