基于PCK1调节的脂质代谢作为癌症治疗、诊断和预后预测之靶标的应用的制作方法

本发明属于肿瘤医学的技术领域，涉及基于pck1调节的脂质代谢作为癌症治疗、诊断和预后预测之靶标的应用。

背景技术：

代谢的重新编程是癌症生物学的新兴标志。例如，癌细胞主要通过糖酵解而不是氧化磷酸化获得能量。癌细胞的这种特征被称为“warburg效应”。作为糖酵解的逆过程，糖异生是指从非糖酵解前体向葡萄糖的转化。磷酸烯醇丙酮酸(pep)羧激酶1(pck1)将草酰乙酸和gtp转化为pep和co2，是糖异生的限速酶。由于其对糖酵解的抑制作用而被认为是肿瘤抑制因子。

技术实现要素：

本发明的目的在于对糖异生酶pck1在人癌症中肿瘤发生发展的机制进行分析，利用pck1的蛋白激酶活性在srebp1激活、脂肪形成和hcc发展中的作用，提出了基于pck1调节的脂质代谢作为癌症治疗、诊断和预后预测之靶标的应用。

本发明是采用以下的技术方案实现的：

本发明提供了一种基于pck1调节的脂质代谢作为癌症治疗、诊断之靶标的应用，所述应用包括：

(1)确定检测患者癌细胞中包含：与参考水平相比升高的pck1s90位点磷酸化水平、升高的insig1s207/insig2s151位点磷酸化水平或srebp的核积累和激活；以及

(2)用抑制方法阻断pck1蛋白激酶活性激活、pck1s90位点磷酸化、insig1s207/insig2s151位点磷酸化、srebp的核积累和激活中的一种或两种以上状态；和/或

(3)预测患者对治疗方法的有利响应；

所述参考水平是来自非癌细胞或早期癌细胞的水平。

优选地，所述癌症是口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸系统癌症、泌尿生殖系统癌症、胃肠癌、中枢或周围神经系统组织癌、内分泌或神经内分泌系统癌症或造血系统癌症、胶质瘤、肉瘤、上皮癌、淋巴瘤、黑素瘤、纤维瘤、脑脊膜瘤、脑癌、肾癌、胆道系统癌症、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、利-弗劳梅尼瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体瘤、肾上腺瘤、骨源性肉瘤肿瘤、神经内分泌系统肿瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。

优选地，所述确定方法包括使用磷酸化特异性抗体，进行elisa、免疫测定、放射免疫测定、免疫组织化学、免疫放射测定、荧光免疫测定、凝胶电泳、免疫印迹分析、原位杂交、流式细胞术或显微测定。

优选地，所述抑制方法包括使用pck1抑制剂、insig1s207/insig2s151抑制剂，或其他任何抑制pck1蛋白激酶活性的方法，或其他任何抑制insig1s207/insig2s151位点磷酸化的方法。

优选地，所述pck1抑制剂包括针对pck1蛋白激酶活性的小分子抑制剂，insig1/insig2抑制剂包括选择性针对insig1s207/insig2s151位点磷酸化的多肽、小分子抑制剂。

优选地，所述pck1抑制剂包括选择性针对pck1s90位点磷酸化的多肽、小分子抑制剂和与pck1基因的全部或一部分互补的抑制性多核苷酸。

优选地，所述有利响应包括肿瘤尺寸或负荷减小、肿瘤生长阻滞、肿瘤相关疼痛减轻、癌症相关病理状况减轻、癌症相关症状减轻、癌症无进展、无病间期延长、进展时间延长、诱导缓解、转移降低、患者存活延长或肿瘤对抗癌治疗的敏感性提高。

本发明还提供了基于pck1调节的脂质代谢作为癌症预后预测之靶标的应用，所述应用包括：

(1)确定检测患者癌细胞中是否包含：与参考水平相比升高的pck1s90位点磷酸化水平、升高的insig1s207/insig2s151位点磷酸化水平和升高的srebp表达水平以及这三者的升高的各种联合表达水平；

(2)如果癌细胞包含(1)中任一项升高的水平，则预测患者具有侵袭性癌症；

(3)如果癌细胞包含(1)中任一项升高的水平，则预测患者具有的侵袭性癌症在进展期；

(4)如果癌细胞包含(1)中任一项升高的水平，则预测患者具有不良预后；

所述参考水平是来自非癌细胞或早期癌细胞的水平。

进一步地，如果所述测患者具有侵袭性癌症，则利用阻断pck1蛋白激酶活性激活、pck1s90位点磷酸化、insig1s207/insig2s151位点磷酸化、srebp的核积累和激活中的一种或两种的方式进行抑制剂抗癌治疗。

