一种DNA表观遗传修饰的表面增强拉曼光谱检测方法与流程

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种dna表观遗传修饰的表面增强拉曼光谱检测方法。

背景技术：

dna的表观遗传修饰方式包括5-甲基胞嘧啶(5-mc)、5-羟甲基胞嘧啶(5-hmc)、5-醛基胞嘧啶(5-fc)和5-羧基胞嘧啶(5-cac)等，这些表观遗传修饰方式在维持细胞的增殖分化、遗传印记、基因表达等方面有重要的作用。其中5-mc是研究最为广泛的遗传修饰之一，而5-hmc、5-fc和5-cac既是dna主动去甲基化的产物，也是调控生命过程的重要表观遗传修饰，它们与甲基化之间的动态平衡与生物的发育和疾病等密切相关。

传统的检测方法有甲基化敏感的限制性内切酶方法、甲基化特异性pcr法、电化学方法、质谱色谱光谱分析法等，但这些方法普遍耗时繁琐，结果不准确。

表面增强拉曼光谱法作为振动光谱，具有独特的指纹识别特性，能够反映出dna碱基修饰的分子信息，且不受水溶液的干扰，因此广泛地应用于生物样品分析。传统的拉曼增强基底是贵金属纳米粒子，但是纳米粒子增强效果差，且容易发生团聚，造成检测信号的不稳定，无法得到增强效果好、重现性好的拉曼谱图，因此限制了sers在表观遗传修饰方向的广泛应用。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种dna表观遗传修饰的表面增强拉曼光谱检测方法，该方法将不同表观遗传修饰的dna吸附在阵列表面，根据修饰基团的拉曼指纹特征，实现了多种dna表观遗传修饰的检测，且所述检测方法无需对dna进行化学处理或者标记，操作简单，具有灵敏度高、重现性好的优点，极大地丰富了dna表观遗传修饰的检测方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种dna表观遗传修饰的表面增强拉曼光谱检测方法，包括如下步骤：

步骤1)制备周期性结构的金纳米孔阵列：将pmma旋涂在玻璃基板上，然后将基板暴露于电子束，产生纳米孔阵列，在甲基异丁基酮/异丙醇溶液中显影后接着用异丙醇冲洗，然后通过热蒸发镀膜技术将金膜蒸发到纳米孔阵列上，得到所述周期性结构的金纳米孔阵列，清洗后备用；

步骤2)配置dna混合溶液：将不同表观遗传修饰的待测dna分别溶解在tris-hcl缓冲液中得到dna溶液，取dna溶液与tcep溶液常温下混合反应，得到所述dna混合溶液；

步骤3)不同dna表观遗传修饰的拉曼检测：将步骤2)制得的dna混合溶液滴涂在步骤1)制备的金纳米孔阵列中，0.5h后取出并用氮气吹干，用拉曼仪器在金纳米孔阵列表面不同区域处采集拉曼信号进行检测，观察不同待测dna表观遗传修饰方式拉曼光谱图的特征差异，根据拉曼信号强度和位移的变化实现不同待测dna表观遗传修饰的检测。

进一步地，步骤1)所述金纳米孔阵列为层状结构，共有三层，底层为si片，中间层为厚度200nm的pmma纳米阵列，上层为50nm厚的金膜；金纳米孔阵列呈周期性排列的孔洞结构，孔为圆形，半径为100nm，深度为200nm，孔与孔之间的距离为604nm。

进一步地，步骤2)所述待测dna的表观遗传修饰方式包括5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶。

进一步地，步骤2)所述dna溶液与tcep溶液的摩尔浓度比例为1：50。

进一步地，步骤2)所述dna溶液的配制过程为：将不同表观遗传修饰的待测dna溶解在10mmol/lph＝7.4的tris-hcl溶液中，使其浓度为100μmol/l。

进一步地，步骤3)所述采集拉曼信号进行检测的过程为：采用激发波长为785nm、功率为35mw的拉曼光谱仪，采集金纳米孔阵列表面50个不同区域的拉曼光谱，获得平均拉曼光谱。

本发明与现有技术相比，其具有以下优点：

1、本发明首先通过电子束曝光技术制备出周期性结构的金纳米孔阵列，该阵列的每一个纳米孔边缘具有很强电磁场分布，具有拉曼增强效应。此外，金纳米孔阵列具有非常好的周期性排列，可以获得可控的热点信号。因此，本发明所制备出的金纳米孔阵列不仅具有良好的拉曼增强效应，还具有高效的检测重现性。本发明以不同表观遗传修饰的dna序列为模型(s1～s4)，采集其拉曼光谱，根据其拉曼光谱的差异，实现了一个可用于检测多种dna表观遗传修饰的sers方法。

