一种禽流感H5、H7和NP蛋白抗体检测试剂盒及其应用方法与流程

本发明属于免疫学检测
技术领域：
，具体涉及一种禽流感h5、h7和np蛋白抗体检测试剂盒及其应用方法。
背景技术：
：流感病毒(influenzavirus)是一种极为常见的呼吸道病毒，它在病毒分类学上属正粘病毒科(orthomyxoviridae)。它的基因组是分节段的单股负链rna，由于流感病毒膜蛋白(mp)和核蛋白(np)抗原特性及其基因特性的不同，所以流感病毒被分为甲、乙、丙三型。甲型和乙型流感病毒的基因由8个节段组成，丙型流感病毒比甲型和乙型流感病毒少了一个节段，甲型流感病毒又根据其表面血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)蛋白结构和其基因特性可分成许多的亚型。禽流感病毒(avianinfluenzavirus，aiv)属于甲型流感病，根据禽流感病毒致病性和毒力的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感(highpathogenicavianinfluenza，hpai))、低致病性禽流感(lowpathogenicavianinfluenza，lpai)和无致病性禽流感(nopathogenicavianinfluenza，npaiv)。我国长期监测流感病毒证实，在我国家禽和水禽中同时存在多种亚型的禽流感病毒，不同亚型禽流感病毒之间基因重组频繁发生，导致新的病毒株不断产生。高致病性禽流感仅限于h5和h7亚型，它们不仅对全球的经济造成了巨大的影响，还对人类的健康产生了严重的威胁。禽流感的检测技术主要分为分子生物学诊断和血清学诊断技术两大方面。分子生物学诊断技术包括反转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)，依赖核酸序列的扩增(nasba)，核酸分子杂交技术，环介导的等温核酸扩增技术(lamp)，基因芯片(dna微阵列)等。血清学诊断技术包括琼脂凝胶扩散试验(agid)，血凝和血凝抑制试验(ha/hi)，神经氨酸酶抑制试验(nit)，病毒中和试验(vnt)，酶联免疫吸附试验(elisa)，免疫荧光技术(ifa)等。现有elisa试剂盒只能检测一种抗原，无法同时检测多种抗原，其他的蛋白芯片虽然能检测出多种抗原的抗体，但是只能检测一个种属，如果要检测不同种属需要更换不同的二抗，给实验带来不便，因此，如何开发一种不必更换抗体即可检测多个种属并同时检测多种抗原的方法，是有待解决的技术问题。技术实现要素：本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种禽流感h5、h7和np蛋白抗体检测试剂盒。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种禽流感h5、h7和np蛋白抗体检测试剂盒，其包括，单克隆抗体h5-m5、h7-m4和np-m1。作为本发明所述的禽流感h5、h7和np蛋白抗体检测试剂盒的一种优选方案：还包括，aiv-h3n2的np蛋白、aiv-h5n1的ha蛋白、aiv-h7n9的ha蛋白，和/或其包被的蛋白芯片反应板。作为本发明所述的禽流感h5、h7和np蛋白抗体检测试剂盒的一种优选方案：还包括，igg酶标抗体。作为本发明所述的禽流感h5、h7和np蛋白抗体检测试剂盒的一种优选方案：所述igg酶标抗体为辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鼠igg抗体。作为本发明所述的禽流感h5、h7和np蛋白抗体检测试剂盒的一种优选方案：还包括，洗涤液、阳性对照样品、阴性对照样品、化学发光底物。作为本发明所述的禽流感h5、h7和np蛋白抗体检测试剂盒的一种优选方案：所述洗涤液包括tbst洗涤液，所述tbst洗涤液包括含tween-20的tbs，ph为7～7.5。作为本发明所述的禽流感h5、h7和np蛋白抗体检测试剂盒的一种优选方案：所述阳性对照样品为抗aiv-h5及aiv-h7的混合鸡血清，所述阴性对照样品为阴性鸡血清。