本发明的有益效果是：本发明利用，任何可使akt信号激活的上游信号(包括生长因子受体(例如igf1r、egfr和pdgfr)、k-ras突变、pten突变、pi3k突变等)激活之后，akt激活，从而导致akt与pck1结合以及akt介导的pck1的s90位点磷酸化，磷酸化的pck1转位至内质网。重要的是，pck1通过使用gtp作为磷酸供体而作为蛋白激酶磷酸化insig1/2的胞质环状2结构中的insig1s207和insig2s151(insig1s207/insig2s151)。这种磷酸化减少了固醇与insig1/2的结合，从而导致insig-scap相互作用的破坏、scap-固醇调节元件结合蛋白(srebp，包括srebp1和srebp2)复合物向高尔基体的转运、srebp的裂解、核积累和激活。激活的srebp1和srebp2诱导脂肪生成基因的转录。akt介导的pck1磷酸化和pck1介导的insig1/2磷酸化的阻断抑制了脂质合成、肝细胞癌(hcc)细胞增殖和小鼠hcc形成。强调了新鉴定的糖异生酶pck1的蛋白激酶活性在srebp1激活、脂肪形成和hcc发展中的重要性。重要的是，aktps473、pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的表达水平在肿瘤组织中显著上调、表达水平彼此之间显著正相关、与肿瘤的进展相关、与肿瘤的不良预后相关；pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的联合表达水平对于肿瘤患者是一个独立预后因素。

附图说明

图1为huh7hcc细胞中igf1r激活后akt介导pck1的s90位点磷酸化的电泳分析图；其中，图1(a)为在³²p-atp存在下，将纯化的wthis-pck1或his-pck1s90a与纯化的gst-akt1混合或不混合，进行体外激酶测定的放射自显影术和免疫印迹分析；图1(b)为将使用或不使用mk-2206预处理的huh7细胞用igf1处理指定的时间。

图2为u87脑胶质瘤细胞中egfr激活后akt介导pck1的s90位点磷酸化、insig1s207/insig2s151位点磷酸化和srebp1分裂的免疫印迹分析图，使用微管蛋白作为标志物。

图3为chl-1黑色素瘤细胞中pdgfr激活后akt介导pck1的s90位点磷酸化、insig1s207/insig2s151位点磷酸化和srebp1分裂的免疫印迹分析图，使用微管蛋白作为标志物。

图4为h1993非小细胞肺癌细胞中激活的k-ras突变后akt介导pck1的s90位点磷酸化、insig1s207/insig2s151位点磷酸化和srebp1分裂的免疫印迹分析图，使用微管蛋白作为标志物。

图5为huh7细胞中磷酸化的pck1转位至内质网的免疫印迹分析图。

图6为pck1作为蛋白激酶磷酸化insig1/2的胞质环状2结构中的insig1s207和insig2s151；其中，在[γ-³²p]gtp存在的情况下，将ni-nta琼脂糖珠上的细菌纯化的wthis-pck1、his-pck1s90d与wtsfb-insig1或sfb-insig1s207a(图6(a))或wtsfb-insig2或sfb-insig2s151a(图6(b))孵育，用所示抗体进行放射自显影和免疫印迹测定。

图7为insig1/2的磷酸化导致srebp的激活的荧光素酶活性分析图；数据用代表三份重复样品的平均值±sd表示。**p<0.001(双尾学生t检验)；c1，克隆1；c2，克隆2。

图8为激活的srebp1诱导脂肪生成基因的转录水平的定量pcr检测；数据用代表三份重复样品的平均值±sd表示。**p<0.001(双尾学生t检验)；c1，克隆1；c2，克隆2。

图9为激活的srebp2诱导脂肪生成基因的转录水平的定量pcr检测；数据用代表三份重复样品的平均值±sd表示。**p<0.001(双尾学生t检验)。c1，克隆1；c2，克隆2。

图10为磷酸化的阻断抑制了小鼠hcc形成；其中，图10(a)为akt介导的pck1磷酸化阻断抑制了小鼠hcc形成，图10(b)为pck1介导的insig1/2磷酸化的阻断抑制了小鼠hcc形成，计算肿瘤体积(图10(c))。数据表示为七只小鼠的平均值±sd。*p<0.01(双尾学生t检验)。c1，克隆1；c2，克隆2。

