一种血清淀粉样蛋白A定量检测试剂盒的制作方法

本发明涉及体外检测技术，尤其是涉及一种血清淀粉样蛋白a定量检测试剂盒。

背景技术：

血清淀粉样蛋白a（saa）属于急性时相反应蛋白，炎症或感染急性期在48-72h内迅速升高，并在疾病的恢复期下降。目前在细菌、病毒感染，动脉粥样硬化，冠心病，急性移植排斥反应，肿瘤等疾病中均能检测到血清saa升高。特别在某些疾病中，如病毒感染、移植排斥反应、冠心病等，saa的敏感性高于crp，故saa的定量检测可为临床提供更好的参考价值。

血清淀粉样蛋白a定量检测包含多种方法和平台，主要包括免疫比浊法、胶体金渗滤法、酶联免疫吸附法以及荧光免疫层析法。免疫比浊法由于对仪器要求高，以及在原理上存在缺陷，造成免疫比浊法的检测结果线性短，检测结果不准确，易受血脂的影响，并且不能检测全血；胶体金渗滤法适用于床旁检验，并且可以检测全血，但是该方法操作过程过于复杂，不利于工作人员大量处理；酶联免疫吸附法(elisa)进行测定具有较高的灵敏度，但是操作过程繁琐，每次测值均需要绘制标准曲线，准确度误差大，测定时间较长，仪器昂贵且需要经过一定专业培训的人员进行操作，因此不符合临床快速检测的要求；荧光免疫层析法由于层析平台本身的局限性，精密性问题始终不能得到解决，并且成本相对较高，目前市场上已较少出现。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述现有技术所存在的缺陷，提供一种检测结果更准确，线性更宽，灵敏度更高的血清淀粉样蛋白a定量检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的血清淀粉样蛋白a定量检测试剂盒，包括磁微粒复合物试剂，酶结合物溶液，样本稀释液，saa校准品以及发光底物；所述磁微粒复合物试剂中的磁微粒偶联有鼠抗人saa单克隆抗体；所述酶结合物溶液为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人saa抗体溶液或碱性磷酸酶标记的鼠抗人saa抗体溶液。

所述磁微粒的粒径为0.5um-20um，其表面修饰有~cooh、~nh2、苯甲磺酰基或~sh基团。

所述样本稀释液为tris-hcl、tris-nacl、pbs缓冲液或者生理盐水。

所述样本稀释液中包含有牛血清白蛋白或casein蛋白质。

所述发光底物包括a液和b液，其中a液的主要成分为双氧水，b液的主要成分为鲁米诺或者鲁米诺衍生物，使用时按照1:1混匀。

所述发光底物也可以为ap发光底物或辣根过氧化物酶发光底物，如lumi-phos530、amppd等。

本发明通过磁微粒化学发光方法，设计定量检测人血清淀粉样蛋白a检测试剂盒，其主要原理为：通过磁微粒包被鼠抗人单克隆抗体，结合人血清、血浆、全血中的血清淀粉样蛋白a，再与辣根过氧化物酶（hrp）或者碱性磷酸酶（ap）标记的另一株鼠抗人单抗形成双抗体夹心法，辣根过氧化物酶在底物存在的情况下，催化底物发光，通过光检测系统进行定量检测。

本发明制备的试剂盒可以搭配全自动免疫检测仪，操作简便，结果更准确，线性更宽，灵敏度更高，并且可以直接检测全血。与比浊法相比，降低了血脂样本的干扰，能够更加准确地检测人血清、血浆、全血中的saa；搭载自动化系统操作简单，通量大；采用磁微粒平台，使用面较广，成本低且受众广。

附图说明

图1为本发明试剂盒的线性关系图。

图2本发明试剂盒的高值hook图。

图3是本发明试剂盒与西门子试剂盒临床数据相关性对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明所用的试剂和实验仪器均为市售产品，采用的方法为本领域常规方法。

实施例1制备血清淀粉样蛋白a定量检测试剂盒

1、配制磁微粒复合物试剂

取磁珠缓冲液30ul，反复吹打磁珠（粒径约1um），置于磁珠分离器上，吸取上清后，添加碳二亚胺活化液，室温反应30min~1h；然后加入鼠抗人saa捕获抗体进行偶联2h或者过夜；偶联结束后，至于磁珠分离器上吸取上清，加入乙醇胺溶液进行封闭30min；磁珠也置于分离器上，吸取上清后，加入封保液（主要成分为tris-nacl缓冲液，bsa以及edta），混匀，置于磁珠分离器，弃上清，重复3-5次后，封保液定容至3ml。

2、配制酶结合物溶液

取适量的酶标记抗体，按1:2000的稀释比例加入到酶稀释液中，配制成酶结合物溶液；所用的酶稀释液为0.02mpbs缓冲液（ph7.4），其中含有2%bsa，0.2%prolin-300。

3、配制样本稀释液

采用0.02mpbs缓冲液（ph7.4）作为样本稀释液，其中含有2%bsa,0.2%prolin-300;使用时将样本进行200倍稀释。

4、配制saa校准品

采用0.02mpbs缓冲液（ph7.4，其中含有2%bsa,0.2%prolin-300）作为校准品稀释液，将重组抗原稀释至校准品中，目标浓度分别是200mg/l、100mg/l、50mg/l、25mg/l、5mg/l以及0mg/l。

5、制备发光底物

a液：主要成分为双氧水。

b液：主要成分为鲁米诺或者鲁米诺衍生物。

实施例2本发明试剂盒的检测方法

1、取20ul样本稀释200倍；

2、取20ul稀释后的样本，加入20ul的磁微粒复合物试剂，吹打混匀，再加入100ul的酶结合物溶液，37℃孵育10min；

3、在以上混合液中加入0.02mpbs洗液，清洗5次，加入底物（a液、b液各50ul）然后在安图全自动免疫化学发光仪a2000进行检测。

实施例3本发明试剂盒的性能检测

1、线性范围：

将高值样本（230mg/l）进行梯度稀释，结果见下表和图1：

结论：根据上表和图1，本试剂盒的线性范围满足3mg/l-200mg/l。

2、检验本发明试剂盒的hook风险

将抗原高值进行梯度稀释，结果如下表和图2所示：

结论：根据上表和图2，本试剂盒的可以做到3600mg/l且无明显“钩状”，hook拐点可至115200mg/l。

3、本发明试剂盒的相关性试验

将本发明试剂盒检测西门子试剂临床定值样本，其临床数据相关性如图3所示，结果表明，本发明试剂盒与西门子的临床相关性r>0.99以上。