2、本发明通过表面增强拉曼光谱技术实现了多种dna表观遗传修饰的检测，且该方法具有免dna扩增、免标记、灵敏度高及操作简单等优点。通过拉曼光谱的独特指纹识别作用，即拉曼信号强度和位移的变化，实现多种dna表观遗传修饰的检测。

附图说明

图1为本发明制备的周期性结构的金纳米孔阵列的场发射扫描图；

图2为本发明制备的周期性结构的金纳米孔阵列的原子力显微镜图；

图3为不同dna表观遗传修饰的拉曼光谱数据(s1～s4)。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1周期性结构的金纳米孔阵列的制备

(1)周期性结构的金纳米孔阵列使用电子束曝光系统和热蒸发镀膜技术进行制备：将200nm厚的聚甲基丙烯酸甲酯(pmmaa6，购自mircochem(westborough，ma))旋涂在玻璃基板上，然后将pmma涂覆的基板暴露于电子束以产生50μm×50μm纳米孔阵列，该阵列具有100nm半径，200nm深度和604nm的周期。在1：3甲基异丁基酮/异丙醇(mibk/ipa)中显影70s后接着ipa冲洗，然后通过热蒸发镀膜技术将50nm厚的金膜蒸发到纳米孔阵列上，得到周期性结构的金纳米孔阵列，用紫外线-臭氧(uv-o3)清洁剂清洗基底20min，再用18.2mω·cm^-1去离子水清洗，最后用n2流干燥得到干净的基底。

用场发射扫描电镜进行表征，阵列的形貌如图1和图2所示，所述金纳米孔阵列为层状结构，共有三层，底层为si片，中间层为厚度200nm的pmma纳米阵列，上层为50nm厚的金膜；金纳米孔阵列呈周期性排列的孔洞结构，孔为圆形，半径为100nm，深度为200nm，孔与孔之间的距离为604nm。

通过场发射扫描电镜表征，说明该阵列具有100nm的半径(r)和604nm的周期(p)，且每个纳米孔洞排列呈周期性、整齐均匀的分布。通过原子力显微镜表征说明该阵列纳米孔的深度为200nm(t)，符合制备需求。

实施例2周期性结构的金纳米孔阵列用于检测不同dna表观遗传修饰

待测的不同表观遗传修饰dna序列设计如下：

s1：5′-hs-(ch2)6-^mcgcgcgcgc-3′；

s2：5′-hs-(ch2)6-^hmcgcgcgcgc-3′；

s3：5′-hs-(ch2)6-^fcgcgcgcgc-3′；

s4：5′-hs-(ch2)6-^cacgcgcgcgc-3′。

其中s1是5-甲基胞嘧啶(5-mc)修饰的dna，s2是5-羟甲基胞嘧啶(5-hmc)修饰的dna，s3是5-醛基胞嘧啶(5-fc)修饰的dna，s4是5-羧基胞嘧啶(5-cac)修饰的dna。

(2)配置dna混合溶液：将dna序列(s1～s4)分别溶解在tris-hcl缓冲液(浓度为10mmol/l，ph＝7.4)中得到dna溶液(100μmol/l)，取10μldna溶液(100μm)和10μl三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep溶液98％，5mm)常温混合反应2h，其中dna溶液和tcep溶液的摩尔浓度比例为1：50，使dna的5′端产生游离的巯基，以便固定到金纳米孔阵列表面。

(3)多种dna表观遗传修饰的拉曼检测：将10μldna混合溶液滴涂在金纳米孔阵列中，0.5h后取出来，用n2吹干后，用785nm激光的拉曼仪器，功率为35mw在周期性结构的金纳米孔阵列50个不同区域处采集拉曼信号进行检测，观察四种表观遗传修饰方式拉曼光谱图的特征差异，如图3所示，a～d是周期性结构的金纳米孔阵列50个不同区域位置检测到的不同表观遗传修饰的dna溶液的拉曼信号的平均光谱。a是含5-mc的dna序列的光谱(s1)，即含5-mc的dna序列s1的光谱在785cm^-1和1200cm^-1峰位置有特征峰(分别归属于胞嘧啶的环状呼吸振动和环伸缩振动)。b是含5-hmc的dna序列的光谱(s2)，相比于s1含5-hmc的dna序列s2的光谱在660cm^-1出现新峰，可作为5-hmc存在的明显标志。c是含5-fc的dna序列的光谱(s3)，含5-fc的dna序列的光谱s3中的特征峰660cm^-1消失，且伴随出现1450cm^-1新的特征峰(属于醛基的c-h振动)，可作为5-fc的标志。d是含5-cac的dna序列的光谱(s4)，含5-cac的dna序列的光谱s4中的1680cm^-1峰较s1～s3最强(属于羧基的c＝o伸缩振动)，可作为5-cac的特征峰。可以根据这些特征峰的变化实现不同dna表观遗传修饰的检测。