图11为30个人类hcc和匹配的非肿瘤组织样品的ihc染色。图中显示了两种情况的代表性图像，白框中的代表性区域被放大。

图12为90个人类hcc样品的ihc染色、相关性分析的皮尔逊相关检验。

图13为90个hcc患者体内高水平的pck1s90和insig1s207/insig2s151磷酸化与hcc患者的总生存期的kaplan-meier分析图；其中，根据pck1ps90(图13(a))和insig1ps207/insig2ps151(图13(b))的高表达(染色分数为4-8)和低表达(染色分数为0-3)对hcc患者的总生存率分析，使用对数秩检验计算p值。

图14为306例肺腺癌(luad)标本的免疫组织化学ihc染色图和分析图；其中，图14(a)的tumor1、tumor2分别为两个肿瘤患者的肿瘤组织染色；图14(b)为四个肿瘤标志物在肿瘤组织与正常组织之间的表达差异图。

图15为145例肺鳞癌(lusc)标本的免疫组织化学ihc染色图和分析图；其中，图15(a)为tumor1、tumor2分别为两个肿瘤患者的肿瘤组织染色；图15(b)为四个肿瘤标志物在肿瘤组织与正常组织之间的表达差异图。

图16为200例食管癌(esca)标本的免疫组织化学ihc染色图和分析图；其中，图16(a)为tumor1、tumor2分别为两个肿瘤患者的肿瘤组织染色；图16(b)为四个肿瘤标志物在肿瘤组织与正常组织之间的表达差异图。

图17为aktps473，pck1ps90，insig1ps207/insig2ps151和srebp1的表达水平在luad样本中的相关性散点图。

图18为aktps473，pck1ps90，insig1ps207/insig2ps151和srebp1的表达水平在lusc样本中的相关性散点图。

图19为aktps473，pck1ps90，insig1ps207/insig2ps151和srebp1的表达水平在esca样本中的相关性散点图。

图20为aktps473、pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1表达水平与luad患者预后的相关性kaplan-meier图。

图21为aktps473、pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1表达水平与lusc患者预后的相关性kaplan-meier图。

图22为aktps473、pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1表达水平与esca患者预后的相关性kaplan-meier图。

具体实施方式

为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白，下面结合附图，对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

一、检测方法：

1、磷酸化蛋白质的水平检测：

通过使样品与特异性结合磷酸化多肽的抗体接触并确定结合的抗体的量，例如通过检测或测量抗体与多肽之间复合物的行程。抗体可被标记(放射性、荧光等)以便于检测复合物。

用于本发明的多肽水平的检测系统包括：放射自显影免疫测定ria、免疫荧光、凝胶电泳、western免疫印迹测定。

所用抗体：tubulin(sc-8035)和insig1(a-9)(sc-390504)购自santacruzbiotechnology(santacruz,ca)；pck1(16754-1-ap)、insig2antibody(24766-1-ap)购自proteintech(il,usa)；anti-aktps473(#4060),rabbitakt(#9272),mouseakt(#2920)、pck1(d12f5)(#12940)rabbitantibodies购自cellsignalingtechnology(danvers,ma)；rabbitantibodiesthatrecognizepck1ps90,insig1ps207andinsig2ps151购自signalwaybiotechnology(pearland,tx)；igf1(85580c)、mousemonoclonalanti-flag(f1804)、rabbitanti-flag(f7425)、anti-his(sab1305538)antibodies购自sigma-aldrich(st.louis,mo)。

2、基因转录的mrna水平检测：

fasn(脂肪酸合酶)、acc1(乙酰辅酶a羧化酶1)、scd1(十八烷酰辅酶a去饱和酶)、gpat(甘油-3-磷酸酰基转移酶)、hmgcr(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶)、hmgcs(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合酶)、ldlr(低密度脂蛋白受体)、ss(角鲨烯合酶)特异性引物(qpcr引物)如下：

