用于快速诊断哮喘或过敏性疾病的试剂盒的制作方法

本发明涉及用于诊断哮喘或过敏性疾病的试剂盒。本发明涉及可通过利用免疫色谱法来在外界(医院、门诊)或家中在20分钟内快速诊断以往不容易诊断的婴幼儿或小儿的哮喘或过敏性疾病的试剂盒。

背景技术：

在全世界范围内，哮喘和过敏性疾病的发病率和重症度持续增加。在美国，7％的小儿患有哮喘，并且，与支气管哮喘类似的作为呼吸道疾病的慢性鼻窦炎也占有15％。由于对这种疾病的诊断不简单，到目前为止还是没有找到用于帮助医师们诊断或预防疾病恶化的简单的诊断法。虽然知道在哮喘或过敏性疾病患者的呼吸道内发生慢性呼吸道炎症反应，但实际上，还是没有找到除了能够检测呼吸道炎症反应的研究目的的几种实验室性免疫检测法之外的简单的临床诊断法。

尤其，难以区分呼吸道炎症是否由如细菌感染等微生物感染引起的还是在如哮喘等过敏性疾病中由过敏免疫反应引起的。由于这些原因，患有哮喘或过敏性疾病的患者们在大多数情况下接受长期使用抗生剂等的错误的治疗。

目前，利用于支气管哮喘的诊断中的肺功能检查及乙酰甲胆碱支气管激发试验在使用过程中具有各种困难，即，为了获得准确的结果，需要良好的设备管理、熟练的检查人员、患者的积极配合，但由于这些原因，不容易对无法积极配合的6岁以下的婴幼儿或小儿患者、高龄层患者、身体障碍人士、目前哮喘已经严重恶化的患者等进行检查。

并且，由于患者需要消耗很多体力而容易对检查产生反感，因此大多数情况下无法反复进行检查。因此，从以前开始就试图开发有助于哮喘的诊断的非侵入式或血液检查，而与此有关的为目前辅助性地利用于哮喘患者的血液嗜酸性粒细胞数、血清嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(eosinophilcationicprotein；ecp)等。这些在正常人、其他过敏性患者、哮喘等之间具有个人差别，因此无法利用于诊断中。

因此，若能够开发可对在哮喘和过敏性疾病中作为最重要的免疫反应的嗜酸性粒细胞性炎症反应检测的简单的诊断用具，则可将会对如哮喘等疾病的诊断和治疗作出巨大的贡献。

技术实现要素：

技术问题

本发明所要解决的问题为提供可高可靠性地快速诊断哮喘或过敏性疾病的试剂盒。

技术方案

本发明的用于诊断哮喘的试剂盒可包括检测条，上述检测条包括：基底部；第一反应部，位于上述基底部的上部，并包含从杂交瘤细胞株(保藏编号为kclrf-bp-00389)表达的单克隆抗体；以及展开膜，位于上述第一反应部与上述基底部之间，并包括包含从杂交瘤细胞株(保藏编号为kclrf-bp-00389)表达的单克隆抗体的第二反应部。

本发明的用于诊断过敏性疾病的试剂盒可包括检测条，上述检测条包括：基底部；第一反应部，位于上述基底部的上部，并包含从杂交瘤细胞株(保藏编号为kclrf-bp-00389)表达的单克隆抗体；以及展开膜，位于上述第一反应部与上述基底部之间，并包括包含从杂交瘤细胞株(保藏编号为kclrf-bp-00389)表达的单克隆抗体的第二反应部。

有益效果

本发明提供可高可靠性地快速诊断哮喘或过敏性疾病并预测及监测哮喘或过敏性疾病的预后的试剂盒。

附图说明

图1为根据本发明一实施例的用于诊断哮喘的试剂盒所包括的检测条的示意图。

图2为将哮喘症状积分与通过elisa法检测的edn、ecp及总嗜酸性粒细胞数进行比较的结果。图2的a部分为edn与哮喘症状积分的比较结果，图2的b部分为ecp与哮喘症状积分的比较结果，图2的c部分为与总嗜酸性粒细胞与哮喘症状积分的比较结果。

