一种马尾松树脂道石蜡切片的制备方法与流程

本发明涉及一种马尾松，尤其涉及一种马尾松脂道石蜡切片的制备方法，属于石蜡切片制备方法技术领域。

背景技术：

马尾松(pinusmassonianalamb)属于松科(pinaceae)、松属(pinus)，裸子植物，常绿乔木广泛分布于湖南、贵州及广西等17个省、自治区、直辖市，是针叶树种中利用程度及经济效益都非常高的优势树种，更是主要的采脂树种。松属树种分泌的化学防御物质-松脂是由萜类物质组成的混合物，呈透明、无色粘液状，储藏在树脂道中，主要含松节油和松香，广泛应用于香料、医药、机械、造纸、油墨等众多行业，是我国重要的工业原料及可再生环保资源。树脂道与松脂产量紧密相关，由于市场对松脂资源的需求日益增长，为了提高松脂的产量，从解剖结构上阐明马尾松高产脂树脂道结构特征，具有重要意义。

石蜡切片是植物组织结构学研究中的重要技术手段，其传统制作步骤包括样品的取材、固定、脱水、透明、浸蜡、渗蜡、包埋、切片、粘片、展片、脱蜡、番红染色、复水、固绿染色、封片等一系列操作。整个过程步骤多而复杂，很难制作出完整清晰的马尾松树脂道组织结构的切片，目前，尚未有使用软化剂hf来克服现有马尾松树脂道切片技术的不足。马尾松茎段与针叶材质较硬，细胞壁厚，需观察的树脂道结构也是由1-2层厚壁细胞围绕而成，因此，亟需对传统的石蜡切片方法进行改进，建立一种适合于马尾松坚硬树脂道显微结构观察的石蜡切片方法，从解剖结构上阐明马尾松高产脂的形成机制，为优异种质的早期选择和定向培育提供理论参考。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：提供一种马尾松树脂道石蜡切片的制备方法，本发明克服现有技术的不足，针对马尾松茎段与针叶材质硬、组织细胞壁厚，树脂道结构均由厚壁细胞围绕，切片不完整、不清晰等问题，它是一种易于观察并适合马尾松树脂道石蜡切片的制备方法，解决了传统石蜡切片在硬度较高的材料中，切片易破、易碎等问题。

本发明的技术方案为：一种马尾松树脂道石蜡切片的制备方法，所述方法步骤包括：一、取材及固定；二、软化；三、脱水、透明及浸蜡；四、渗蜡与包埋；五、切片、粘片及展片；六、脱蜡、番红染色及复水；七、固绿染色及封片，所述步骤二软化包括：将步骤一固定后的马尾松针叶与茎段依次放入装有软化剂hf的离心管中，茎段软化时间为200-280h，针叶软化时间为90-140h。

所述步骤一为：选取长势一致，生长健壮的马尾松无性系枝条，将每条枝条截取为2cm茎段，并将采集的针叶束剪去顶部1/3和基部1/3，留取针叶中部1/3，用蒸馏水洗净后放入配好的faa固定液中，进行抽真空处理，使固定液完全浸入样品中，固定48h以上，并在4℃下保存。

所述步骤三为：将步骤二中软化后的马尾松针叶与茎段，先用70％乙醇冲洗2-3次后，放入70％乙醇溶液中脱水3次，每次处理2h，样品可在第三次脱水的70％乙醇溶液中长久放置保存；次日，将取出样品依次放入85％乙醇、95％乙醇继续进行每梯度各2h脱水，再放入100％乙醇溶液进行2次各50min脱水；脱水结束后，将样品放入体积比为1:1，且已加入0.5g番红的100％乙醇和二甲苯混合溶液中浸泡2h；再将样品放入纯二甲苯浸泡2h，期间每小时换一次纯二甲苯；最后将浸泡在纯二甲苯中的样品取出，放入体积比为1:1的纯二甲苯溶液和石蜡屑中，并再放置到温度40℃的恒温箱中过夜。