fasn：5'-cacagggacaacctggagtt-3'(seqidno:1)，

5'-actccacaggtgggaacaag-3'(seqidno:2)；

scd1,5'-cgacgtggctttttcttctc-3'(seqidno:3)，

5'-ccttctctttgacagctggg-3'(seqidno:4)；

acc1,5'-agtgggtcaccccattgtt-3'(seqidno:5)，

5'-ttctaacaggagctggagcc-3'(seqidno:6)；

gpat,5'-ttgtggcttgcctgctcctcta-3'(seqidno:7)，

5'-aatcacgagccaggacttcctc-3'(seqidno:8)；

hmgcr,5'-tctggcagtcagtgggaactatt-3'(seqidno:9)，

5'-cctcgtccttcgatccaattt-3'(seqidno:10)；

hmgcs,5'-gatgtgggaattgttgccctt-3'(seqidno:11)，

5'-attgtctctgttccaacttccag-3'(seqidno:12)；

ldlr,5'-aacggtcattcacccaggtc-3'(seqidno:13)，

5'-ggctgaagaataggagttgcc-3'(seqidno:14)；

ss,5'-cgatagctgtgtgcaaagtaact-3'(seqidno:15)，

5'-ccatctgctgagtgctttctg-3'(seqidno:16)。

4、小鼠肿瘤样品获取与分析：

将有或没有敲入表达pck1s90a或insig1s207a/insig2s151a的huh7细胞(1×10⁶)肝内注射到无胸腺裸鼠中(n＝7/组)。注射28天后使小鼠安乐死并检查hcc肿瘤生长。

5、细胞中蛋白质的免疫组织化学ihc染色检测(组织微阵列构建)：

抗aktps473(#4060)兔抗体(用于ihc)和识别igg的兔单克隆抗体购自cellsignalingtechnology(danvers,ma)。识别pck1ps90，insig1ps207和insig2ps151的兔抗体可从signalwaybiotechnology(美国德克萨斯州，皮尔兰)获得。srebp1抗体(2a4)(nb100-2215)(用于ihc分析)购自novus(littleton，co)。这些抗体的特异性先前已得到验证(参见gluconeogenicenzymepck1phosphorylatesinsigforsrebp-promotedlipogenesis.nature.2020:inpress)。通过手术切除获得福尔马林固定的石蜡包埋的组织，并用mayer的苏木精和伊红(h&e；biogenex实验室，加利福尼亚州，圣拉蒙)进行染色。

对癌症病例肿瘤样本和正常组织样本进行组织微阵列(tma)处理。使用自动组织阵列仪器(3，alphelys，plaisir，法国)，从每个标本中提取癌组织(直径为2mm，由病理学家选择)，并固定在石蜡块中。质量控制后，将tma块切成切片进行免疫组织化学分析。

二抗anti-rabbitiggheavychain(hrp)(ab99702)antibodies购自abcam(cambridge,ma)。

6、皮尔逊相关检验

本发明使用皮尔逊相关检验来进行人hcc、luad、lusc、esca标本中蛋白磷酸化和细胞核srebp1表达之间的相关性。

免疫组织化学分析是根据以前的出版物进行的(参见nucleus-translocatedacss2promotesgenetranscriptionforlysosomalbiogenesisandautophagy.molecularcell.2017；66(5):684-97e9)。去石蜡，再水化和抗原修复后，将tma玻片与一抗兔抗人aktps473(稀释度1:200)，一抗兔抗人磷酸化pck1ps90(稀释度1：200)，一抗兔抗人孵育insig1ps207和insig2ps151(稀释度1:500)，一抗兔抗人srebp1(稀释度1:100)或非特异性igg(作为阴性对照)在4℃过夜。然后将玻片与抗兔二抗(即用型溶液；cellsignalingtechnology；#8114)孵育，然后进行二原色二氨基联苯胺(dab)染色(cellsignalingtechnology)和苏木精染色，并在二甲苯上固定。根据阳性细胞的百分比和染色强度在显微镜下对组织玻片进行定量评分。本发明分配了以下比例得分：0，0％的细胞为阳性；1，0％至1％；2，2％至10％；3、11％至30％；4、31％至70％；和5，从71％到100％。还以0到3：0(负)的等级对染色强度进行了评级。1，弱；2，适中；3，强壮。如前所述文献记载，然后将比例和强度得分相加以获得总得分(范围0-8)。两位不了解临床信息的病理学家独立地验证了评分系统的可重复性。

