本发明属于生殖技术领域，具体涉及一种基于zonablock的ovastacin蛋白在快速无创检测体外受精的应用。
背景技术：
体外受精-胚胎移植技术是利用药物使女性的一批卵子同步生长并发育成熟，经穿刺取出后，与丈夫优化后的精子放置在培养皿中共孵育，经过一段时间体外受精过程后发育为受精卵，后逐步卵裂发育为胚胎；再选择优质胚胎放置于女方的子宫中，最终发育为胎儿。
在辅助生殖中目前主要有两种体外受精方法即长时受精和短时受精。长时受精是将精子和卵母细胞孵育过夜后(17-19小时)，通过观察雌雄原核来判断是否受精成功。短时受精指对可能有受精障碍的患者，精子和卵母细胞孵育后4至6小时后通过拆蛋的方法，观察第二极体来判断是否受精。如有较大比例(30％以上)卵子透明带和卵细胞之间能看到两个极体的话判定为受精成功。若不成功，则需要进行icsi进行补救。在长时受精方法中，如受精失败将无法补救，因为17-19小时后卵子早已老化icsi补救效果很差。短时受精方法中第二极体的观察缺点较多，容易导致误判。例如：极体排出后容易碎裂导致观察不到；理论上第一极体可能会分裂为两个极体，或者碎裂为两部分，这样会被误判为一个第一极体和一个第二极体，从而误判为受精成功或者拆蛋或者培养过程中在透明带内可能会产生形态类似极体的其它碎片，会被误判为极体等等。因此亟需一种客观准确快速早期的检测受精是否成功的方法。
在卵母细胞受精过程中，会发生zonablock。卵母细胞会排出皮质颗粒，释放其中的ovastacin蛋白(又名astl蛋白)，催化透明带蛋白的裂解，发生‘硬化’，阻止更多精子进入，保证受精成功。本发明基于受精过程中卵母细胞发生的zonablock相关的ovastacin蛋白在受精检测中的应用。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种基于zonablock的ovastacin蛋白在快速无创检测体外受精的应用，通过检测受精过程中卵母细胞基于zonablock机制释放到受精液滴中的ovastacin蛋白，能够在受精4-6小时之后，即可客观准确判定卵母细胞是否成功受精，为icsi进行补救的选择提供依据。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于zonablock的ovastacin蛋白在快速无创检测体外受精的应用，通过检测受精之后受精液滴中卵母细胞释放的ovastacin蛋白的阳性或阴性，快速早期判断受精是否成功。
当所述受精液滴中的ovastacin蛋白为阳性，则受精成功；当所述受精液滴中的ovastacin蛋白为阴性，则受精不成功。
进一步地，在受精之后4-6小时，检测受精液滴中卵母细胞释放的ovastacin蛋白的阳性或阴性。
进一步地，通过抗原抗体的特异性免疫反应，检测所述受精液滴中卵母细胞释放的ovastacin蛋白的阳性或阴性。
进一步地，采用elisa法、免疫荧光法、免疫印迹法、免疫胶体金法中的的任意一种检测方法，检测所述受精液滴中卵母细胞释放的ovastacin蛋白的阳性或阴性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、在临床辅助生殖中目前主要有两种体外受精判断方法，长时受精和短时受精。长时受精是将精子卵子放一起过夜后(17-19小时)观察是否有雌雄原核来判断是否受精成功。短时受精指对可能有受精障碍的患者，精子卵子混合后4至6小时后观察第二极体来判断是否受精。一般会采用拆蛋针去除一部分卵细胞周围的颗粒细胞，如有较大比例(30％以上)卵子透明带和卵细胞之间能看到两个极体的话判定为受精成功，剩下的卵子就不用继续拆除颗粒细胞。如拆蛋部分卵子中只有一个甚至没有卵子能看到两个极体，则继续将剩余卵子全部拆除颗粒细胞，如发现两三个有双极体则判定为受精成功，继续培养，如只有一个或没有卵子观察到双极体则实施icsi补救。在长时受精方法中，如受精失败将无法补救，因为17-19小时后卵子早已老化icsi补救效果很差。本发明首次应用受精过程中卵母细胞的zonablock机制进行检测。本发明检测基于受精过程中卵母细胞的zonablock机制所释放的蛋白astl(又名ovastacin)，该蛋白只有在卵母细胞受精成功之后，从卵母细胞中释放出来，阻止多精受精。通过免疫学方法进行检测，例如通过elisa方式进行检测，以判断卵母细胞是否受精成功。相较与传统的科研人员通过拆蛋方法，进行肉眼观察的方法，此方法更加客观，而且对卵母细胞伤害更小。进而快速确定是否需要icsi进行补救。检测方式无创，且检测结果客观可信。
2、基于卵母细胞受精过程中zonablock机制进行开展，检测时间为受精之后4-6小时，检测时间比较早，如果未受精成功，此时卵母细胞还未出现老化，可以进行下一步的icsi进行补救，实现了卵母细胞的有效利用，减少了患者的痛苦及经济负担，有助于提高临床早期判断受精结局，对下一步诊治提供指导。
具体实施方式
以下对结合具体实施例对本发明作进一步描述，所举实施例仅是对本发明方法的说明而非限定本发明的范围。本发明存在其他多种实现形式，并不限于本文所描述的实施例。
以下实施例以elisa方法检测ovastacin蛋白为例进行详细说明。但不局限于此种检测方法，其他检测ovastacin蛋白的方法均可。
实施例一
(一)elisa检测ovastacin蛋白的收集及检测流程如下：
1、收集女性患者的单个卵子与精子共同培养后4-6小时换液的受精液滴。
2、4℃3000rpm离心5分钟去除多余的精子。
3、将受精液滴进行elisa检测，检测受精液滴中ovastacin蛋白的阴性或阳性。
(二)具体步骤包括：
1、包被：用被缓冲液(0.05mph9.6的碳酸盐缓冲液)将离心之后的受精液滴稀释至100ul，包被96孔elisa酶标板(corning公司产品，下同)，37℃，包被1h；
2、封闭：将包被后elisa酶标板用pbs-t(pbs含0.1％tween-20，ph7.5，下同)洗涤3次，每次2min；加入100μl封闭液(含3％bsa的pbst)，37℃封闭60min；pbst洗涤3次后。
3、加入一抗：抗体用含1％bsa的pbst进行稀释，将稀释的astl(又名ovastacin)蛋白抗体加入elisa酶标板各孔中(100μl/每孔)，37℃孵育60min；pbst洗涤5次。
4、加酶标二抗：二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗鼠igg抗体(31432pierce公司产品)，用含1％bsa的pbst作1:5000稀释，加入elisa板各孔中(100μl/每孔)，37℃作用60min；pbst洗涤3次。
5、加入显示底物溶液：向酶标板各孔中加入显色底溶液(含0.045％h2o2，0.4mg/mlo-phenylenediaminedihydrochloride(opd)的磷酸-柠檬酸盐缓冲液)，每孔100μl，37℃避光显色15min；每孔加入2mh2so450μl终止反应。
6、od495值测定：在酶标仪上波长495nm处测定每孔内光密度吸收值(od495)。
7、统计各个卵母细胞的受精情况，确认是否需要进行补救。
检测结果为下一步准确判断胚胎培养过程提供有力的依据，提前确定是否需要行早期补救，适用于大规模的推广应用。