所述步骤四为：将步骤三中的样品放置在60℃恒温箱中，并分4次换样品中的纯石蜡溶液，第一次换的时间间隔为4h，第二次、第三次、第四次纯石蜡溶液间隔时间为2h，在最后一次换石蜡溶液的样品中间隔两小时后，将样品从石蜡溶液中取出并进行包埋。

所述步骤五为：将步骤四所得的蜡块修整为正梯形后，放置在切片机上进行切片，切片厚度为8μm，将切好的蜡带轻放到涂有粘贴液的载玻片上，然后将载玻片放置40℃烘片机上烘40min后，最后将含有蜡带的载玻片放入40℃恒温箱直到蜡带展开。

所述步骤六为：将步骤五所得的烘干切片放入二甲苯溶液30-50min，取出后再放入新的二甲苯溶液30min脱蜡，之后将切片依次放入体积比1:1的二甲苯和100％乙醇混合溶液、100％乙醇溶液、100％乙醇溶液、95％乙醇溶液、85％乙醇溶液、70％乙醇溶液、50％乙醇溶液中，间隔时间均为3min，最后将切片放入1％番红溶液中染色，染色时间大于12h。

所述步骤七为：将步骤六中染色后的切片，依次放入50％乙醇溶液、70％乙醇溶液、85％乙醇溶液、95％乙醇溶液、1％固绿溶液、95％乙醇溶液、100％乙醇溶液、100％乙醇溶液、体积比1:1的二甲苯和100％乙醇混合溶液、二甲苯溶液、二甲苯溶液中，切片浸泡在50％乙醇溶液、1％固绿溶液中时间均为10-20s，其他溶液的间隔时间均为2min，最后将浸泡在二甲苯溶液中的切片取出，并在载玻片上滴1滴中性树胶，由同一侧轻放盖玻片，将封好的片放置常温下晾干，即为永久切片。

所述步骤一中的faa固定液为体积比为5：5：90的甲醛、乙酸和70%乙醇的混合液。

所述步骤五中的粘贴液包括甲液与乙液，甲液组分为：1.5g明胶、100ml蒸馏水、15ml甘油和2g苯酚；乙液组分为：4ml甲醛和100ml蒸馏水，使用时，分别先滴1滴甲液再滴1滴乙液于载玻片上，并用牙签将载玻片上的混合液均匀展开，以能保证蜡带粘贴的牢固。

本发明的有益效果是：与现有技术相比，采用本发明的技术方案，比传统石蜡切片更高效，制作的切片组织结构清晰完整、细胞界限清楚，易于观察，取得了很好的使用效果。

附图说明

图1为本发明实施例1的马尾松茎段木质部树脂道组织切片显微照片；

图2为本发明实施例1的马尾松针叶树脂道组织切片的显微照片。

图中：r为树脂道；x为木质部；p为髓。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将参照本说明书附图对本发明作进一步的详细描述。

实施例1：如附图1、2所示，一种马尾松树脂道石蜡切片的制备方法，所述方法步骤包括：一、取材及固定；二、软化；三、脱水、透明及浸蜡；四、渗蜡与包埋；五、切片、粘片及展片；六、脱蜡、番红染色及复水；七、固绿染色及封片，所述步骤二软化包括：将步骤一固定后的马尾松针叶与茎段依次放入装有软化剂hf的离心管中，茎段软化时间为200-280h，针叶软化时间为90-140h。将固定后的马尾松针叶与茎段依次放入装有软化剂hf的15ml离心管中，茎段材质比针叶硬，树脂道细胞的细胞壁厚。因此。茎段软化最佳时间为10天，针叶时间为5天。这比传统的切片方法对马尾松树脂道切片的组织结构更加完整。

所述步骤一为：选取长势一致，生长健壮的马尾松无性系枝条，将每条枝条截取为2cm茎段，并将采集的针叶束剪去顶部1/3和基部1/3，留取针叶中部1/3，用蒸馏水洗净后放入配好的faa固定液中，进行抽真空处理，使固定液完全浸入样品中，固定48h以上，并在4℃下保存。

