一种检测杨树干旱胁迫临界值的方法与流程

本发明属于杨树抗旱研究技术领域，尤其涉及一种检测杨树干旱胁迫临界值的方法。

背景技术：

干旱是指水分的供求或收支不平衡而造成的水分短缺。近来，在气候渐暖的背景下，全球正面临日益严峻的干旱灾害的挑战。据联合国环境计划署估计，全球目前有约35％的土地和20％的人口正在或即将受到干旱和沙漠化的威胁，沙漠化面积每年以多达600万公顷的速度递增。干旱对农林业生产有着极其严重的影响，据估算全球由于水分短缺造成减产与其它因素造成减产的总和持平。我国作为世界上人口最多的国家，同样也是受干旱影响最为严重的国家之一，将近51％的国土面积属干旱、半干旱区域。一些新型节水技术的推广应用虽能对某些地区的农林业生产起到积极作用，但要从根本上解决问题还任重道远。因此，从植物自身角度出发，最大程度地挖掘其自身抗旱潜力已成为现代农林业研究的焦点，对植物抗旱性的研究意义重大。要使植物自身抗旱性大幅度提高，就必须对植物的抗旱机制有清楚的认识，明确植物抗旱性状的遗传规律和代谢特点，对植物抗旱性作出科学准确的评价。

随着杨树全基因组测序的完成，杨树己经成为研究林木逆境抗性分子生物学机制的模式植物。在受到干旱胁迫后，杨树可以通过调节生长发育进程、形态结构以及内部生理生化代谢来适应低水多变的生物环境。为了适应逆境，杨树会在短时间内在体内合成一些渗透调节物质，如甘露醇、胆碱、脯氨酸等来维持细胞形状，保护酶的活性和蛋白的结构，使代谢功能稳定。

但是目前对于不同品种杨树干旱胁迫的临界点的检测没有科学、准确的方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测杨树干旱胁迫临界值的方法及应用，所述方法通过评价杨树群体干旱胁迫响应生理特性科学、准确检测不同品种杨树的干旱胁迫临界值。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种检测杨树干旱胁迫临界值的方法，包括以下步骤：

1)将杨树苗移栽至土壤中进行管理，至杨树苗有14～16片功能叶完全伸展停止，所述管理包括每2～4天浇水一次，浇至土壤透水；

2)选取距杨树苗枝条顶端第3～5片功能叶中的1片进行叶片的叶水势、相对电导率、净光合速率、气孔导度、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、丙二醛含量和脯氨酸含量的测定；同时记录土壤含水量；

3)每36～60h重复步骤2)所述的操作，至土壤含水量≤5％停止；

4)利用统计学方法分析步骤2)和步骤3)获得的叶片的叶水势、相对电导率、净光合速率、气孔导度、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、丙二醛含量、脯氨酸含量的数据，当叶片的叶水势、净光合速率、气孔导度、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性显著降低，并且相对电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量显著提高时，记录的土壤含水量即为杨树干旱胁迫临界值。

优选的，步骤1)中所述杨树苗的高度为15～50cm。

优选的，移栽时所述杨树苗有8～12片完全伸展的功能叶。

优选的，步骤1)中每次浇水后土壤的含水量为30～40％。

优选的，所述土壤包括基质和珍珠岩；所述基质和珍珠岩的体积比为(2.5～3.5)：1。

优选的，步骤1)中所述的杨树苗的样本数量为25～50株。

本发明的有益效果：本发明通过对杨树苗进行控水处理模拟干旱状态，并对不同干旱状态下杨树苗功能叶的叶片的叶水势、相对电导率、净光合速率、气孔导度、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性的测定；并对上述数据进行统计分析，能够科学、准确检测不同品种杨树的干旱胁迫临界值，对杨树的抗旱性作出科学准确的评价，为开展杨树群体抗干旱胁迫特性提供理论依据，具有重要的科学与应用价值。

