荧光免疫层析检测方法及其试纸和应用与流程

本发明涉及一种组合物，尤其涉及一种用于荧光检测试剂的组合物，以提高试剂对抗体检测的精密度及准确性。

背景技术：

荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒和致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗体夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗体夹心的“三明治”型。对于只具有单一抗原表位的小分子抗原(农兽药、违禁药物等)，待测小分子抗原与荧光标记抗体结合后，由于空间位阻作用难以再与检测线上的包被抗体结合。所以，具有单一抗原表位的小分子待测物多采用竞争免疫层析法检测。

普通试纸条结构从一端到另一端依次为：吸水纸、nc膜、荧光垫和样品垫，样本加入样本垫后，受毛细现象的驱动朝向吸水纸方向移动而发生层析，然后样本与附着于荧光垫上的标记微球相结合，并继续层析，依次与固定在nc膜上的检测线(也称t线)和质控线(也称c线)反应。当样本中存在待测物质时，结合荧光微球的待测物质被固定于t线，通过检测荧光信号及其强弱，实现对待测物质的定性或定量。此种一次加样的单向层析(即“一步法”)对检测干扰较多，尤其采用间接法实施的一步反应中，样本(如：血液)携带的同类检测抗体(如：igg抗体)都可能与微球结合从而干扰结果。

专利cn200980117868.7公开了一种积累时间的分辨发射双向凝胶电泳，利用荧光寿命成像的差异来区分来自特异性蛋白质标记的荧光和非特异性背景荧光，致使与现有技术相比在灵敏度和动态范围方面均有明显的改进。用脉冲激光扫描仪激发与蛋白质结合的荧光染料以便提供逐个像素水平上的用于蛋白质的胶内检测和定量的荧光寿命成像测定，和利用荧光衰减曲线的多指数拟合来分离来源于荧光染料标记的蛋白质种类的荧光、来源于凝胶基质本身、溶液或存在于凝胶中的微粒的来源的荧光，或来源于散射效应的荧光，用于随后的背景减除。

专利cn201810206451.9公开了一种免疫荧光层析试纸，灵敏度高、重复性好，其包括依序搭接在pvc底板上的样品垫、标记垫、层析条和吸水纸。其中，层析条以反蛋白石结构硝酸纤维素光子晶体薄膜为固相载体。本申请的免疫荧光层析试纸，采用反蛋白石结构硝酸纤维素光子晶体薄膜替换传统的硝酸纤维素膜，不仅提高了免疫荧光层析试纸的检测灵敏度，同时也能降低假阳性和假阴性等非特异性结合，而且，有效降低了背景信号干扰，提高了信噪比和分辨率，缩短了反应时间，还可较大的降低捕获抗体包被浓度。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种荧光免疫层析检测方法，用于荧光层析，避免样本中同类抗体对检测结果的干扰，以利于提高检测的准确性。

本发明的另一个目的在于提供一种荧光免疫层析检测试纸，避免样本中同类抗体对检测结果的干扰，以利于提高检测的准确性。

本发明的再一个目的在于提供一种荧光免疫层析检测试纸在制备乙肝表面抗体检测试剂中的应用。

一种荧光免疫层析检测方法，同时将待测的样本液和样本稀释液分别加入样本垫和稀释垫，在毛细作用下，样本液向t线层析，待检物与t线结合。在液体扩散作用下，样本液及稀释液对处于样本垫和荧光垫之间的速溶膜进行溶解后，使得稀释液携带的荧光微球共同朝向t线层析，并与t线处的待检物相结合，最后获取t线处的荧光值，作为样本检测的依据。

本发明的荧光免疫层析检测方法，加入样本液和稀释液后，绝大部分的样本液朝向t线层析，并使得待检物先固定于t线处，还由于液体扩散的作用下，小部分样本液和稀释液将速溶膜润湿并溶解，而使得稀释液带动荧光垫中的荧光微球朝向t线层析，并与固定在t线处的待检物结合。形成样本液先接触t线，携带荧光微球的稀释液后接触t线的检测形式。让待检物先与t线结合，可以将大量无关成分去除(即未能固定在t线处的物质继续层析，朝向吸水纸移动)，还由于荧光微球在朝向t线的层析过程中受到稀释液的清洗作用，进一步减少了干扰因素，使得于t线处结合时，干扰物质大大降低。

