胎盘生长因子荧光免疫层析试纸条、测试板及试剂盒的制作方法

本实用新型涉及生物技术的荧光免疫层析检测领域，特别涉及一种胎盘生长因子荧光免疫层析试纸条、测试板及试剂盒。

背景技术：

胎盘生长因子(placenta growth factor，简称PLGF)主要由合体滋养层细胞合成，可与位于滋养层细胞和血管内皮细胞的酪氨酸酶受体结合，是一个对滋养层细胞功能有自分泌作用和对血管生长有旁分泌作用的蛋白。PLGF对滋养层细胞和内皮细胞功能有独特的调节作用，能够促进新生血管生成。

PLGF是一种高度特异性的标志物，胎盘合体滋养层细胞有供氧压力时PLGF水平显著降低，通过检测血液中的PLGF可以用来评估胎盘功能不全，还可以对由此引起的子痫前期进行预测、鉴别和治疗监测。

目前，胎盘生长因子的快速检测方法主要有酶联免疫法、使用微流控的荧光免疫法等，上述方法都需要对待检的血液样品进行预处理，例如酶联免疫法的操作较为复杂，需要特定专门的场所及恒温、振荡等设备，并且检测耗时较长，其测定结果也容易受操作人员的熟练程度的影响；使用微流控的荧光免疫法需要首先对待检血液样品进行离心处理，再对血清进行检测，所需要的时间较长；免疫层析试纸的组成部分，如样品垫等，对PLGF具有较强的非特异性吸附，导致进入检测膜的PLGF量减少，使检测值偏低，严重影响诊断结果。

综上所述，现有胎盘生长因子的检测方法和工具存在需要对待检样品进行预处理费时费力，测定值比实际值偏低影响诊断结果的问题。因此，需要设计一种能够对胎盘生长因子进行快速、便捷、准确、可靠的试纸条、测试板及试剂盒。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于，提供一种胎盘生长因子荧光免疫层析试纸条、测试板及试剂盒，结合荧光免疫分析仪实现对待检样品中胎盘生长因子的快速、便捷、准确、可靠的检测。

为了解决上述技术问题，本实用新型提供一种胎盘生长因子荧光免疫层析试纸条，该胎盘生长因子荧光免疫层析试纸条包括样品垫、检测膜和吸水垫。

所述样品垫包括玻璃纤维膜。

所述检测膜包括硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜。更进一步地，检测膜为硝酸纤维素膜。

所述吸水垫包括吸水纸。

所述玻璃纤维、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜和吸水纸均为市售的商品。

所述样品垫、检测膜和吸水垫顺次搭接。如附图1和附图2所示，样品垫与检测膜的一端搭接，检测膜的另一端与吸水垫搭接。相互搭接的样品垫与检测膜、检测膜与吸水垫的上下位置关系可以互换，不局限于附图2所示的上下位置关系。

所述样品垫与检测膜、检测膜与吸水垫之间接触的区域可以不使用任何辅助固定用品，例如将样品垫、检测膜和吸水垫放入卡槽中保持其特定的位置关系。也可以使用粘接的方式保持其特定的位置关系。

所述样品垫、检测膜和吸水垫的外形尺寸为常规，以能够实现测定目标为限。

所述样品垫的制备方法如下：步骤1)浸泡：将样品垫放入封闭剂组合物的溶液中浸泡0.5小时～2.0小时；步骤2)干燥：将步骤1)的样品垫取出，于20℃～40℃中干燥3小时～7小时。

所述封闭样品垫所用的封闭剂组合物包括聚氧乙烯蓖麻油、聚乙烯醇、海藻糖、蔗糖和缓冲液，聚氧乙烯蓖麻油、聚乙烯醇、海藻糖和蔗糖在所述缓冲液中的质量浓度百分比为(0.25％～0.55％):(0.05％～0.30％):(1.0％～6％):(10％～20％)；

