一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测吸烟者尿液中苯并[a]芘的方法与流程

本发明属于烟草制品化学分析技术领域，特别涉及一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测吸烟者尿液中苯并[a]芘的方法。

背景技术：

苯并[a]芘(b[a]p)是毒性最强的多环芳烃类化合物；肿瘤流行病学调查及动物实验研究发现b[a]p具有较强致癌性，与肿瘤的发生密切相关，尤其与人类肺癌的发生高度相关。苯并[a]芘是卷烟主流烟气中的重要有害成分，也是烟草安全评价的重要检测指标，因此准确测定吸烟者尿液中的b[a]p对于进一步深入了解吸烟与健康具有重要意义。

对b[a]p的测定，常用的方法有：gc-ms法、lc-ms法和hplc荧光检测法等。该类方法的样品前处理通常需采用萃取或固相萃取分离净化。样品前处理需多次的浓缩、转移，操作复杂麻烦，可引入实验误差的环节过多，导致实验结果精密度较差；而且有机溶剂消耗大，对环境污染大。因此，寻找更简便、快速且对环境友好的苯b[a]p测定方法具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测吸烟者尿液中苯并[a]芘的方法，其能够对吸烟者尿液中苯并[a]芘进行快速有效提取分离，无需多次的提取、转移、浓缩等过程，整个样品前处理过程高效简便，保障了检测结果的准确性和精密度。

一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测吸烟者尿液中苯并[a]芘的方法，包括以下步骤：

(1)标准溶液的配制：准确称取0.1g的苯并[a]芘于100ml容量瓶中，用乙腈定容至浓度为1.0mg/ml标准储备液，并逐级稀释标准储备液得到6级标准工作溶液，分别为：10.0ng/ml、20.0ng/ml、40.0ng/ml、80.0ng/ml、120.0ng/ml、200.0ng/ml，通过hplc分析，以标样峰面积(a)与浓度(c)进行线性回归，得到线性回归方程；

(2)样品前处理：准确量取吸烟者尿液样品10～30ml于50ml锥形瓶中，用0.2mol/l的hcl将尿液样品的ph调节到5，并加入0.5mol/l的醋酸缓冲液(ph5.0)1.25～3.75ml；随后再加入60μl的β-葡糖甘酸酶/芳基硫酸酯酶，在37℃的振荡水浴锅中酶解8～12h，将酶解液浓缩至干，加入1.0～3.0g的硅胶并与尿液样品充分研磨均匀，烘干；

(3)样品提取、浓缩：将步骤(2)处理好的样品置于本发明自制的提取净化装置中，冷凝回流、浓缩；

(4)样品检测：用乙腈溶解步骤(3)浓缩后的残留物，并过滤至色谱瓶中，利用hplc进行检测；

(5)采用峰面积法进行定量计算，通过样品中苯并[a]芘的峰面积代入线性回归方程计算，即可确定吸烟者尿液样品中的苯并[a]芘含量。

本发明优选的实施方案中，步骤(3)中的hplc的检测条件为：

色谱条件：色谱柱为watersacquityuplcbehc18色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)；柱温40℃；流动相为：乙腈/水的体积比68/32，流速为0.5ml/min；采用荧光检测器fid，程序波长检测，0～6.5min：激发波长365nm，发射波长450nm；6.5～12.0min：激发波长384nm，发射波长406nm。

本发明优选的实施方案中，步骤(2)中自制的提取净化装置的结构如下：

烧瓶1，烧瓶1上设有第一接口3、第二接口4和螺纹接口2，烧瓶1通过第一接口3与隔热导气管5气流导通连接，隔热导气管5另一端与三通转接管7气流导通连接，三通转接管7的另外两个接口分别与密闭冷凝管10和样品筒8气流导通连接，密闭冷凝管10上设有泄压阀11，样品筒8远离三通转接管7的一端设有筛板12并与固相萃取柱9气流导通连接，固相萃取柱9的另一端通过溶剂回流管6与第二接口4气流导通连接，溶剂回流管6内设有三通阀13。

本发明优选的实施方案中，螺纹接口2与色谱进样瓶15可拆卸连接。

本发明优选的实施方案中，步骤(3)中的提取试剂为己烷-乙醇的混合溶剂，其体积比为98:2。

本发明优选的实施方案中，隔热导气管5和溶剂回流管6采用软质材料，如pes；具有一定的伸缩性，方便操作过程中的组装连接。

本发明优选的实施方案中，样品筒8和固相萃取柱9为耐有机溶剂腐蚀的塑料材质，筛板12为塑料筛板或金属筛板，其余部件，例如烧瓶1、三通阀13以及密闭冷凝管10为玻璃材质。