图3示出根据本发明的用于诊断哮喘的试剂盒与当通过elisa法诊断时的相关关系。

图4示出根据本发明的用于诊断哮喘的试剂盒与基于mbl的诊断的相关关系(r＝0.8933)。

图5示出根据本发明的用于诊断哮喘的试剂盒与基于bf的诊断的相关关系(r＝0.8748)。

具体实施方式

参照附图详细说明本发明，以使本发明所属领域的普通技术人员根据实施例容易实施本发明。本发明能够以多种不同形式来体现，且并不限定于在此说明的实施例中。附图中，为了明确说明本发明，省略了与说明无关的部分，在整个说明书中，对相同或类似的结构要素使用相同的名称。

在本说明书中，“上部”和“下部”以附图为基准来定义，根据观察角度，“上部”可变更为“下部”，而“下部”可变更为“上部”，“上面(on)”或“上部(on)”也可以包括中间介有其他结构的情况，而不仅指就在上面的情况。相反地，“直接在上面(directlyon)”或“就在上面”表示在中间没有其他结构。

在本说明书中，术语“杂交瘤”是指人工融合两种不同种类的细胞来制备的细胞。使用如聚乙二醇等使产生细胞融合的物质或特定种类的病毒来融合两种以上的同种细胞或异种细胞，由此制备杂交瘤细胞，可通过形成杂交瘤细胞来将互不相同的细胞所具有的其他功能整合到一个细胞中。若根据本发明的目的，可利用从保藏编号为kclrf-bp-00389(保藏日期：2017年1月9日，保藏单位：韩国细胞系研究联盟(kclrf))的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体。包含在试样中的嗜酸性粒细胞来源神经毒素(edn：eosinophil-derivedneurotoxin)在第一反应部120与单克隆抗体结合后通过展开膜130移动并到达第二反应部140，则可在第二反应部140与单克隆抗体结合来被检测到。

本发明中所使用的术语“单克隆抗体”作为在本领域中公知的术语，意味着指示单抗原性部位(表位(epitope))的高度特异性抗体。一般而言，单克隆抗体与包含指示不同的表位的不同的抗体的多克隆抗体不同，单克隆抗体指示抗原上的单表位。单克隆抗体具有改善利用抗原-抗体结合的诊断及分析学分析法的选择性和特异性的优点，并且，可通过融合细胞株(杂交瘤(hybridoma))的培养或噬菌体展示(phagedisplay)方法来生产，因此具有不被其他免疫球蛋白污染的优点。

本发明的单克隆抗体能够以没有纯化的状态使用，但按照在本领域中通常使用的方法并根据需要，进行纯化之后再使用。作为这种纯化方法的例，包括透析、盐沉淀、离子交换层析法、尺寸排除色谱法、亲和层析法等，但本发明的抗体纯化方法并不限定于上述例。

并且，本发明的单克隆抗体除非通过识别抗原的特定表位来具有抗原-抗体复合体的结合特性，不仅包含重链可变区及轻链可变区的形态，而且还包含抗体分子的功能性片段。上述抗体分子的功能性片段是指至少保有抗原结合功能的片段，可以为fab、f(ab')、f(ab')2及fv等。

本发明的单克隆抗体可以为均包含重链可变区及轻链可变区的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体的轻链及重链的可变区包括公知为“互补决定区(complementarity-determiningresion，cdr)”的三个多变性区域及四个“框架区(frameworkregion，fr)”。

上述cdr的主要作用为与抗原的表位(epitope)结合。各个链的cdr典型地从n-末端依次被称为cdr1、cdr2、cdr3，并且，通过位于特定cdr的链来识别。另一方面，可通过在互补决定区(cdr)结合公知的治疗用抗体的框架区(fr)来制备本发明的单克隆抗体。在本发明中，提供与上述单克隆抗体的重链及轻链的可变区有关的cdrs的碱基序列。