所述缓冲液包括磷酸缓冲液，其磷酸根浓度为40mmol/L至100mmol/L，其pH 值为6.0至8.0。

采用上述封闭方法制备的样品垫具有较低的非特异性吸附作用，对待检样本中的目标物质吸附少，保证了目标物质与荧光抗体的结合，提高了检测的准确度；使样品垫与荧光抗体之间的吸附作用力处于合理区间，提高免疫层析试纸使用中荧光抗体的解吸率，降低了检测限，提高了检测精度；使免疫层析试纸适用于对全血样本的检测，无需对全血样本进行预处理，简化了检测过程。

所述样品垫上涂布有PLGF荧光抗体，也可称为“偶联荧光微球的PLGF单克隆抗体”。

所述样品垫上的PLGF荧光抗体的涂布量为0.1μg～2μg。

所述PLGF荧光抗体，其PLGF单克隆抗体和荧光微球是市场上销售的商品抗体和荧光材料。

所述PLGF荧光抗体的制备方法使用本领域常规技术制备，具体步骤如下：先用透析的方法去除抗体试剂中的叠氮化钠；然后用浓度50mM的pH6.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液将抗体稀释到1mg/mL；将微球加入到浓度50mM的pH6.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中，超声振荡10min，使其分散；在上述悬浮液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，使其终浓度为10mg/mL，在26℃下孵育15min，将微球活化；将微球悬浮液离心，去除上清液，再加入等体积的浓度50mM的pH6.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液，重新悬浮微球，离心并去除上清液；再用等体积的浓度50mM的pH6.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液，重新悬浮微球，加入上述抗体溶液，26℃下反应5h，期间不停振荡或者搅拌；加入乙醇胺，混合振荡15min；最后将含有PLGF荧光抗体悬浮液离心，去除上清液，待用。

本实用新型所述的PLGF荧光抗体还经过封闭步骤。

所述的封闭步骤包括：将洗涤后的PLGF荧光抗体悬浮于封闭剂组合物的溶液中进行封闭。

所述封闭PLGF荧光抗体所用的封闭剂组合物包括聚氧乙烯蓖麻油、聚乙烯醇、海藻糖、蔗糖和缓冲液，聚氧乙烯蓖麻油、聚乙烯醇、海藻糖和蔗糖在所述缓冲液中的质量浓度百分比为(0.02％～0.25％):(0.05％～0.30％):(1.0％～6％):(10％～20％)；

所述缓冲液包括磷酸缓冲液，其磷酸根浓度为10mmol/L至40mmol/L，其pH 值为6.0至8.0。

经上述封闭方法处理后的荧光抗体具有特殊的性质，能够使荧光抗体在试纸条制备过程中吸附于样品垫上，而在使用试纸条检测过程中使荧光抗体容易地从样品垫上解吸下来，随样品中的液体或者测试液体移动到检测膜，并移动到相应位置，使试纸条具备较好检测能力。经所述的封闭方法处理后，使荧光抗体的非特异性吸附作用降低，减少了对血液样品中其他生物大分子物质的吸附，可以使检测准确度和稳定性提高。

所述检测膜上依次设置有检测线和质控线，检测线和质控线相互平行，其中检测线靠近样品垫，质控线远离样品垫。所述质控线与吸水垫之间的距离、检测线与质控线之间的距离均为本领域的常规设置。

所述检测线涂布有PLGF单克隆抗体。

所述检测线上涂布的PLGF单克隆抗体的量为0.1μg～1.5μg。

所述质控线涂布有羊抗鼠IgG多克隆抗体。

所述质控线上涂布的羊抗鼠IgG多克隆抗体量为0.1μg～3.0μg

所述PLGF单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体均为市场上销售的商品抗体。

所述检测膜的制备工艺如下：以连续状态运行的划膜、划膜后干燥工序，以及设置于划膜后干燥工序之后、以连续状态运行的膜封闭、封闭后干燥工序；所述划膜、划膜后干燥工序的运行时间为2～4min，所述膜封闭、封闭后干燥工序的运行时间为3～6min。

