以乙醛脱氢酶作为信号转导系统检测食源性病原菌的生物传感器及其制备方法和应用与流程

本发明涉及食源性病原菌检测技术领域，具体涉及一种以乙醛脱氢酶作为信号转导系统检测食源性病原菌的生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

性能优异的即时诊断技术(poc)在医疗保健和食品安全中发挥着至关重要的作用，越来越受业界的欢迎。定性或定量检测与临床相关的生物学目标(例如小分子、蛋白质、核酸、病原菌等)对于提高诊断水平、及时有效地治疗疾病和预防病原菌感染具有重要意义。在众多方法中，具有目标特异性识别和信号转导功能的生物传感器具有重要的领导作用。生物传感器将其结合靶标生物识别元件转换为理化检测信号。为促进生物传感器在poc领域的应用，某些信号转导策略能够产生特殊的理化信号(例如葡萄糖、压力、温度、氢气)可直接被商用手持式仪表(例如血糖仪(pgm)、压力表、温度计和氢气检测仪)测定，拓宽了手持式仪表的应用范围，可实现对各种目标的poc检测。血糖仪pgm主要基于转化酶、淀粉酶、己糖激酶、半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等开发的酶促信号转导系统将底物转化为葡萄糖实现特定目标的poc。多种催化剂例如过氧化氢酶、铂纳米颗粒和cuo/co3o4纳米纤维被开发作为酶促信号转导系统，催化底物在封闭系统中分解产生大量气体，增加密闭容器的压强，然后用商用压力表测量气压的变化，实现目标物的定量检测。

乙醛脱氢酶(aldh)是最重要的一类酶，作为人体醛代谢的重要调节剂，aldh可以有效保护人体免受活性醛的伤害。目前，aldh应用于食源性病原菌检测领域尚未见报道。

技术实现要素：

本发明提供一种以乙醛脱氢酶作为信号转导系统检测食源性病原菌的生物传感器及其制备方法和应用，可实现食源性病原菌的快速检测，弥补了食源性病原菌poc检测中存在的问题。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的以乙醛脱氢酶作为信号转导系统检测食源性病原菌的生物传感器，主要包括：

fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物；

aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物。

作为优选的实施方式，所述fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物由fe3o4、食源性病原菌特异性核酸适配体、pbs缓冲液、氯化钙溶液制成；所述fe3o4的体积为40μl、浓度为50mg/ml；所述食源性病原菌特异性核酸适配体的体积为8μl、浓度为10μm；所述pbs的体积为800μl、浓度为10mm、ph7.4；所述氯化钙溶液的体积为20μl、浓度为100mm。

作为优选的实施方式，所述aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物由乙醛脱氢酶、食源性病原菌特异性核酸适配体、pbs缓冲液、氯化钙溶液制成；所述乙醛脱氢酶的体积为80μl、浓度为5mg/ml；所述食源性病原菌特异性核酸适配体的体积为20μl、浓度为10μm；所述pbs的体积为800μl、浓度为10mm、ph8.5；所述氯化钙溶液的体积为20μl、浓度为100mm。

作为优选的实施方式，所述fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物中的食源性病原菌特异性核酸适配体与aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物中的食源性病原菌特异性核酸适配体相同。

本发明的以乙醛脱氢酶作为信号转导系统检测食源性病原菌的生物传感器的制备方法，主要包括以下步骤：

步骤一、合成fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物：

(1)将fe3o4和食源性病原菌特异性核酸适配体加入到pbs缓冲液中；

(2)加入氯化钙溶液，用超纯水定容，震荡混匀，室温下孵育15～21h；

(3)用磁铁吸附黑色产物，pbs洗涤，去除上清，即得fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物；

步骤二、合成aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物：

(1)将kcl和β-巯基乙醇加入到pbs缓冲液中；

(2)将乙醛脱氢酶和食源性病原菌特异性核酸适配体加入到步骤(1)所得溶液中；

(3)加入氯化钙溶液，用超纯水定，混合均匀，室温下孵育9～15h；

(4)经离心后产生白色沉淀物，纯水洗涤，去除上清，即得aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物。

作为优选的实施方式，步骤二(1)中，所述kcl的体积为50μl、浓度为100mm；所述β-巯基乙醇的体积为10μl、浓度为1m。

本发明的以乙醛脱氢酶作为信号转导系统检测食源性病原菌的生物传感器的检测方法，主要包括以下步骤：

步骤一、合成fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物：

(1)将fe3o4和食源性病原菌特异性核酸适配体加入到pbs缓冲液中；

(2)加入氯化钙溶液，用超纯水定容，震荡混匀，室温下孵育15～21h；

(3)用磁铁吸附黑色产物，pbs洗涤，去除上清，即得fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物；

步骤二、合成aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物：

(1)将kcl和β-巯基乙醇加入到pbs缓冲液中；

(2)将乙醛脱氢酶和食源性病原菌特异性核酸适配体加入到步骤(1)所得溶液中；

(3)加入氯化钙溶液，用超纯水定，混合均匀，室温下孵育9～15h；

(4)经离心后产生白色沉淀物，纯水洗涤，去除上清，即得aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物；