7、患者的总生存率kaplan-meier绘图

使用spss20.0版软件(spssinc.，美国伊利诺伊州，芝加哥)进行数据分析。使用独立样本t检验比较了生物标志物aktps473、pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1在肿瘤和正常组织中的表达水平。使用单因素方差分析(anova，posthocbonferroni检验)对生物标志物的表达水平与患者的临床病理特征之间的相关性进行多重比较和最低显著性差异检验。使用pearson相关系数分析生物标志物表达水平之间的相关性。总生存期(os)定义为从诊断之日至死亡之日或最后一次随访的持续时间。使用k-means聚类分析对相关标志物的表达水平进行分类、kaplan-meier方法绘制生存曲线、对数秩检验以比较生存率以及带有双向wald检验的cox回归模型计算危险比(hr)和95％置信区间(cis)进行生存分析。审查的数据用于上次随访中活着或因随访而遗失的患者。p值小于0.05的单变量分析变量纳入多变量分析。p<0.05被认为具有统计学意义。所有统计检验都是双面的。

二、下列实施例采用的材料如下：

1、细胞种类：

huh7细胞(人肝癌细胞株huh7细胞)、chl-1细胞(人皮肤黑色素瘤细胞)，来自atcc；

2、无胸腺裸鼠是balb/c无胸腺裸鼠；

3、病人样本：

从青岛大学附属医院(中国青岛)的生物库中回顾性收集了经手术切除、福尔马林固定、石蜡包埋的nsclc组织样品。选择2002年至2013年间450例经病理诊断为非小细胞肺癌的未接受过手术治疗的患者的组织样本作为独立队列，其中包括306例肺腺癌(luad)(包含302个配对的正常对照标本)和145例肺鳞状细胞癌(lusc)(包含145个配对的正常对照标本)。选择2005年至2012年间200例经病理诊断为食管癌的未接受过手术治疗的患者的组织样本作为独立队列，其中包括200例食管癌(esca)(包含200个配对的正常对照标本)。通过回顾患者的病史获得了临床数据。病理分期由美国癌症联合委员会/国际癌症控制tnm分类系统联合会第8版评估。

实施例1、akt的激活介导pck1的磷酸化

1、胰岛素样生长因子1受体(igf1r)激活后akt介导pck1的s90位点磷酸化

(1)在³²p-atp存在下，将纯化的野生型his-pck1或his标记的pck1蛋白s90a部分(his-pck1s90a)与纯化的gst-akt1混合或不混合，进行体外激酶测定。利用放射自显影免疫测定ria、western免疫印迹测定，表征akt与pck1两者结合情况，结果如图1(a)所示，可以看出igf1r激活之后，akt激活，从而导致akt与pck1结合以及akt介导的pck1的s90位点磷酸化。

(2)将使用或不使用akt抑制剂mk-2206(10μm)预处理30分钟的huh7细胞用igf1(100ng/ml)处理指定的时间，利用western免疫印迹测定，表征akt与pck1的s90位点磷酸化之间的关联性，以微管蛋白为内参，结果如图1(b)所示，可以看出akt抑制剂mk-2206能抑制igf1对pck1的s90位点磷酸化的诱导。

2、表皮生长因子受体(egfr)激活后akt介导pck1的s90位点磷酸化

(1)构建pck1和pck1蛋白s90a片段过表达质粒ha-rpck1wt和ha-rpck1s90a。通过构建egfrviii稳定转染细胞株而使肿瘤细胞中的egfr处于激活的状态。

(2)利用shrna(pck1shrna寡核苷酸,5'-tgtgcgtcaaacttcatcc-3'(seqidno:17).)敲降u87细胞中的pck1，转染上述质粒，结果如图2所示，可以看出egfr激活之后，akt激活，从而导致akt与pck1结合以及akt介导的pck1的s90位点磷酸化、insig1s207/insig2s151位点磷酸化和srebp1分裂。

3、血小板源性生长因子受体(pdgfr)激活后akt介导pck1的s90位点磷酸化

采用如egfr相同的实验，不使用egfr激活的chl-1细胞，并用pdgf(30ng/ml)处理或不处理16小时，结果如图3所示，pdgfr激活之后，akt激活，从而导致akt与pck1结合以及akt介导的pck1的s90位点磷酸化、insig1s207/insig2s151位点磷酸化和srebp1分裂。

4、激活的k-ras突变后激活akt介导pck1的s90位点磷酸化

通过构建k-ras(g12v)突变的稳定转染细胞株而使非小细胞肺癌细胞中的k-ras处于激活的状态。参照egfr的实验内容，结果如图4所示，激活的k-ras突变后激活akt介导pck1的s90位点磷酸化、insig1s207/insig2s151位点磷酸化和srebp1分裂。

5、磷酸化的pck1转位至内质网

使用或不使用igf1(100ng/ml)将表达所示flag-rpck1蛋白的huh7细胞处理1小时。内质网er分离和总细胞裂解液准备好后用指定的抗体进行免疫印迹分析，结果如图5所示。