所述步骤三为：将步骤二中软化后的马尾松针叶与茎段，先用70％乙醇冲洗2-3次后，放入70％乙醇溶液中脱水3次，每次处理2h，样品可在第三次脱水的70％乙醇溶液中长久放置保存；次日，将取出样品依次放入85％乙醇、95％乙醇继续进行每梯度各2h脱水，再放入100％乙醇溶液进行2次各50min脱水；脱水结束后，将样品放入体积比为1:1，且已加入0.5g番红的100％乙醇和二甲苯混合溶液中浸泡2h；再将样品放入纯二甲苯浸泡2h，期间每小时换一次纯二甲苯；最后将浸泡在纯二甲苯中的样品取出，放入体积比为1:1的纯二甲苯溶液和石蜡屑中，并再放置到温度40℃的恒温箱中过夜。

所述步骤四为：将步骤三中的样品放置在60℃恒温箱中，并分4次换样品中的纯石蜡溶液，第一次换的时间间隔为4h，第二次、第三次、第四次纯石蜡溶液间隔时间为2h，在最后一次换石蜡溶液的样品中间隔两小时后，将样品从石蜡溶液中取出并进行包埋。

所述步骤五为：将步骤四所得的蜡块修整为正梯形后，放置在切片机上进行切片，切片厚度为8μm，将切好的蜡带轻放到涂有粘贴液的载玻片上，然后将载玻片放置40℃烘片机上烘40min后，最后将含有蜡带的载玻片放入40℃恒温箱直到蜡带展开。一般需12h以上。粘贴液包括甲液与乙液，甲液（组分包括：1.5g明胶，100ml蒸馏水，15ml甘油，2g苯酚）；乙液（组分包括：4ml甲醛，100ml蒸馏水）。

所述步骤六为：将步骤五所得的烘干切片放入二甲苯溶液30-50min，取出后再放入新的二甲苯溶液30min脱蜡，之后将切片依次放入体积比1:1的二甲苯和100％乙醇混合溶液、100％乙醇溶液、100％乙醇溶液、95％乙醇溶液、85％乙醇溶液、70％乙醇溶液、50％乙醇溶液中，间隔时间均为3min，最后将切片放入1％番红溶液中染色，染色时间大于12h。1％番红溶液组分包括：100ml50％乙醇溶液，1g番红。

所述步骤七为：将步骤六中染色后的切片，依次放入50％乙醇溶液、70％乙醇溶液、85％乙醇溶液、95％乙醇溶液、1％固绿溶液、95％乙醇溶液、100％乙醇溶液、100％乙醇溶液、体积比1:1的二甲苯和100％乙醇混合溶液、二甲苯溶液、二甲苯溶液中，切片浸泡在50％乙醇溶液、1％固绿溶液中时间均为10-20s，其他溶液的间隔时间均为2min，最后将浸泡在二甲苯溶液中的切片取出，并在载玻片上滴1滴中性树胶，由同一侧轻放盖玻片，将封好的片放置常温下晾干，即为永久切片。1％固绿溶液组分包括：100ml95％乙醇溶液，1g固绿。

所述步骤一中的faa固定液为体积比为5：5：90的甲醛、乙酸和70%乙醇的混合液。

所述步骤五中的粘贴液包括甲液与乙液，甲液组分为：1.5g明胶、100ml蒸馏水、15ml甘油和2g苯酚；乙液组分为：4ml甲醛和100ml蒸馏水，使用时，分别先滴1滴甲液再滴1滴乙液于载玻片上，并用牙签将载玻片上的混合液均匀展开，以能保证蜡带粘贴的牢固。

显微观察，可采用olympusbx53显微镜观察切片。

参阅图1、图2、是本发明实施例的马尾松针叶与木质部树脂道的组织切片；可见本方法能够得到组织结构完整、清晰的、细胞界限清楚、美观的马尾松树脂道石蜡切片，用本方法制作马尾松树脂道石蜡切片比传统的石蜡切片技术更适合、效率更高。

本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。