作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的禽流感h5、h7和np蛋白抗体检测试剂盒的应用方法。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：所述的禽流感h5、h7和np蛋白抗体检测试剂盒的应用方法，其包括，aiv蛋白芯片的制备：aiv-h3n2的np蛋白、aiv-h5n1的ha蛋白、aiv-h7n9的ha蛋白用包被液稀释后，蛋白芯片点样；血清孵育：孵育待测样品及阳性对照样品和阴性对照样品；单抗孵育：孵育所述单克隆抗体；二抗孵育：孵育所述igg酶标抗体；检测：化学发光法检测。作为本发明所述的禽流感h5、h7和np蛋白抗体检测试剂盒的应用方法的一种优选方案：所述aiv蛋白芯片的制备，还包括将所述aiv-h3n2的np蛋白、aiv-h5n1的ha蛋白、aiv-h7n9的ha蛋白溶解在含有30％乙腈水溶液中，点样缓冲液配方包括0.3mpb、0.2％glycerin、0.01％tritonand、1.5％mannitol。作为本发明所述的禽流感h5、h7和np蛋白抗体检测试剂盒的应用方法的一种优选方案：所述孵育，温度均为37℃；所述检测，鸡血清的结果判定为：h5>40％为阳性，h7>40％为阳性，np>50％为阳性；鸭血清的结果判定为：h5>30％为阳性，h7>40％为阳性，np>20％为阳性；孔雀血清的结果判定为：h5>50％为阳性，h7>50％为阳性，np>50％为阳性。本发明的有益效果：本发明蛋白抗体诊断芯片用于快速地确定不同种属动物体内是否存在禽流感病毒np蛋白抗体，且能同时区分禽流感病毒的h5和h7亚型，以达到对禽流感及禽流感的h5、h7亚型进行早期鉴别诊断以及疫情监测的目的，并能检测不同种属，从而为禽流感诊断提供一种新方法。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为蛋白点样浓度(a-c)，抗体稀释倍数(d-f)和血清稀释倍数(g-i)的选择。图2为样本血清孵育时间。图3为检测临界值的确定。图4为蛋白芯片方法的特异性。图5为蛋白芯片方法的敏感性。图6单克隆抗体的筛选。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。本发明用于禽流感抗体检测且能同时用于流感亚型鉴定的试剂盒，为临床禽流感病毒(avianinfluenzavirus，aiv)的诊断、分类以及抗体水平的检测提供经济实用可靠的检测工具。所述试剂盒包括：(1)用重组表达的aiv-h3n2的np蛋白，aiv-h5n1的ha蛋白以及aiv-h7n9的ha蛋白制备的蛋白芯片反应板，五块(negative为不含蛋白的点样稀释缓冲液)；点样表：h5h5h7h7npnpnegative(2)抗体稀释液稀释的针对上诉蛋白的三种单克隆抗体混合溶液，体积30ml。(3)抗体稀释液稀释的igg酶标抗体溶液，体积30ml。所述酶标抗体为辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鼠igg抗体；(4)10×tbst浓缩洗涤液：含0.5％tween-20的tbs，ph7.4，体积100ml；(5)阳性对照样品：抗aiv-h5及aiv-h7的混合鸡血清，体积1ml；(6)阴性对照样品：阴性spf鸡血清，体积1ml；(7)底物化学发光，a液b液各体积4ml；本发明所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：(1)aiv蛋白芯片的制备：重组的aiv-np蛋白，h5n1-ha蛋白h7n9-ha蛋白经bca蛋白检测试剂盒(bcaproteinassaykit)测定浓度后，用包被液(0.01mph＝7.4的pbs缓冲液)将其稀释到终浓度为1mg/ml，-20℃保存备用；蛋白芯片点样，点样蛋白浓度是0.2mg/ml或0.05mg/ml，制备48孔点样板。