所述检测膜的制备工艺的步骤如下：

a、划膜、划膜后干燥：

a1、划膜：取NC膜卷安置在出卷盘上，然后经过划膜仪，将稀释至所需浓度的抗体溶液在NC膜上划线或喷线；

a2、划膜后干燥：NC膜后端进行划线的同时，已完成划线的NC膜前端即刻进入到提前预热至干燥温度的干燥塔内，完成干燥；

b、膜封闭、封闭后干燥工序

b1、膜封闭：将经步骤a2干燥后的NC膜，匀速通过加有封闭液的浸液槽，对 NC膜进行封闭；

所述封闭液主要由封闭组分、表面活性剂组分溶解于pH7.0～8.0、50～60mM的 PB溶液中制成；所述封闭组分包括PEG4000、牛血清蛋白、明胶、甲醛、酪蛋白中的至少一种，所述封闭组分在封闭液中的质量百分含量为0.5～1.0％；所述表面活性剂组分包括tween-20、Pluranic L64、Cremophor EL、Surfynol 485、Tetronic 1307、 TRITON X-100中的至少一种，所述表面活性剂组分在封闭液中的质量百分含量为 0.5～1.0％；

b2、封闭后干燥：NC膜后端进行封闭的同时，已完成封闭的NC膜前端即刻进入到提前预热至干燥温度的干燥塔内，完成干燥后收卷。

所述步骤a2、b2中所述干燥温度均为35～40℃。

所述封闭液主要由封闭组分PEG4000、表面活性剂组分Surfynol 485溶解于pH 7.0、50mM的PB溶液中并调节封闭液pH至7.0制得；所述PEG4000、Surfynol 485 在封闭液中的质量百分含量分别为0.5％、0.6％。

所述封闭液中的表面活性剂组分还包括Pluranic L64，所述Pluranic L64在封闭液中的质量百分含量为0.2％。

使用上述具有高灵敏度、低检测限特性的检测膜，可以有效避免因血液样品中 PLGF浓度较低而显示检测值为零，无法作出正确的医学判断，影响诊断和治疗的情况；也可以有效避免假阳性的诊断结果(例如，血液样品中PLGF实际浓度约为80 pg/mL，其他测试板的检测值显示为110pg/mL，高于≥100pg/mL的诊断标准，而被诊断为正常阴性的情况)，造成误诊，耽误治疗最佳时间的情况。

采用上述样品垫封闭方法得到的样品垫能够减少对待测物质的非特异性吸附。采用上述荧光抗体封闭方法得到的荧光抗体能够减少对干扰物质的吸附，并且能够与样品垫较好的分离，进入检测膜。采用上述检测膜制备方法制备的检测膜具有高灵敏度、低检测限的特性，可使检测膜能够有效避免其他物质的干扰，对PLGF的检测具有更高的特异性。上述样品垫、荧光抗体和检测膜的特性使PLGF荧光免疫层析的最低检测限达小于12pg/mL，在PLGF浓度为12pg/mL至3000pg/mL的范围内，线性相关系数r≥0.95，并且测定结果的准确度较高，其标准偏差不超过8％。