作为通过识别抗原的特定表位来形成抗原-抗体复合体的抗体的重要部位的重链和轻链的可变区，尤其cdr(complementaritydeterminingregion)决定复合体的亲和力，因此，可通过克隆单克隆抗体基因来分析与抗体重链和轻链的可变区有关的基因碱基序列。为了分析碱基序列，可从融合细胞株提取rna并利用小鼠免疫球蛋白引物对(mouseig-primerset，novagen，ca，usa)等来执行rt-pcr。

在本说明书中，术语“试剂盒”可包含适合于分析方法的一种或两种以上种类的其他结构成分组合物、溶液或装置。

根据本发明的目的，可利用从保藏编号为kclrf-bp-00389(保藏日期：2017年1月9日，保藏单位：韩国细胞系研究联盟(kclrf))的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体。若包含在试样中的嗜酸性粒细胞来源神经毒素(edn：eosinophil-derivedneurotoxin)在第一反应部120与单克隆抗体结合后通过展开膜130移动并到达第二反应部140，则可在第二反应部140与单克隆抗体结合来被检测到。上述单克隆抗体包含如选自由金、辣根过氧化物酶(hrp，horseradishperoxidase)、碱性磷酸酶(alkalinephosphtase)、荧光素(fluorescein)及色素组成的组中的一种以上标志物等的标志物，因此，若在第二反应部显色，则可检测为哮喘或过敏性疾病。

并且，上述试剂盒可包含在抗体生产细胞株的筛选中所需要的所有生物学或化学试剂、说明书。说明书为说明如说明所提出的反应条件的方法等试剂盒使用法的印刷品。说明书可包括小册子或传单形态的说明册子、附着于试剂盒的标签以及包括试剂盒的包装的表面上的说明。并且，说明书可包括通过如网络等电介质公开或提供的信息。

在本说明书中，术语“哮喘”是指呼吸困难、咳嗽、粗重的喘息声等症状反复发作的疾病，“过敏”是指与某种外来性物质接触的生物体对其物质产生与正常不同的反应的现象。上述过敏分为i型、ii型、iii型及iv型。根据本发明的目的，可利用从保藏编号为kclrf-bp-00389(保藏日期：2017年1月9日，保藏单位：韩国细胞系研究联盟(kclrf))的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体。若包含在试样中的嗜酸性粒细胞来源神经毒素(edn)在第一反应部120与单克隆抗体结合后通过展开膜130移动并到达第二反应部140，则可在第二反应部140与单克隆抗体结合来诊断及检测哮喘及过敏、喘鸣(wheezing)。

参照图1来说明根据本发明一实施例的用于诊断哮喘的试剂盒。图1为根据本发明一实施例的用于诊断哮喘的试剂盒所包括的检测条的示意图。

参照图1，根据本实施例的用于诊断哮喘的检测条100可包括基底部110、形成于基底部110的上部并包含单克隆抗体的第一反应部120以及形成于第一反应部120与基底部110之间的展开膜130。展开膜130与第一反应部120相接触。展开膜130包括包含单克隆抗体的第二反应部140以及与第二反应部140以规定间距相隔开的对照部150。

在根据本实施例的用于诊断哮喘的试剂盒中，若包含在试样中的嗜酸性粒细胞来源神经毒素(edn：eosinophil-derivedneurotoxin)在第一反应部120与单克隆抗体结合后，通过展开膜130移动并到达第二反应部140，则在第二反应部140与单克隆抗体结合来被检测到。在第二反应部140可通过确认第一反应部来源单克隆抗体与第二反应部来源单克隆抗体的结合来确认试样中存在edn，因此，可判断被取样过试样的患者患有哮喘。根据本实施例的用于诊断哮喘的试剂盒可通过利用抗原edn与单克隆抗体之间的免疫反应的免疫色谱来诊断哮喘或过敏性疾病。相对于正常人，患有哮喘和过敏性疾病的患者的edn高。