内质网er分离和总细胞裂解液获取，使用内质网分离试剂盒(er0100，sigmaaldrich)从细胞中分离出er组分。er蛋白用于免疫印迹分析。

实施例2、insig1/insig2的磷酸化

1、在[γ-³²p]gtp存在的情况下，将ni-nta琼脂糖珠上的细菌纯化的wthis-pck1、his-pck1s90d与wtsfb-insig1或sfb-insig1s207a孵育，利用放射自显影免疫测定ria、western免疫印迹测定，表征pck1与insig1s207两者结合情况，结果如图6(a)所示。

2、在[γ-³²p]gtp存在的情况下，将ni-nta琼脂糖珠上的细菌纯化的wthis-pck1、his-pck1s90d与wtsfb-insig2或sfb-insig2s151a孵育，利用放射自显影免疫测定ria、western免疫印迹测定，表征pck1与insig2s151a两者结合情况，结果如图6(b)所示。

可以看出pck1通过使用gtp作为磷酸供体而作为蛋白激酶磷酸化insig1/2的胞质环状2结构中的insig1s207和insig2s151(insig1ps207/insig2ps151)。

实施例3、srebp1激活和表达水平对癌症相关基因的表达影响

1、insig1/2的磷酸化导致srebp的激活

将实施例1中野生huh7细胞和具有insig1s207a/insig2s151a敲入表达的huh7细胞克隆进行igf1(100ng/ml)16h刺激或不刺激。利用表达β-半乳糖苷酶驱动的荧光素酶的细胞作为参照，和sre驱动的荧光素酶的细胞均需刺激16小时，随后进行萤火虫荧光素酶活性检测。相对于β-半乳糖苷酶活性标准化后的相对sre荧光素酶活性显示出来，结果如图7所示。

2、激活的甾醇调节元件结合转录因子1(srebp1)诱导脂肪生成基因的转录

在有或没有igf1(100ng/ml)的刺激下，野生型huh7细胞和具有pck1s90a敲入表达的huh7细胞克隆进行16h刺激。使用定量pcr检测srebp1靶向基因的mrna表达水平，结果如图8、图9所示。图中2s/a-c1表示insig1s207a/insig2s151a突变克隆1，图中2s/a-c2表示insig1s207a/insig2s151a突变克隆2，数据用代表三份重复样品的平均值±sd表示。通过图8、图9可知，8种脂肪生成基因的转录均收到了激活的srebp1的影响。

3、akt介导的pck1磷酸化和pck1介导的insig1/2磷酸化的阻断抑制了小鼠hcc形成。将实施例1中的将有或没有敲入表达pck1s90a(图10(a))或insig1s207a/insig2s151a(图10(b))的huh7细胞(1×10⁶)肝内注射到无胸腺裸鼠中(n＝7/组)。注射28天后使小鼠安乐死并检查肿瘤生长。箭头指向肿瘤。计算肿瘤体积(图10(c))。通过图10可以看出akt介导的pck1磷酸化和pck1介导的insig1/2磷酸化的阻断抑制了小鼠hcc形成。

实施例4、人类肝细胞肝癌hcc标本中pck1、insig1/2、核srebp1异常表现

1、用所示抗体对30个人类hcc和匹配的非肿瘤组织样品进行免疫组织化学ihc染色，结果如图11所示。

2、用指示的抗体对90个人类hcc样品的ihc染色进行评分，并进行相关性分析。使用皮尔逊相关检验，结果如图12所示。某些样本的分数值重叠。可以看到，hcc标本中pck1s90和insig1s207/insig2s151的磷酸化和核srebp1表达相互之间显著相关。

3、将90个hcc患者的组织ihc染色进行免疫组织化学分析，根据pck1ps90(图13(a))和insig1ps207/insig2s151(图13(b))的高表达(染色分数为4-8)和低表达(染色分数为0-3)对hcc患者的总生存率进行kaplan-meier绘图，结果如图13所示。使用对数秩检验计算p值。

hcc患者体内高水平的pck1s90和insig1s207/insig2s151磷酸化与hcc患者的总生存期缩短有关。

在人hcc的组织样本中发现hcc标本中pck1s90和insig1s207/insig2s151的磷酸化和核srebp1表达明显高于邻近正常组织(图11)、相互之间显著相关(图12)，重要的是hcc患者体内高水平的pck1s90和insig1s207/insig2s151磷酸化与hcc患者的总生存期缩短有关(图13)。