为了解决上述技术问题，本实用新型还提供一种胎盘生长因子荧光免疫层析测试板，该胎盘生长因子荧光免疫层析测试板包括卡壳和设置在卡壳内的试纸条。

所述卡壳包括上壳和下壳，上壳上设置有加样孔和观察窗，所述加样孔对应试纸条的样品垫，所述观察窗对应检测膜上的检测线和质控线。

所述下壳上侧设置有固定试纸条的卡槽，其形状与放置其中的试纸条相同。

所述加样孔和观察窗的形状包括但不限于附图4所示的形状，例如加样孔还可以是椭圆形或者四边形等，观察窗还可以是长椭圆形，四角具有弧度的长方形等。

所述卡壳的上壳和下壳可以采用可拆卸式拼接而成，其内部的试纸条可以根据需要更换，卡壳可重复利用；也可以采用焊接的方式，例如用超声焊接的方式将上壳和下壳焊接起来。

所述上壳的上表面还喷涂有二维码，供荧光免疫分析仪识别到待检测的测试卡，省去了人工输入等操作，提高了检测速度，节省了操作时间，确保了检测分析的准确性。

所述设置在卡壳内的试纸条是前文所述胎盘生长因子荧光免疫层析试纸条。

使用所述测试板进行胎盘生长因子浓度测定时，所需的待检样品量极少，例如仅需100μL～300μL。

为了解决上述技术问题，本实用新型还提供一种胎盘生长因子荧光免疫层析试剂盒，该胎盘生长因子荧光免疫层析试剂盒包括胎盘生长因子荧光免疫层析测试板、样品管和射频识别卡。

所述试剂盒中装有多个测试板和样品管，测试板和样品管还可以分别独立包装，以避免不必要的外界污染，影响检测的准确性和稳定性。

所述射频识别卡内储存有标准曲线。

本实用新型所述试剂盒检测原理及过程如下：将规定体积的待测血液样品加到样品垫上，待测血液样品中的PLGF会与PLGF荧光抗体结合，形成荧光抗体-PLGF 复合物，此时样品垫上还有未与PLGF结合的PLGF荧光抗体。荧光抗体-PLGF复合物和未与PLGF结合的PLGF荧光抗体通过毛细作用层析至检测线处，检测线上固定的PLGF单克隆抗体会与荧光抗体-PLGF复合物的PLGF上另一位点结合，形成PLGF荧光抗体-PLGF-PLGF单克隆抗体复合物，该复合物被保留在检测线上。而未与PLGF结合的PLGF荧光抗体不与检测线上固定的PLGF单克隆抗体结合，可以越过检测线，层析至质控线，被质控线上的羊抗鼠IgG多克隆抗体捕获，在质控线形成羊抗鼠IgG多克隆抗体-PLGF荧光抗体复合物。由于PLGF荧光抗体被保留在检测线和质控线，血液样品中PLGF浓度高，则结合到检测线的荧光物质多；血液样品中PLGF浓度低，则结合到质控线的荧光物质多，所以可以使用荧光免疫分析仪检测两条线上的荧光强度，将荧光强度值代入标准曲线方程进行计算，可以得到血液样品中PLGF的浓度。

本实用新型提供的胎盘生长因子荧光免疫层析试纸条、测试板及试剂盒，克服了现有技术胎盘生长因子检测过程中需要对待检样品进行温育、离心等预处理，使检测时间延长的缺陷，还克服了样品垫对PLGF非特异性吸附较强，使检测值低于实际值，严重影响诊断结果的不足，能够实现对待检样品中胎盘生长因子的快速、便捷、准确、可靠的检测。

附图说明

图1为本实用新型的胎盘生长因子荧光免疫层析试纸条的结构示意图；

图2为本实用新型的胎盘生长因子荧光免疫层析试纸条的侧面示意图；

图3为本实用新型的胎盘生长因子荧光免疫层析试纸条和测试板下壳7的相对位置示意图；

图4为本实用新型的测试板上壳6示意图；

图5为本实用新型的胎盘生长因子荧光免疫层析测试卡的立体示意图；

其中：

1、样品垫，2、检测膜，3、吸水垫，4、检测线，5、质控线，6、上壳，7、下壳，8、加样孔，9、观察窗。

本实用新型的效果

采用本实用新型的胎盘生长因子荧光免疫层析试纸条、测试板及试剂盒的有益效果是：①大幅缩短了胎盘生长因子的检测时间，实现了胎盘生长因子的快速检测，从而可尽早对子痫前期等危重病症进行确诊，为相关病症的有效救治争取了时间；②提高了采用免疫层析法对PLGF检测的准确性，大幅减少临床诊断错误的比例；③无需对待检血液样品进行预处理，简化了胎盘生长因子检测的操作步骤，节省了检测时间；④所需样品量少。