本发明优选的实施方案中，密闭冷凝管10上设有泄压阀11，当加热回流时提取装置中压力过高时可自动泄压，防止压力过高对装置造成破坏。

本发明优选的实施方案中，固相萃取柱9装填了硅胶颗粒，在进行样品前处理使用前预装填好固相萃取柱9，样品前处理过程中直接使用。

本发明优选的实施方案中，溶剂回流管6内设置三通阀13，可切换溶剂流回烧瓶1或者流出到烧瓶1外，实现样品回流提取和浓缩的切换。

本发明优选的实施方案中，提取装置中所有接口连接处均采用夹紧装置夹紧，接口带有密封环，保证提取装置在使用过程中的密封性，同时保证在泄压阀泄压的压力范围内各接口不会漏气。

本发明中提取净化装置的工作过程如下：

样品分析时，在固相萃取柱9中加入8.0～12.0g硅胶，在样品筒8中装入处理好的样品，在样品上方覆盖一层2.0～3.0g无水硫酸钠(用于除去溶剂及管道内的水分)，将样品筒8与固相萃取柱9密封连接，在烧瓶1中加入回流提取的溶剂40～60ml己烷-乙醇，将固相萃取柱9通过溶剂回流管6与第二接口4密封连接，将隔热导气管5与第一接口3密封连接，将三通转接管7的三个接口分别与样品筒8、密封冷凝管10和隔热导气管5密封连接，密封冷凝管10接通冷凝水，最后将烧瓶1置于水浴锅中85～95℃加热冷凝回流40～50min。样品提取过程中，溶剂回流管6的三通阀13与第二接口4气流导通，挥发的溶剂将固相萃取柱9中所提取的待测样品回流至烧瓶1中，当样品提取完毕后，把三通阀13调整为与外界空气导通的状态，不断挥发的溶剂通过三通阀13流出并回收，此时烧瓶1中的溶液不断被浓缩直至溶剂蒸发完，然后用1ml的乙腈溶解烧瓶中的残留物，溶液经针头过滤器过滤，利用hplc按选定色谱条件测定b[a]p含量。

本发明有益效果：

1、本发明自制一种带有固相萃取功能的索氏提取装置，该装置可在密闭条件下对样品进行分离提纯、浓缩，本发明无需像传统的分离提纯、浓缩需要多次转移、浓缩的操作步骤，大大提高了提取效率。

2、本发明自制的提取装置采用全封闭的冷凝管，有效避免了提取溶剂的挥发损失，大大降低了样品前处理过程对实验室环境造成的污染；并且，密闭冷凝器带有泄压阀，压力过高时可自动泄压，有效避免了可能因压力过高对提取装置造成的损坏。

3、本发明自制的提取装置中在溶剂回流管中设置三通阀，通过切换阀门可直接切换样品回流提取和浓缩，整个操作流程不需要转移样品；本装置中还设计了连接色谱进样瓶接口的圆底烧瓶，样品浓缩完成后，旋下色谱进样瓶即可直接进行分析，避免了常规样品尾管浓缩烧瓶浓缩完后，需用吸管把尾管中溶液取出并洗涤尾管和吸管的步骤。进一步简化了样品前处理操作。

4、本发明方法采用超高效液相色谱技术，12min即可完成一个样品的分析，和常规液相色谱方法相比分离时间大大缩短，大大节约了仪器分析时间。

附图说明

图1是本发明自制提取净化装置的结构示意图；

图中附图标记含义如下：

1-烧瓶，2-螺纹接口，3-第一接口，4-第二接口，5-隔热导气管，6-溶剂回流管，7-三通转接管，8-样品筒，9-固相萃取柱，10-密闭冷凝管，11-泄压阀，12-筛板，13-三通阀，14-硅胶颗粒，15-色谱进样瓶。