附图说明

图1为实施例1中土壤含水量变化趋势图；

图2为实施例1中叶片相对电导率变化趋势图；

图3为实施例1中试验的叶片的叶水势变化趋势图。

具体实施方式

本发明提供了一种检测杨树干旱胁迫临界值的方法，包括以下步骤：1)将杨树苗移栽至土壤中进行管理，至杨树苗有14～16片功能叶完全伸展停止，所述管理包括每2～4天浇水一次，浇至土壤透水；2)选取距杨树苗枝条顶端第3～5片功能叶中的1片进行叶片的叶水势、相对电导率、净光合速率、气孔导度、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、丙二醛含量和脯氨酸含量的测定；同时记录土壤含水量；3)每36～60h重复步骤2)所述的操作，至土壤含水量≤5％停止；4)利用统计学方法分析步骤2)和步骤3)获得的叶片的叶水势、相对电导率、净光合速率、气孔导度、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、丙二醛含量、脯氨酸含量的数据，当叶片的叶水势、净光合速率、气孔导度、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性显著降低，并且相对电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量显著提高时，记录的土壤含水量即为杨树干旱胁迫临界值。

本发明将杨树苗移栽至土壤中进行管理，至杨树苗有14～16片功能叶完全伸展停止。在本发明中，所述杨树苗的高度优选为15～50cm，更优选为20～45cm；本发明所述移栽时，所述杨树苗优选的有8～12片完全伸展的功能叶，更优选为10片完全伸展的功能叶；所述杨树苗优选为叶片完整、无病虫害的杨树苗。本发明中，所述的杨树苗的样本数量优选为25～50株，更优选为28～35株。本发明对所述移栽的方法没有特殊限定，采用本领域常规的移栽方法即可；本发明中所述土壤优选的包括基质和珍珠岩；所述基质和珍珠岩的体积比优选为(2.5～3.5)：1，更优选为3:1。本发明中，所述土壤优选的装于栽培盆中，所述杨树苗优选的移栽至栽培盆中进行管理。本发明中，所述栽培盆优选的塑料盆，所述栽培盆的直径优选为15cm，所述栽培盆的高优选为10cm。本发明中所述管理包括每2～4天浇水一次，浇至土壤透水；优选的每3天浇水一次；本发明中，每次浇水后土壤的含水量优选为30～40％。

本发明在所述杨树苗有14～16片功能叶完全伸展后，停止浇水；选取距杨树苗枝条顶端第3～5片功能叶中的1片进行叶片的叶水势、相对电导率、净光合速率、气孔导度、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、丙二醛含量和脯氨酸含量的测定；同时记录土壤含水量。在本发明中，所述测定优选的每36～60h进行一次，更优选为每48h进行一次；所述测定优选的至土壤含水量≤5％停止。

在本发明中，所述叶水势(leafwaterpotential，ψ)的测定优选的采用psypro型露点水势仪及c52样品室(wescor公司，美国)进行，在本发明具体实施过程中，所述叶水势测定优选的选取杨树苗中上部完好的叶片进行测定，每次测量相同部位的叶片。

本发明中，所述相对电导率测定优选的采用浸泡法，所述相对电导率＝r1/r2×100％；其中r1为浸泡叶片10～14h后获得的浸提液的电导率；r2为浸泡叶片10～14h后，95～105℃加热20～40min后获得的浸提液的电导率。

本发明中，所述净光合速率和气孔导度的测定优选的采用li-6400光合仪进行。

本发明中所述超氧化物歧化酶活性的测定优选的采用氮蓝四唑(nbt)法测定，所述过氧化物酶活性测定优选的采用愈伤木酚氧化法；所述过氧化氢酶活性的测定优选的采用可见光分光光度法；所述丙二醛含量测定优选的采用巴比妥酸(tba)显色法，所述脯氨酸含量的测定优选的采用磺基水杨酸法。

本发明利用统计学方法分析上述测定获得的叶片的叶水势、相对电导率、净光合速率、气孔导度、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、丙二醛含量、脯氨酸含量的数据，当叶片的叶水势、净光合速率、气孔导度、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性显著降低，并且相对电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量显著提高时，记录的土壤含水量即为杨树干旱胁迫临界值。本发明对所述统计学方法没有特殊限定，采用本领域常规统计学方法即可；在本发明的具体实施过程中，优选的采用excel、spass等软件进行。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