真空干燥包装，4℃保存备用。(2)蛋白芯片的润洗：用洗涤液(使用是稀释到1×)润洗3次后，弃掉洗涤液；(3)血清孵育：加入60μl/孔用1×tbst以32倍稀释的待检血清，并设置阳性和阴性血清对照，同时设置未加血清的tbst阴性作为阴性参照，37℃，500rpm，震荡孵育30min，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；(4)单抗孵育：每孔加入100μl用抗体稀释液稀释好的三种单克隆抗体的混合液，37℃，500rpm，震荡孵育30min，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；(5)二抗孵育：每孔加入100μl用二抗稀释液稀释10000倍的hrp标记的羊抗鼠igg二抗，37℃，500rpm，震荡孵育30min，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；(6)化学发光：a液+b液各0.5ml，混合至1ml，每孔加入15μl发光液，利用amershamimager600超灵敏多功能成像仪采集发光信号，显色。(7)结果判定：利用genepixpro6.0软件采集每个点的化学发光强度，并计算其阻断率。阻断率的计算公式为：阻断率＝1-(待测样品化学发光强度-同孔negative发光强度)/(阴性血清化学发光强度-同孔negative发光强度)×100％。鸡血清的结果判定：h5>40％为阳性，h7>40％为阳性，np>50％为阳性。鸭血清的结果判定：h5>30％为阳性，h7>40％为阳性，np>20％为阳性。孔雀血清的结果判定：h5>50％为阳性，h7>50％为阳性，np>50％为阳性。每孔各种抗原有两个重复点，如两个点计算结果不一致，判为可疑，需重复一次实验再判断结果。实施例1：抗原的制备：将本研究室前期构建的原核表达载体pet-32a-h3n2-np、pcoldi-h5-ha、pcoldi-h7-ha转化到表达宿主菌e.colibl21(de3)中，经lb液体培养基活化，按1：100转接于含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中37℃大量培养扩繁。当菌液的od600nm达到0.6时，加入终浓度为1mm的iptg16℃诱导表达10h，4℃、10000rpm离心10min收集菌体，按照六联组氨酸标记蛋白纯化手册纯化三种目的蛋白。洗脱后获得的蛋白取样进行sds-page分析。纯化的三种重组蛋白h3n2-np、h5-ha、h7-ha分子量大小分别为73kd、36kd、36kd，具有很高的纯度。纯化的蛋白保存在-20℃备用。实施例2：阴阳性血清的制备和筛选实验室已制备的单因子阳性血清包括：h1，h2，h3，h4，h5，h6，h7，h8，h9，h11，h12，h13，h14，ibv，ndv，ibdv，alv。54份阴性鸡血清样品采于2月龄的spf鸡，10份阴性鸭血清来源于未免疫的鸭，分离出的血清用idexx禽流感抗体检测试剂盒检测可确定为阴性的鸡血清和鸭血清；临床血清的筛选用idexx的禽流感抗体检测试剂盒检测临床血清。具体做法完全按照试剂盒操作说明书进行，55份临床血清都为aiv阳性。实施例3：aiv蛋白芯片检测条件的优化1.aiv蛋白芯片反应的基本程序(1)蛋白芯片的制备：在十万级洁净的房间进行蛋白微阵点样。三种蛋白分别按1mg/ml的量溶解在含有30％乙腈水溶液中，然后用点样缓冲液(0.3mpb，0.2％glycerin，0.01％tritonand1.5％mannitol)稀释抗原至工作浓度，点样到ipdms(initiatorintegratedpoly(dimethylsiloxane))常规膜。制备48孔蛋白芯片。