实施例5、相关癌症预后

为了验证脂质代谢调节在其他肿瘤类型中的临床价值，本实施例在非小细胞肺癌和食管癌中做了进一步研究。

1、对450例非小细胞肺癌(nsclc)标本和匹配的非肿瘤组织进行了ihc染色，包括306例肺腺癌(luad)和145例肺鳞癌(lusc)，结果如图14(a)、15(a)所示，图中显示了两种情况的代表性图像。使用经过特异性验证的抗体(anti-pck1ps90和anti-insig1ps207/insig2ps151)，发现aktps473、pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的表达在luad(图14(b))和lusc(图15(b))组织中明显更高，证明nsclc中的aktps473、pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的水平显著增加。

2、对200例食管癌(esca)标本和匹配的非肿瘤组织进行了ihc染色，结果如图16(a)所示，图中显示了两种情况的代表性图像。使用经过特异性验证的抗体，发现aktps473、pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的表达在esca(图16(b))组织中明显更高，证明esca中的aktps473、pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的水平显着增加。

3、为了确定akt活化依赖性pck1ps90磷酸化以及随后pck1的蛋白激酶活性介导的insig1s207/insig2s151磷酸化和srebp1激活是否在nsclc中发生，利用免疫组织化学分析分析了这些生物标记物表达水平的相关性，结果显示aktps473，pck1ps90，insig1ps207/insig2ps151和srebp1的表达水平在luad样本中显著正相关(图17)。在lusc样品中，insig1ps207/insig2ps151与pck1ps90和srebp1表达的相关性强且显著；而pck1ps90水平与srebp1表达水平的相关性弱，与aktps473表达水平不相关(图18)。这些结果表明在luad样本中aktps473，pck1ps90，insig1ps207/insig2ps151和srebp1表达水平呈正相关；在lusc样本中insig1ps207/insig2ps151与pck1ps90和srebp1表达的相关性显著。

4、为了确定akt活化依赖性pck1ps90磷酸化以及随后pck1的蛋白激酶活性介导的insig1s207/insig2s151磷酸化和srebp1激活是否在esca中发生，分析了这些生物标记物表达水平的相关性，结果显示aktps473，pck1ps90，insig1ps207/insig2ps151和srebp1的表达水平在esca样本中显著正相关(图19)。这些结果表明在esca样本中aktps473、pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1表达水平呈正相关。

实施例6、异常表现蛋白、复合物与癌症进展相关

1、pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的表达水平与nsclc的进展相关

为了确定激活的akt磷酸化的pck1s90和随后的具有蛋白激酶活性的pck1磷酸化的insig1s207/insig2s151和srebp1激活是否与nsclc的进展相关，分析了这四种生物标志物在不同t、n和m(tnm)阶段的nsclc标本中的表达水平。所有这些生物标志物都与luad的t期、n期、m期和tnm期相关(表1)。但是，在lusc中，pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的表达水平与这些临床特征相关，而aktps473的表达水平没有这些相关性(表1)。这些结果表明pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的表达水平与nsclc的进展有关。

表1.相关蛋白表达水平与nsclc的进展相关性分析表

2、pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的表达水平与esca的进展相关

为了确定激活的akt磷酸化的pck1s90和随后的具有蛋白激酶活性的pck1磷酸化的insig1s207/insig2s151和srebp1激活是否与esca的进展相关，分析了这四种生物标志物在不同t、n和m(tnm)阶段的esca标本中的表达水平。除了aktps473，pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1都与esca的t期、n期、m期和tnm期相关(表2)。这些结果表明pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的表达水平与esca的进展有关。

表2.相关蛋白表达水平与nsclc的进展相关性分析表

3、pck1ps90和insig1ps207/insig2ps151的表达水平与nsclc患者不良预后呈正相关

为了进一步研究aktps473、pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1表达水平的临床相关性，确定了这些生物标志物与nsclc患者生存时间的关系。结果显示，在luad(图20)和lusc(图21)患者中，pck1ps90和insig1ps207/insig2ps151表达水平而非aktps473和srebp1表达水平与不良预后正相关。此外，pck1ps90和insig1ps207/insig2ps151的联合表达以及所有四种标记物的联合表达与luad(图20)和lusc(图21)的不良预后正相关。