具体实施方式

下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不限制本发明。

装置实施例1

自制的提取净化装置的结构如下：

烧瓶1，烧瓶1上设有第一接口3、第二接口4和螺纹接口2，烧瓶1通过第一接口3与隔热导气管5气流导通连接，隔热导气管5另一端与三通转接管7气流导通连接，三通转接管7的另外两个接口分别与密闭冷凝管10和样品筒8气流导通连接，密闭冷凝管10上设有泄压阀11，样品筒8远离三通转接管7的一端设有筛板12并与固相萃取柱9气流导通连接，固相萃取柱9的另一端通过溶剂回流管6与第二接口4气流导通连接，溶剂回流管6内设有三通阀13。

本实施例中，螺纹接口2与色谱进样瓶15可拆卸连接。

本实施例中，隔热导气管5和溶剂回流管6采用软质材料pes；具有一定的伸缩性，方便操作过程中的组装连接。

本实施例中，样品筒8和固相萃取柱9为耐有机溶剂腐蚀的塑料材质，筛板12为塑料筛板，其余部件，例如烧瓶1、三通阀13以及密闭冷凝管10为玻璃材质。

本实施例中，密闭冷凝管10上设有泄压阀11，当加热回流时提取装置中压力过高时可自动泄压，防止压力过高对装置造成破坏。

本实施例中，固相萃取柱9装填了硅胶颗粒，在进行样品前处理使用前预装填好固相萃取柱9，样品前处理过程中直接使用。

本实施例中，溶剂回流管6内设置三通阀13，可切换溶剂流回烧瓶1或者流出到烧瓶1外，实现样品回流提取和浓缩的切换。

本实施例中，提取装置中所有接口连接处均采用夹紧装置夹紧，接口带有密封环，保证提取装置在使用过程中的密封性，同时保证在泄压阀泄压的压力范围内各接口不会漏气。

本实施例中提取净化装置的工作过程如下：

样品分析时，在固相萃取柱9中加入8.0～12.0g硅胶，在样品筒8中装入处理好的样品，在样品上方覆盖一层2.0～3.0g无水硫酸钠(用于除去溶剂及管道内的水分)，将样品筒8与固相萃取柱9密封连接，在烧瓶1中加入回流提取的溶剂40～60ml己烷-乙醇，将固相萃取柱9通过溶剂回流管6与第二接口4密封连接，将隔热导气管5与第一接口3密封连接，将三通转接管7的三个接口分别与样品筒8、密封冷凝管10和隔热导气管5密封连接，密封冷凝管10接通冷凝水，最后将烧瓶1置于水浴锅中85～95℃加热冷凝回流40～50min。样品提取过程中，溶剂回流管6的三通阀13与第二接口4气流导通，挥发的溶剂将固相萃取柱9中所提取的待测样品回流至烧瓶1中，当样品提取完毕后，把三通阀13调整为与外界空气导通的状态，不断挥发的溶剂通过三通阀13流出并回收，此时烧瓶1中的溶液不断被浓缩直至溶剂蒸发完，然后用1ml的乙腈溶解烧瓶中的残留物，溶液经针头过滤器过滤，利用hplc按选定色谱条件测定b[a]p含量。

方法实施例1

(1)标准溶液的配制：准确称取0.1g的苯并[a]芘于100ml容量瓶中，用乙腈定容至浓度为1.0mg/ml标准储备液，并逐级稀释标准储备液得到6级标准工作溶液，分别为：10.0ng/ml、20.0ng/ml、40.0ng/ml、80.0ng/ml、120.0ng/ml、200.0ng/ml，通过hplc分析，以标样峰面积(a)与浓度(c)进行线性回归，得到线性回归方程；

(2)样品前处理：准确量取一份轻度吸烟者尿液样品10ml于50ml锥形瓶中，用0.2mol/l的hcl将尿液样品ph调节到5，并加入0.5mol/l的醋酸缓冲液(ph5.0)1.25ml，随后，再加入60μl的β-葡糖甘酸酶/芳基硫酸酯酶，在37℃的振荡水浴锅中酶解8h，将酶解液浓缩至近干，加入1.0g的硅胶和尿液样品充分研磨均匀，并在烘箱中烘干；

(3)样品提取、浓缩：在固相萃取柱9内填充8.0g硅胶层，然后把样品与硅胶的混合物加入到样品杯8中，再在上面加2.0g的无水硫酸钠；装好样品后，用夹紧装置密封，并在烧瓶1中加入40ml己烷-乙醇的混合溶剂，然后将上述样品提取净化装置放入水浴锅中在85℃下加热回流40min后提取样品。样品提取完后，打开三通阀13，让溶剂从溶剂回收口流出回收溶剂，直至烧瓶1尾管中的样品溶液蒸发至近干，用1ml的乙腈溶解尾管中的残留物，溶液经针头过滤器过滤，利用hplc进行检测；