真空干燥包装，4℃保存备用；(2)蛋白芯片板从4℃取出放置室温，用洗涤液润洗3次；(3)血清孵育：加入60μl/孔用1×洗涤液以1：32倍稀释的待检血清，并设置阳性和阴性对照，同时设置未加血清的tbst阴性作为阴性参照，37℃、500rpm、震荡孵育30min，洗涤液洗板3次；(4)单克隆抗体抗孵育：每孔加入100μl用二抗稀释液稀释三种分别针对不同三种蛋白的单克隆抗体的混合液，37℃、500rpm、震荡孵育30min，洗涤液洗板3次；(5)二抗孵育：每孔加入100μl用二抗稀释液稀释10000倍的hrp标记的羊抗鼠igg二抗，37℃、500rpm、震荡孵育30min，洗涤液洗板3次；(6)化学发光：a液+b液各0.5ml，混合至1ml，每孔加入15μl发光液，利用amershamimager600超灵敏多功能成像仪采集发光信号，显色；(7)结果判定：利用genepixpro6.0软件采集每个点的化学发光强度，并计算其阻断率。阻断率的计算公式为：阻断率＝1-(待测样品化学发光强度-同孔negative发光强度)/(阴性血清化学发光强度-同孔negative照发光强度)×100％。鸡血清的结果判定：h5>40％为阳性，h7>40％为阳性，np>50％为阳性。鸭血清的结果判定：h5>30％为阳性，h7>40％为阳性，np>20％为阳性。孔雀血清的结果判定：h5>50％为阳性，h7>50％为阳性，np>50％为阳性。每孔各种抗原有两个重复点，如两个点计算结果不一致，判为可疑，需重复一次实验再判断结果。2.aiv蛋白芯片反应条件的优化以上述的基本程序为基础，对aiv蛋白芯片的反应条件进行优化。(1)蛋白点样浓度、抗体稀释倍数和血清稀释倍数的选择将h5、h7、np三种抗原分别进行两倍连续稀释，确定最佳的抗原的工作浓度，之后，将单克隆抗体抗体分别进行2倍连续稀释，确定抗体的最佳工作浓度。样本检测的稀释倍数：将已确定的阳性和阴性血清进行2倍连续的稀释，得到阴性与阳性血清的阻断率。(2)样本血清孵育时间同一样本血清用不同的时间进行孵育，最后计算取得阻断率，确定血清的最佳孵育时间。因此，最终确定的最佳反应条件为：h5、h7、np三种抗原包被浓度分别为0.2mg/ml、0.2mg/ml、0.05mg/ml，h5、h7、np三种单克隆抗体的稀释倍数分别为1：2000、1：2000、1：320000，待检血清最佳稀释倍数为1：32(图1)，如图2，蛋白芯片样本血清孵育时间为30min。实施例4：蛋白芯片检测临界值的确定：用优化的蛋白芯片反应体系对经idexx公司的aiv试剂盒检测过的54份spf鸡阴性血清样本和10份鸭阴性血清样本进行检测，并利用genepixpro6.0软件对结果进行分析，分别计算各份阴性血清的阻断率，找到蛋白芯片检测的临界值，以此作为蛋白芯片检测方法阴、阳性判定的临界标准，临界值计算公式为：临界值＝阴性血清平均值+2倍阴性血清标准差。64份阴性血清样品的蛋白芯片检测结果如图3。鸡血清的结果判定：h5>40％为阳性，h7>40％为阳性，np>40％为阳性。鸭血清的结果判定：h5>0％为阳性，h7>40％为阳性，np>20％为阳性。由于鸭的h5-ha抗原蛋白芯片的阴性血清阻断率都为0，所以计算的临界值也为0，我们也无阴性的孔雀血清，所以我们引用了另外一个公式：临界值＝阳性血清平均值/2，最后鸭血清的结果判定：h5>30％为阳性，孔雀血清的结果判定：h5>50％为阳性，h7>50％为阳性，np>50％为阳性。实施例5：重复性试验1.批内重复性试验用同一批次纯化的蛋白制备的蛋白芯片分别检测4份阳性血清和4份阴性血清，重复试验2次，分别计算每个样品的阻断率，确定蛋白芯片同批抗原的检测结果是否一致。如果两次检测结果与hi实验结果相符合，表明抗原的批内重复性较好。表1同一批抗原批内重复性2.批间重复性试验用不同批次纯化的蛋白制备蛋白芯片，对上述4份阳性血清和4份阴性血清进行2次重复试验，分别计算每个样品的阻断率，确定蛋白芯片不同批次抗原的检测结果是否一致，不同批次抗原检测的4份血清和4份阴性血清的结果与hi实验结果相符合，表明抗原的批间重复性好。表2不同批抗原批间重复性实施例6：蛋白芯片方法的特异性分别将鸡新城疫病毒(ndv)阳性血清，鸡白血病病毒(alv)阳性血清，禽流感病毒(aiv)阳性血清和传染性法氏囊病毒(ibdv)阳性血清作最佳稀释(1:32)，进行蛋白芯片检测，以此确定蛋白芯片的特异性。