具体实施方式

实施例1

采用附图5所示本实用新型的胎盘生长因子荧光免疫层析测试板，其上壳6和下壳7是通过超声波焊接，其内部设置有如附图1所示的胎盘生长因子荧光免疫层析试纸条，样品垫1和吸水垫3放置在下层，检测膜2放置在样品垫1和吸水垫3 的上侧，样品垫1与检测膜2、检测膜2与吸水垫3搭接在一起，即有部分重叠，如附图2所示。试纸条放置在下壳7上侧的卡槽内，如附图3所示。试纸条的样品垫1 采用玻璃纤维膜，为使用本实用新型所述的样品垫处理方法得到的玻璃纤维样品垫； PLGF荧光抗体经本实用新型记述的封闭方法处理后，涂布在样品垫1上。试纸条的检测膜2使用硝酸纤维素膜，检测膜2上设置有检测线4和质控线5，检测线4上涂布有PLGF单克隆抗体，质控线5上涂布有羊抗鼠IgG多克隆抗体，然后采用本实用新型记述的方法进行封闭处理。检测线4与质控线5平行设置，且都平行于检测膜2的短边，其中检测线4靠近样品垫1，质控线5远离样品垫1。在测试板上壳6 上侧的观察窗9长边的侧面还喷涂有二维码，储存有测试板识别相关信息。上述测试板放置在试剂盒中，其中还有样品管和射频识别卡，射频识别卡中储存有标准曲线相关数据。

使用试剂盒中的样品管，吸取PLGF标准固定浓度的标准品(100pg/mL)200μL，将吸取的标准品全部滴加到测试板加样孔8中，将测试板插入荧光免疫分析仪中，荧光免疫分析仪通过扫描测试板上的二维码读取批号等相关信息，荧光免疫分析仪自动调整测定参数(如层析温度、层析时间、荧光激发波长、检测波长等)，若分析仪中储存了该批号的标准曲线，则读取测试板上相关的荧光强度，并直接在荧光免疫分析仪的显示屏可显示出该标准品的浓度。若分析仪中没有读取的批号的标准曲线，则提示操作人员录入射频卡中的相关信息，将储存有标准曲线的射频识别卡放置在荧光免疫分析仪的读卡处，荧光免疫分析仪读取相关标准曲线(一张卡一个批次信息，同批次的产品只需往分析仪内写入一次批次信息，也可在第一次使用该批次试剂盒时先写入批次信息)，录入后分析仪继续扫描测试板上的荧光值，将荧光强度值代入标准曲线方程进行计算，显示出胎盘生长因子的浓度。整个检测过程仅耗时约16分钟。

采用同一批次的胎盘生长因子荧光免疫层析测试板对上述PLGF标准固定浓度的标准品进行15次平行测定。再使用方法成熟、稳定性好的ELISA试剂盒测定同一 PLGF标准固定浓度的标准品进行测定，同样进行15次平行测定。计算两种检测手段得到的测定结果的相关性，相关系数R＝0.9934，表明两者相关性良好，本实用新型的胎盘生长因子荧光免疫层析测试板的测定结果能够达到成熟的ELISA试剂盒的测定结果。但与成熟的ELISA试剂盒测定方法相比，使用本实用新型的胎盘生长因子荧光免疫层析测试板避免了样品预处理的步骤，减少人工操作，避免了人员操作带来的误差，且测定时间大幅缩短，实现了胎盘生长因子的快速检测，使用的待检血液样品量仅为200μL。