上述试样从受试体取样，例如，可包括全血、血清、血浆、鼻腔清洗液、支气管肺泡清洗液、喀痰、淋巴液或细胞间液。对受试体，即，检查对象并不特别限制，但可以为婴幼儿或小儿。

根据本实施例的诊断试剂盒通过与edn结合的第一反应部来源单克隆抗体和第二反应部来源单克隆抗体并以两步骤来诊断哮喘，从而可更加准确且快速地诊断哮喘。

在第一反应部来源单克隆抗体中，edn中表位(epitope)部位附着于抗体互补决定区(complementdeterminingregion，cdr)的独特型(idiotype)。作为单克隆抗体，可从保藏编号为kclrf-bp-00389(保藏日期：2017年1月9日，保藏单位：韩国细胞系研究联盟(kclrf))的杂交瘤细胞株制备。可通过普通技术人员公知的常规的方法来制备杂交瘤细胞株。例如，可通过将接种了edn抗原的小鼠的脾脏细胞与小鼠来源骨髓瘤细胞融合来制备，但并不限定于此。从杂交瘤细胞株获得单克隆抗体的方法基于普通技术人员公知的常规的方法。

第二反应部来源单克隆抗体中，edn中表位(epitope)部位附着于抗体互补决定区(complementdeterminingregion，cdr)的独特型(idiotype)。作为单克隆抗体，可从保藏编号为kclrf-bp-00389(保藏日期：2017年1月9日，保藏单位：韩国细胞系研究联盟(kclrf))的杂交瘤细胞株表达。可通过在单克隆抗体结合酶来制备第二反应部来源单克隆抗体。上述酶可以为辣根过氧化物酶(hrp，horseradishperoxidase)、碱性磷酸酶(alkalinephosphtase)等。在抗体结合酶的方法基于普通技术人员公知的常规的方法。

如利用本发明的利用免疫色谱的用于应急诊断哮喘或过敏性疾病的检测条，则可容易且在经济上有效检查在哮喘和过敏性疾病患者中以高数值出现的edn，从而可在外界或家中快速诊断以往不容易诊断的婴幼儿或小儿的哮喘或过敏性疾病。

以下，更详细地说明根据本发明一实施例的用于诊断哮喘的试剂盒。

用于支撑第一反应部、展开膜的基底部110可由普通技术人员公知的材质制备。例如，基底部110可由塑料、金属材质、硝化纤维素膜形成。

第一反应部120可包含单克隆抗体，第一反应部120也可以包含单克隆抗体本身，但若在单克隆抗体结合金，则可在展开膜中获得显色效果。与金结合的单克隆抗体可呈现粉红色。在单克隆抗体结合金的方法中，可通过将单克隆抗体与含金离子化合物(例如，胶体金)混合后还原金离子来使金粒子与单克隆抗体结合。金粒子的平均粒径可以为10nm至100nm。在上述氛围内，可具有更卓越的检测效果。

第一反应部120与试样注入部相连接，因此可接收从患者取样的试样。虽然未在图1中示出，但第一反应部120与过滤器垫相连接，因此在从患者取样的试样注入第一反应部120之前经过过滤器垫，从而去除杂质等来进行注入，由此可进一步提高哮喘诊断可靠性。