(4)采用峰面积法进行定量计算，通过样品中苯并[a]芘的峰面积代入线性回归方程计算，即可确定吸烟者尿液样品中的苯并[a]芘含量。

测定结果为：该吸烟者尿液中b[a]p的含量为1.68ng/ml。

方法实施例2

(1)标准溶液的配制：准确称取0.1g的苯并[a]芘于100ml容量瓶中，用乙腈定容至浓度为1.0mg/ml标准储备液，并逐级稀释标准储备液得到6级标准工作溶液，分别为：10.0ng/ml、20.0ng/ml、40.0ng/ml、80.0ng/ml、120.0ng/ml、200.0ng/ml，通过hplc分析，以标样峰面积(a)与浓度(c)进行线性回归，得到线性回归方程；

(2)样品前处理：收集重度吸烟者尿液样品20ml于50ml锥形瓶中，用0.2mol/l的hcl将样品ph调节到5，并加入0.5mol/l的醋酸缓冲液(ph5.0)2.5ml，随后再加入60μl的β-葡糖甘酸酶/芳基硫酸酯酶，在37℃的振荡水浴锅中酶解10h，将酶解液浓缩至近干，加入2.0g的硅胶和样品充分研磨均匀，并在烘箱中烘干；

(3)样品提取、浓缩：在固相萃取柱9内填充10.0g硅胶层，然后把样品与硅胶的混合物加入到样品杯8中，再在上面铺2.5g的无水硫酸钠。装好样品后，用夹紧装置密封，并在烧瓶1中加入50ml己烷-乙醇的混合溶剂，然后将上述样品提取净化装置放入水浴锅中在90℃下加热回流45min后提取样品。样品提取完后，打开三通阀13，让溶剂从溶剂回收口流出回收溶剂，直至烧瓶1中的样品溶液蒸发至近干，用1ml的乙腈溶解尾管中的残留物，溶液经针头过滤器过滤，利用hplc进行检测；

(4)采用峰面积法进行定量计算，通过样品中苯并[a]芘的峰面积代入线性回归方程计算，即可确定吸烟者尿液样品中的苯并[a]芘含量。

测定结果为：该吸烟者尿液中b[a]p的含量为1.96ng/ml。

方法实施例3

(1)标准溶液的配制：准确称取0.1g的苯并[a]芘于100ml容量瓶中，用乙腈定容至浓度为1.0mg/ml标准储备液，并逐级稀释标准储备液得到6级标准工作溶液，分别为：10.0ng/ml、20.0ng/ml、40.0ng/ml、80.0ng/ml、120.0ng/ml、200.0ng/ml，通过hplc分析，以标样峰面积(a)与浓度(c)进行线性回归，得到线性回归方程；

(2)样品前处理：收集电子烟抽吸者的尿液样品30ml于50ml锥形瓶中，用0.2mol/l的hcl将样品ph调节到5，并加入0.5mol/l的醋酸缓冲液(ph5.0)3.75ml，随后再加入60μl的β-葡糖甘酸酶/芳基硫酸酯酶，在37℃的振荡水浴锅中酶解12h，将酶解液浓缩至近干，加入3.0g的硅胶和样品充分研磨均匀，并在烘箱中烘干；

(3)样品提取、浓缩：在固相萃取柱9内填充12.0g硅胶层，然后把样品与硅胶的混合物加入到样品杯8中，再在上面铺3.0g的无水硫酸钠，装好样品后，用夹紧装置密封，并在烧瓶1中加入60ml己烷-乙醇的混合溶剂，然后将上述样品提取净化装置放入水浴锅中在95℃下加热回流50min后提取样品，样品提取完后，打开三通阀13，让溶剂从溶剂回收口流出回收溶剂，直至烧瓶1尾管中的样品溶液增发到近干，用1ml的乙腈溶解尾管中的残留物，溶液经针头过滤器过滤，利用hplc进行检测；

(4)采用峰面积法进行定量计算，通过样品中苯并[a]芘的峰面积代入线性回归方程计算，即可确定吸烟者尿液样品中的苯并[a]芘含量。

测定结果为：该吸烟者尿液中b[a]p的含量为1.73ng/ml。