实施例2

采用附图5所示本实用新型的胎盘生长因子荧光免疫层析测试板，其上壳6和下壳7是通过卡扣连接，其内部设置有胎盘生长因子荧光免疫层析试纸条，样品垫1 和吸水垫3放置在下层，检测膜2放置在样品垫1和吸水垫3的上侧，样品垫1、检测膜2和吸水垫3的宽度相同，样品垫1与检测膜2、检测膜2与吸水垫3搭接并粘接在一起，即有部分重叠，如附图2所示。试纸条粘在下壳7上侧适当位置，该适当位置是指试纸条的样品垫和检测膜1上检测线4、质控线5分别与上壳6的加样孔 8和观察窗9向对应。试纸条的样品垫1采用玻璃纤维膜，为使用本实用新型所述的样品垫处理方法得到的玻璃纤维样品垫；PLGF荧光抗体经本实用新型记述的封闭方法处理后，涂布在样品垫1上。试纸条的检测膜2使用硝酸纤维素膜，检测膜2上设置有检测线4和质控线5，检测线4上涂布有PLGF单克隆抗体，质控线5上涂布有羊抗鼠IgG多克隆抗体，然后采用本实用新型记述的方法进行封闭处理。检测线4 与质控线5平行设置，且都平行于检测膜2的短边，其中检测线4靠近样品垫1，质控线5远离样品垫1。在测试板上壳6上侧的观察窗9长边的侧面还喷涂有二维码，储存有测试板识别相关信息。上述测试板放置在试剂盒中，其中还有样品管和射频识别卡，射频识别卡中储存有标准曲线相关数据。

使用试剂盒中的样品管，吸取待检血液样品200μL，将吸取的样品全部滴加到测试板加样孔8中，将测试板插入荧光免疫分析仪中，荧光免疫分析仪通过扫描测试板上的二维码读取批号等相关信息，荧光免疫分析仪自动调整测定参数(如层析温度、层析时间、荧光激发波长、检测波长等)，若分析仪中储存了该批号的标准曲线，则读取测试板上相关的荧光强度，并直接在荧光免疫分析仪的显示屏可显示出该标准品的浓度。若分析仪中没有读取的批号的标准曲线，则提示操作人员录入射频卡中的相关信息，将储存有标准曲线的射频识别卡放置在荧光免疫分析仪的读卡处，荧光免疫分析仪读取相关标准曲线(一张卡一个批次信息，同批次的产品只需往分析仪内写入一次批次信息，也可在第一次使用该批次试剂盒时先写入批次信息)，录入后分析仪继续扫描测试板上的荧光值，将荧光强度值代入标准曲线方程进行计算，显示出胎盘生长因子的浓度。整个检测过程仅耗时约16分钟。对该血液样品平行测定7次，计算测定结果的平均值，然后计算其相对偏差，结果显示测定结果的相对偏差为6.3％，表明其具有良好的稳定性。

由此可知，本实用新型所述的胎盘生长因子荧光免疫层析测试板可直接对未经离心处理去除血细胞的血液样品进行测定，避免了样品预处理的步骤，减少人工操作，避免了人员操作带来的误差，且测定时间大幅缩短，实现了胎盘生长因子的快速检测，且使用的待检血液样品量仅为200μL。

对比例1

采用本领域技术人员知晓的现有技术对样品垫、荧光抗体、检测膜进行制备和处理，然后组装成胎盘生长因子荧光免疫层析测试板，对离心获得的血清样品进行7 次平行测定。计算测定结果的平均值，然后计算其相对偏差，结果显示测定结果的相对偏差为14.3％，表明其测定的稳定性较差。

综上所述，采用本实用新型的胎盘生长因子荧光免疫层析试纸条、测试板及试剂盒能够获得与目前成熟稳定的ELISA试剂盒方法测定结果的准确性和稳定性基本相同的效果，并且还能够大幅缩短了胎盘生长因子的检测时间，实现了胎盘生长因子的快速检测。还克服了现有技术的荧光免疫层析法对PLGF检测的准确性不足和稳定性不够的缺点。可直接对全血样品进行测定，无需对待检血液样品进行预处理，简化了胎盘生长因子检测的操作步骤，节省了检测时间。