为了实施本发明的荧光免疫层析检测方法，还提供一种荧光免疫层析检测试纸，包括稀释垫和吸水纸，分别置于检测试纸的两端，由稀释垫至吸水纸的方向上，还依次设置荧光垫、速溶膜、样本垫和硝酸纤维素膜(也称nc膜)，并在nc膜上设置t线和c线。

在样本垫和稀释垫之间使用速溶膜，利用膜的物理隔离作用，将稀释液和样本液相隔离，使得绝大部分的样本液先于稀释液朝向t线层析。待速溶膜被溶解后，稀释液朝向t线层析的通道打开，而处于样本液之后与t线上待检物结合。

一种用于荧光免疫层析检测试纸的速溶膜实施方式，其采用聚乙二醇(peg)，分子量为2,000da～6,000da，优先选择由分子量为2,000da和4,000da的peg按重量比1.7∶1混合制得，以达到合适的溶解速度，即利于样本液和稀释液对速溶膜的溶解，也利于稀释液带动荧光微球朝向t线层析。

另一种用于荧光免疫层析检测试纸的速溶膜实施方式，其采用聚乙烯醇(pva)或可溶性淀粉。

本发明提供的荧光免疫层析检测试纸，样本垫采用的材料为玻璃纤维，其单位重量75g/m²，厚度0.43mm，层析速度5s/2cm，以及蓄水量79mg/cm²。

本发明提供的荧光免疫层析检测试纸，稀释垫采用的材料为玻璃纤维，其单位重量75g/m²，厚度0.43mm，层析速度5s/2cm，以及蓄水量79mg/cm²。

本发明提供的荧光免疫层析检测试纸，荧光垫采用的材料为玻璃纤维，其单位重量75g/m²，厚度0.38mm，层析速度3s/2cm，蓄水量63mg/cm²。

经验证，采用本发明的检测方法和试纸，在乙肝表面抗体检测中所得的结果表明，t/c的变异系数(cv)显著降低，干扰因素得到控制，显著提高了荧光层析检测的准确性，与市售的试纸条使用方法一致。

一种荧光免疫层析试剂盒，包括本发明提供的各种检测试纸。

附图说明

图1为本发明用于荧光免疫层析检测试纸一实施例的示意图。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1

图1为荧光免疫层析检测试纸，包括稀释垫600和吸水纸100，分别置于检测试纸的两端，由稀释垫600至吸水纸100的方向上，还依次设置荧光垫500、速溶膜400、样本垫300和nc膜200，并在nc膜200上设置t线210和c线220，以及荧光微球(未示出)置于荧光垫500上。

使用时，将样本液加于样本垫300上，稀释液加于稀释垫600上。加入样本液后，一方面样本液在朝向t线210层析过程中，其中的待测物质被固定于t线210处。另一方面，还由于液体扩散的作用下，小部分的样本液和稀释液将速溶膜400润湿并溶解，而使得稀释液带动荧光垫500中的荧光微球朝向t线210层析，并与固定在t线处的待测物质结合。

经实践，可应用peg、pva和可溶性淀粉制成速溶膜，peg分子量为2,000da～6,000da。采用分子量为2,000da和4,000da的peg按重量比1.7∶1混合制得的速溶膜，即利于样本液对速溶膜的溶解，也利于稀释液带动荧光微球朝向t线层析。

为了调节速溶膜溶解过程中，携带荧光微球的稀释液的层析速度，利于样本垫对速溶膜的溶解。样本垫和稀释垫均采用单位重量75g/m²，厚度0.43mm，层析速度5s/2cm，以及蓄水量79mg/cm²的玻璃纤维。荧光垫采用单位重量75g/m²，厚度0.38mm，层析速度3s/2cm，蓄水量63mg/cm²的玻璃纤维。

实施例2

分别将市售试纸条和本实施例的试纸条用于检测浓度为20miu的低浓度乙肝表面抗体阳性血清样本，其具体检测结果详见表1。

表1

实施例3

分别将市售试纸条和本实施例的试纸条用于检测浓度为50miu的低浓度乙肝表面抗体阳性血清样本，其具体检测结果详见表2。

表2