第一反应部120形成于由聚酯纤维、玻璃纤维或植物纤维形成的结合垫，从而可稳定的包含第一单克隆抗体。例如，结合垫可以为纤维垫。

展开膜130与第一反应部120相接触，因此，使从第一反应部120通过毛细管现象移动的试样中edn与单克隆抗体的结合物可通过第二反应部140及对照部150来移动。

由于第二反应部140包含单克隆抗体，可与edn结合。edn与第一反应部来源单克隆抗体及第二反应部来源单克隆抗体的结合结果可通过显色来确认。显色结果，第二反应部可呈现粉红色。如上所述，确认显色时，可在第一反应部来源单克隆抗体附着金粒子，但除此之外，作为常规方法，还可以使用辣根过氧化物酶(hrp，horseradishperoxidase)、碱性磷酸酶(alkalinephosphtase)、荧光素(fluorescein)及色素等标志物。优选地，根据进行显色反应的标志物来使用用于诱导显色的显色基质，并且，可使用，3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(tmb，3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine)、2，2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(abts，2，2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)及邻苯二胺(opd，o-phenylenediamine)等。

在展开膜130形成有对照部150，从而通过正常启动诊断试剂盒来判断是否结束诊断检查。

对照部150通过使试样移动第一反应部和第二反应部来通知是否结束检查，而与试样是否包含edn无关。对照部150包含兔来源小鼠免疫球蛋白(igg)抗体，因此，若包含在第一反应部的单克隆抗体中不与edn结合的单克隆抗体通过展开膜移动并到达对照部，则通过与小鼠免疫球蛋白抗体反应来获知检查结束。与兔来源抗小鼠免疫球蛋白结合的单克隆抗体呈现粉红色，若在对照部呈现粉红色，就意味着诊断结束。

展开膜130作为多孔性薄膜型膜，可包含尼龙、聚酯、纤维素、聚砜、聚偏二氟乙烯、纤维素乙酸酯、聚氨酯、玻璃纤维、硝化纤维素中的一种以上，以使试样在第二反应部140和对照部150展开。优选地，作为展开试剂，利用磷酸盐缓冲液、食盐水、三(羟甲基)氨基甲烷(tris-hcl)、水等。

如图1所示，检测条100可包括吸收垫160。吸收垫可使通过对照部150的试样、抗体残留物被吸收。

虽然未在图1中示出，但根据本实施例的用于诊断哮喘的试剂盒为了固定检测条100且防止第一反应部、第二反应部及对照部与外界接触或被污染，可在检测条的上部包括外壳(housing)。外壳由不与任何实际反应的材质形成，例如，可由玻璃或塑料形成。

并且，本发明的诊断试剂盒可通过单克隆抗体来对edn进行定量化，因此，相比于以往使用的tec或ecp，可更有效地诊断哮喘或过敏性疾病，而且可以反映各重症度之间的差异。

以上，说明了根据本发明一实施例的用于诊断哮喘的试剂盒，但edn在过敏性疾病中也作为有效的抗原，因此可在过敏性疾病诊断中使用。

以下，通过本发明的优选实施例来更详细地说明本发明的结构及作用。但是，其作为本发明的优选例，因此在任何意义上不应解释为本发明限定于此。

实施例1：杂交瘤细胞株的制备

将50μg至100μg的溶解于弗氏完全佐剂(freund'scompleteadjuvant)的天然edn抗原静脉注射于雌性balb/c小鼠(6周龄至8周龄)。每隔2周至3周注射50μg至100μg的溶解于不完全佐剂的edn抗原。在最后注射edn抗原后，从小鼠的眼睛的出血确认抗体形成。一旦确认到抗体形成，则连续3天至4天注入100μg至200μg的抗体。剖开小鼠并放入70％的酒精中来灭菌。去除脾脏，清洗脾脏细胞后，进行离心分离来获得并悬浮于无血清培养基中。

以1.5：1.1融合脾脏细胞与从p3x63ag8.653小鼠细胞株获得的骨髓瘤细胞。由此选取杂交瘤细胞株。将所制备的杂交瘤细胞株于2017年1月9日保藏在韩国细胞系研究联盟(kclrf)，从而接收到保藏编号为kclrf-bp-00389。