检测结果显示除禽流感的其他禽病血清的np蛋白阻断率均小于其临界值，结果均为阴性，h5和h7只有其对应的h5和h7亚型阳性血清阻断率大于40％，其他都为阴性。表明蛋白芯片与上述血清不存在交叉反应，具有良好的特异性(如图4)。实施例7：蛋白芯片方法的敏感性h5和h7标准阳性血清分别以两倍连续稀释法稀释。对稀释后的血清进行hi滴度检测，与蛋白微阵列孵育。抑制率随血清稀释量而变化，如图所示，h5血清孵育蛋白芯片后对h5和np的最低检测线分别为1hi滴度和0.5hi滴度，h7血清孵育蛋白芯片后对h7和np的最低检测线分别为1hi滴度和0.5hi滴度。实施例8：蛋白芯片试剂盒有效性验证取55份临床鸡血清样品，分别用hi方法，进口aivelisa试剂盒(美国idexx公司生产)和蛋白芯片方法平行检测，比较蛋白芯片与aivelisa和hi的敏感性、特异性和符合率。进口aivelisa试剂盒检测方法参照其说明书进行。与aivelisa和hi实验比较结果表明，蛋白芯片h5和np的诊断灵敏度和诊断特异性均为100％，h7的诊断灵敏度和诊断特异性分别为100％和97.06％(如表3)。取鸭临床血清20份和孔雀临床血清20份孵育于蛋白芯片，并用hi实验作为对照，如表4，孔雀血清的蛋白芯片结果与hi结果完全符合，鸭血清的蛋白芯片的结果与hi符合率为90％。以上数据表明，该蛋白芯片对aiv抗体检测的特异性和敏感性较hi试验良好，可以替代hi试验检测流感抗体。表3诊断灵敏度和诊断特异性以aivelisa试剂盒和hi检测为金标准，对55份临床鸡血清样品进行蛋白芯片检测，鉴定其诊断敏感性和诊断特异性。atp，阳性；fn，假阴性；灵敏度＝tp/(tp+fn)×100％。btn，阴性；fp，假阳性；特异性＝tn/(tn+fp)×100％。表4孔雀及鸭血清检测结果实施例9：对针对h5、h7和np蛋白的单抗进行筛选，筛选出具有阻断作用且与其他蛋白无交叉反应的单克隆抗体，作为本发明单克隆抗体的组合。本发明筛选单克隆抗体(剑药生物科技有限公司购买)包括：h5-m1、h5-m2、h5-m3、h5-m4、h5-m5、h5-m6、h7-m1、h7-m2、h7-m3、h7-m4、np-m1、np-m2、np-m3。结果显示，见图6a：单抗h5-m1、单抗h5-m2、单抗h5-m3、单抗h5-m4与h5-ha1不反应，无法实现检测。单抗h5-m6与h5-ha反应，但易与其他蛋白发生交叉反应，阻断作用不明显，特异性不高，达不到检测需求。对4株h7单抗的筛选：h7-m1、h7-m2、h7-m3、h7-m4。结果显示，见图6b。对np单抗的进行筛选，见图6c：np-m1、np-m2、np-m3。结果显示：np-m1有阻断作用且不与h5和h7蛋白发生交叉反应。h5-m5、h7-m4和np-m1三种抗体组合，相互之间不发生交叉反应，特异性强，阻断作用明显，检测灵敏度高。综上，本发明蛋白抗体诊断芯片用于快速地确定不同种属动物体内是否存在禽流感病毒np蛋白抗体，且能同时区分禽流感病毒的h5和h7亚型，以达到对禽流感及禽流感的h5、h7亚型进行早期鉴别诊断以及疫情监测的目的，并能检测不同种属，从而为禽流感诊断提供一种新方法。本发明范围广谱，即能针对所有禽流感亚型的np蛋白抗体，又能同时检测出是否为h5或h7亚型抗体。本发明利用的是阻断法，可以检测不同种属的动物体内的禽流感病毒np蛋白抗体的情况。检测敏感性高、特异性和重复性好。本发明以三种蛋白作为抗原，分别为aiv-h3n2的np蛋白，aiv-h5n1的ha蛋白以及aiv-h7n9的ha蛋白，此方法不仅可在检测出禽流感抗体的同时区分其是否为h5或h7的抗体，而且可用于不同种属的易感动物，其可提供具有与进口商品化试剂盒和hi实验高符合率的特性，检测更加快速、敏感性高、操作简便。为临床上aiv大规模抗体监测、流行病学调查以及aiv的防控提供了一种新的有效的检测手段。应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12