干旱胁迫对不同毛白杨生理生化代谢的影响

于2018年7月至8月在北京林业大学的日光温室内进行盆栽试验。温室地理坐标39°46'n，116°19'e，属半湿润大陆季风气候环境温度为25±1℃,相对湿度50％±1，年平均日照时数2778.9h，年总辐射量为5283mj/㎡。选取长势良好，无病虫害，平均高45cm，平均地径1.0cm的杨树进行试验。试验所用盆栽塑料花盆直径15cm，高10cm，供试土壤体积比为基质：珍珠岩＝3:1。2018年7月将预先准备好的杨树苗移栽至盆中，每个花盆栽植1株，共30株。为使苗木正常生长，每盆杨树均充分浇水，土壤含水量维持在35％左右。由于移栽会影响杨树苗木的生长，且苗木恢复正常生长需要一定时间，8月份杨树苗生长较为旺盛，因此8月中旬(15日)开始进行控水试验，停止对杨树苗浇水，每个处理重复3次。每次测定都选取距枝条顶端第3～5片功能叶进行叶片水势、相对电导率、净光合速率等指标监测，每个指标重复测定3次，并迅速取新鲜功能叶置于液氮中，然后保存至-80℃冰箱中待测。同时记录监测每盆杨树苗的土壤含水量。

自8月15日起进行土壤含水量、叶水势、相对电导率、净光合速率的测量并取样保存。各指标从7:00－17:00每隔2d测量1次，以监测杨树旱胁迫下各项指标的动态变化。土壤体积含水量(soilwatercontent，swc)采用高精度土壤水分测量仪(探头型号ml2x，手持读数表型号hh2，delta-t公司，英国)进行监测，随机测量每个盆栽3个不同位置的土壤含水量，取平均值。叶水势(leafwaterpotential，ψ)采用psypro型露点水势仪及c52样品室(wescor公司，美国)进行测量，选取杨树苗中上部完好的叶片进行测定，每次测量相同部位的叶片。选pam-2100便携式叶绿素荧光仪(walzgermany)测定正常生长的杨树叶片的叶绿素荧光日变化情况。测定暗适应前须将杨树叶片暗适应处理30min以上，采用saturationpulse模式测定。仪器记录并通过运算给出的指标有：f0、fm、fs、y、etr、qn、qp；fv＝fm-f0；qp＝(fm’-fs)/(fm’-f0)；qn＝(fm-fm’)/(fm-f)；

y＝(fm’-fs)/fm’；etr＝(fm’-fs)/fm’*par*0.5*0.84。其中etr与净光合速率成显著正相关。测定完成后将数据导入excel按上述公式进行计算相关指标。

电导率测试采用浸泡法，取大小生长状况相当的叶片，尽量保证叶片的完整性，少含茎节，用蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸净表面水分，避开主脉将叶片切割成大小一致的叶块，混合均匀，称量0.1g放入装有5ml去离子水的10ml离心管中，放入shb-iii循环水式用真空泵中0.08mpa-0.098mpa压力下抽真空1h，以抽出细胞间隙中的空气，，水即被压入组织中而使叶圆片下沉至水中，盖上盖子置于室温下浸泡处理12，用电导仪测定浸提液电导率(r1),然后沸水浴加热30min，冷却至室温后摇匀，再次测定浸提液电导率(r2)。相对电导率＝r1/r2×100％。

超氧化物气化酶(sod)活力测定方法：采用氮蓝四唑(nbt)法测定。取0.2g叶片，加入2ml磷酸缓冲液预冷后于冰浴中研磨。混合液离心后取上清。反应体系为：1.5ml磷酸缓冲液(0.05m)+0.3ml甲硫氨酸溶液(130mmol/l)+0.3ml氮蓝四唑(750μmol/l)+0.3mledta-na2溶液(100μmol/l)+0.3ml核黄素溶(20μmol/l)，置于日光下反应20min后在波长560nm下测定比色值。sod活性＝(a0-as)*vt/a0*0.5*w*vs.式中，sod活性以每克鲜重酶单位表示；a0表示对照管的吸光值；as表示样品管的吸光值；vt表示样液总体积(ml)；vs表示测定时样品用量(ml)；w表示样品鲜重(g)。