值得注意的是，在luad中，pck1ps90与insig1ps207/insig2ps151的联合表达是一个更好的预后指标(中位生存时间，低vs.高：67.7vs.33.1个月)相较于pck1ps90表达(低vs.高：67.6vs.39.2个月)、insig1ps207/insig2ps151表达(低vs.高：58.2与40.4个月)以及四种标记物的联合表达(低vs.高：62.3与40.2个月)。同样，在lusc中，pck1ps90与insig1ps207/insig2ps151的联合表达也是一个更好的预后指标(中位生存时间，低vs.高：90.2与41.1个月)相较于pck1ps90表达(低vs.高：81.4与44.5个月)、insig1ps207/insig2ps151表达(低vs.高：88.3vs.59.8个月)以及四种标记物的联合表达(低vs.高：89.1vs.57.2个月)。这些结果表明，nsclc患者中pck1ps90和insig1ps207/insig2ps151的水平升高与不良预后正相关。

4、pck1ps90和insig1ps207/insig2ps151的表达水平与esca患者不良预后呈正相关

为了进一步研究aktps473、pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1表达水平的临床相关性，确定了这些生物标志物与esca患者生存时间的关系。结果显示，在esca(图22)患者中，除了aktps473，pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的表达水平与不良预后正相关。此外，pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的联合表达，以及pck1ps90和insig1ps207/insig2ps151的联合表达与esca(图22)的不良预后正相关。

值得注意的是，pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的联合表达是一个更好的预后指标(中位生存时间，低vs.高：76.3vs.24.5个月)相较于pck1ps90表达(低vs.高：74.5vs.26.6个月)、insig1ps207/insig2ps151表达(低vs.高：65.4vs.24.6个月)、srebp1表达(低vs.高：74.1vs.25.5个月)以及pck1ps90和insig1ps207/insig2ps151的联合表达(低vs.高：75.2vs.25.1个月)。这些结果表明，esca患者中pck1ps90和insig1ps207/insig2ps151的水平升高与不良预后正相关。

5、pck1ps90和insig1ps207/insig2ps151的联合表达是nsclc的独立预后因素

为了进一步确定pck1ps90和insig1ps207/insig2ps151在nsclc中的预后价值，进行了单因素和多因素cox回归分析。单因素分析显示，高龄(p<0.05)、tnm分期(p<0.05)、pck1ps90(p<0.05)和insig1ps207/insig2ps151(p<0.05)的高表达以及pck1ps90与insig1ps207/insig2ps151的联合高表达(p<0.01)与luad和lusc患者的总体生存时间较短相关(表3)。

多变量分析表明，除了年龄(p<0.05)和tnm分期(p<0.05)之外，pck1ps90与insig1ps207/insig2ps151的联合表达是luad(hr，1.365；95％ci，0.777-2.154；p＝0.040)和lusc(hr，1.443；95％ci，0.935-2.156；p＝0.033)的独立不良预后因素(表3)。这些结果表明，pck1ps90与insig1ps207/insig2ps151的联合表达是nsclc患者的独立不良预后因素。

表3.相关蛋白联合表达与nsclc的独立预后分析表

6、pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的联合表达是esca的独立预后因素

为了进一步确定pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1在esca中的预后价值，进行了单因素和多因素cox回归分析。单因素分析显示，高龄(p<0.001)、tnm分期(p<0.001)、pck1ps90(p＝0.001)、insig1ps207/insig2ps151(p＝0.003)、srebp1(p＝0.001)的高表达、pck1ps90与insig1ps207/insig2ps151的联合高表达(p＝0.003)以及pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的联合高表达(p<0.001)与esca患者的总体生存时间较短相关(表4)。

表4.相关蛋白联合高表达与esca患者的总体生存时间相关性分析表

多变量分析表明，除了年龄(p＝0.018)和tnm分期(p<0.001)之外，pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的联合表达是esca(hr，1.535；95％ci，1.045-2.255；p＝0.029)的独立不良预后因素(表4)。另外，pck1ps90和insig1ps207/insig2ps151的联合表达也是esca(hr，1.462；95％ci，1.004-2.127；p＝0.047)的独立不良预后因素。这些结果表明，pck1ps90、insig1ps207/insig2ps151和srebp1的联合高表达是esca患者的独立不良预后因素。

当然，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>青岛大学附属医院

<120>基于pck1调节的脂质代谢作为癌症治疗、诊断和预后预测之靶标的应用

<160>17

<170>siposequencelisting1.0

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<213>人工序列(artificialsequence)

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