实施例2：单克隆抗体的制备

在组织培养烧瓶中培养单克隆抗体来生产实施例的杂交瘤细胞株，具体地，在75cm²的组织培养烧瓶中，在25ml的dmem(gibcobrl，u.s.a.)中添加5×10⁶个细胞后，在37细胞培养器中过多增殖4～5天后，回收细胞培养液。在1500rpm的条件下离心分离所回收的细胞培养液15分钟来去除细胞成分并仅回收细胞上层液，从而生产单克隆抗体。在4℃或-20℃的温度下保管所生产的单克隆抗体，直到使用于试验中。

在单克隆抗体结合金胶体。即，在使用柠檬酸钠溶液还原氯化金来制备纯金后，添加所制备的单克隆抗体并制备在532nm的波长吸光度为10±1的与大小为40nm的抗体结合的金粒子。为了使与金粒子结合的抗体稳定化，用聚乙二醇(peg)溶液处理。由此制备单克隆抗体。

实施例3：单克隆抗体的制备

除了在制备上述单克隆抗体时不结合金胶体之外，以相同的方法制备。

实施例4：诊断试剂盒的制备

将在上述实施例2中所制备的金粒子与单克隆抗体结合的金接合体在每条检测条混合8.3μl/检测条，用聚酯纤维或玻璃纤维浸湿并干燥来制造包括第一反应部的结合垫。

将在上述实施例3中所制备的单克隆抗体在每条检测条以0.75μl/检测条的浓度并用pbs稀释，在硝化纤维素展开膜上涂敷于第二反应部的位置来形成第二反应部。在展开膜中的对照部的位置以0.75μl/检测条的浓度涂敷兔抗小鼠抗体来形成对照部。

在所制备的上述展开膜重叠放置所制备的上述结合垫后，以4.45mm/检测条的大小切断后，安装于塑料外壳来制造哮喘或过敏性疾病诊断试剂盒。

实验例1：用于快速诊断哮喘或过敏性疾病的生物标志物筛选

为了证明在本发明中使用于哮喘或过敏诊断的edn优于以往的为了诊断哮喘或过敏而使用的总嗜酸性粒细胞数(totaleosinophilcount'tec)或ecp(eosinophilcationicprotein)，将哮喘或过敏症状积分与通过elisa法检测的edn、ecp及总嗜酸性粒细胞数进行比较。其结果，如图2所示，相比于tec或ecp，edn最好地反映了各哮喘或过敏症状积分的各重症度之间的差异。因此，确认到在诊断哮喘或过敏时可将edn作为有用的抗原来使用。

实验例2：与elisa之间的诊断结果比较

从诊断为哮喘或过敏的5岁婴幼儿中获得edn浓度为0.62ng/ml以上的80个血清检体，并获得相同年龄的没有哮喘或过敏症状的50个正常血清检体，通过本发明的诊断试剂和elisa法来检测。如图3所示，基于本发明的诊断试剂盒和elisa法的检查时的相关关系为r＝0.603、p<0.001，表现优秀，呈现出可充分将本发明的诊断试剂盒使用为快速诊断试剂盒的结果。

实验例3：与mbl、bf试剂盒之间的诊断结果比较

对于与实验例2相同的检体，将本发明的诊断试剂盒(快速(rapid))与作为以往的公知为用于诊断哮喘及过敏性疾病的试剂盒的mbl(medical&biologicallaboratoriesco.，ltd)试剂盒、bf试剂进行比较检查。如图4及图5所示，基于本发明的诊断试剂盒与mbl试剂盒、bf试剂盒的检查时的相关关系分别为r＝0.8933、r＝0.8748，表现优秀，呈现出可充分将本发明的诊断试剂盒使用为快速诊断试剂盒的结果。

本发明的简单变形或变更可由本领域的普通技术人员容易实施，而可将这种变形或变更视为均包括在本发明的领域。

[保藏编号]

保藏单位：韩国细胞系研究联盟(kclrf)

保藏编号：kclrf-bp-00389

保藏日期：2017年1月9日

韩国细胞系银行(kclb,koreancelllinebank)

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pct/ro/134表