丙二醛(mda)测定：采用巴比妥酸(tba)显色法。取0.5g叶片，加入5mltca(5％)研磨成匀浆，离心后取上清液2ml，在加入2mltba(0.67％)，100摄氏度沸水浴30min，冷却后再离心。在波长532nm处测定比色值。mda浓度(μmol/mg)＝(od测定-od空白)/(od标准-od空白)*10/蛋白质质量浓度(mg/ml)。

脯氨酸(pro)含量测定方法：采用磺基水杨酸法。取0.5g叶片，加入5ml磺基水杨酸(3％)，沸水浴10min。离心后取上清2ml，在加入冰乙酸和酸性茚三酮各2ml，然后继续沸水浴30min。待冷却后加入甲苯4ml，混匀后静置片刻，取上层脯氨酸甲苯溶液离心5min。在波长为520nm处测定比色值。根据测定的吸光值在标准曲线上查出2ml测定液中脯氨酸的含量(xμg/2ml)，然后计算样品中脯氨酸含量的百分数，计算公式如下：脯氨酸含量(μg/g)＝[x*5/2]/样重(g)。

过氧化物酶(pod)活性测定方法：采用采用愈伤木酚氧化法。取0.2g叶片加入2ml磷酸缓冲液研磨，离心10min后提取上清。反应体系：2.5ml磷酸缓冲液(ph5.5)+1mlh2o2(2％)+1ml愈创木酚(0.05mol/l)；与0.5ml上清液混合后立即开启秒表记录时间，在波长为470nm处比色，每隔1min记录1次，共记录3次。以每分钟内a470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)。过氧化物酶活性(u·g-1·min-1)＝△a470vt/w×vs×0.01×t。式中：△a470表示反应时间内吸光度的变化；w表示样品鲜重(g)；t表示反应时间(min)；vt表示提取酶液总体积(ml)；vs表示测定时取用酶液体积(ml)。

表1干旱胁迫对不同毛白杨生理生化代谢的影响

结果表明:在土壤含水量为低于10％时，毛白杨幼苗叶片的净光合速率和气孔导度、叶片水势、超氧化物歧化酶(sod)、过氧化物酶(pod)和过氧化氢酶(cat)活性显著下降；相对电导率、丙二醛(mda)含量、脯氨酸(pro)含量显著增加。而在土壤含水量高于10％条件下，各指标变化差异不显著，低于土壤含水量5％时，因干旱胁迫较严重，超过80％的毛白杨叶片凋落。

实施例2

干旱胁迫下对杨树五大派系生理变化特点研究

本试验采用胡杨、毛白杨、欧洲黑杨、小叶杨、大叶杨为试验材料，将这五种杨树苗移栽至直径20cm，高15cm塑料花盆中，供试土壤体积比为基质：珍珠岩＝3:1。每三天浇一次水，每次浇至土壤透水，当毛白杨由最初的高约为30cm长至约50cm时，停止浇水。杨树参数测定方法与实施例1一致，期间每天测一次土壤含水量，每隔2d测一次相关生理生化指标。

表2干旱胁迫对杨属五大派系各生理指标的影响

结果表明，仅在严重干旱胁迫条件下，杨树叶片水势、超氧化物歧化酶(sod)、过氧化物酶(pod)和过氧化氢酶(cat)活性显著下降；叶片相对电导率、脯氨酸(pro)含量、丙二醛(mda)含量显著增加。在适宜水分和中度干旱条件下，各生理指标不存在显著差异。

由上述实施例可知，通过本发明所述的方法能够科学、准确的确定不同品种杨树的干旱胁迫临界值，在获得所述干旱胁迫临界值后，利于不同品种杨树的水分管理，在保证杨树正常生长的情况下，最大限度的节约用水。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。