步骤三、将待测样品加入pbs缓冲液中，加入fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物和aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物混合均匀，经孵育后形成三明治夹心免疫复合物；用pbs洗涤，磁铁分离以除去未结合的靶标；加入100μl的反应底物进行反应，测量反应液上清的ph；计算ph变化量对应的食源性病原菌的浓度，所述反应底物包括2mm的乙醛、10mm的β-巯基乙醇、500mm的氯化钾、10mm的nadh。

作为优选的实施方式，步骤三中，所述待测样品、fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物和aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物的体积比为10:1:4。

作为优选的实施方式，步骤三中，所述反应底物中，乙醛浓度为2mm，β-巯基乙醇浓度为10mm，氯化钾浓度为100mm。

发明原理：本发明以aldh和aptamer为有机材料，以磷酸钙为无机材料，通过简单的一步法合成了aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物(aac)，作为信号探针，同时利用fe3o4嵌入aptamer-ca3(po4)2杂化纳米复合材料(fac)作为磁捕获探针来分离食源性病原菌。在食源性病原菌存在的情况下，捕获探针fac和信号探针aac之间形成了三明治夹心免疫复合物。三明治夹心免疫复合物中的aldh可以将乙醛催化为乙酸，生成的乙酸引起h⁺浓度的变化，从而改变反应液ph值。因此，ph的变化值与食源性病原菌的浓度有关，从而能够通过手持ph计对食源性病原菌进行精确检测。

本发明的有益效果是：

本发明建立了以乙醛脱氢酶为信号转导系统，、以aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物(aac)为信号探针、以fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物为捕获探针，通过便携式ph计进行读数来测定食源性病原菌的生物传感器，首次将乙醛脱氢酶作为信号转导系统用于食源性病原菌的检测。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)检测时间短：本发明使用fac和aac对食源性病原菌进行poc检测。首先，本发明采用一锅法将fac和aac直接于靶标食源性病原菌混合孵育，大大缩短了检测时间；其次，aac中的aldh能高效催化乙醛氧化为乙酸，快速的降低反应液的ph；最后，使用商业化的便携式ph计可瞬间测量反应液的ph值，极大的缩短了检测时间。本发明的检测方法仅需50分钟即可全部完成，检测时间较短、速度较快。

(2)灵敏度高：本发明可以检测出46个鼠伤寒沙门氏菌，检出限为46cfu/ml，灵敏度比常规现有检测方法至少高1-2个数量级，保证了本发明的检测方法的有效性和可行性。这是因为：一、aac中的aldh具有较高的活性，微量的fac-菌-aac三明治夹心免疫复合物即可引起反应液ph的降低。二、fac和aac中的aptamer可高效地抓取鼠伤寒沙门氏菌从而形成fac-菌-aac三明治夹心免疫复合物。三、商业化的便携式ph计具有较高的灵敏性，微量的fac-菌-aac三明治夹心免疫复合物产生的ph变化都可以被精确地检测。

(3)特异性强：fac和aac中都整合有食源性病原菌特异性aptamer，都对食源性病原菌具有较高的选择性，有效地降低错配。

(4)操作简单、成本低：本发明不需要大型仪器，操作过程简单方便。商品化的aldh价格很低。

(5)本发明通过替换相应的食源性病原菌特异性核酸适配体来检测不同的食源性病原菌，在食品安全和临床诊断中具有无限应用潜力。

附图说明

图1为实施例1制备的fac的sem图和实施例2制备的aac的sem图。图1a为fac的低分辨率sem图像，图1b为fac的高分辨率sem图像，图1c为aac的低分辨率sem图像，图1d为aac高分辨率sem图像。

图2为实施例1制备的fac的edx图谱和实施例2制备的aac的edx图谱。图2a为fac的edx图谱，图2b为aac的edx图谱。

图3为实施例1制备的fac的xrd图谱和实施例2制备的aac的xrd图谱。图3a为fac的xrd图谱，图3b为aac的xrd图谱。

图4为本发明的原理图。

图5为不同浓度鼠伤寒沙门氏菌的对数与δph的线性关系图。

图6为浓度为10⁷cfu/ml不同菌株(含无菌pbs)的δph的对比图。

具体实施方式

本发明的以乙醛脱氢酶作为信号转导系统检测食源性病原菌的生物传感器，主要包括：

fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物(fac)；

aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物(aac)。

优选的，fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物由fe3o4、食源性病原菌特异性核酸适配体(aptamer)、pbs缓冲液、氯化钙溶液制成。

优选的，aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物由乙醛脱氢酶、食源性病原菌特异性核酸适配体(aptamer)、pbs缓冲液、氯化钙溶液制成。

其中，fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物中的食源性病原菌特异性核酸适配体与aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物中的食源性病原菌特异性核酸适配体相同。具体的是：例如当检测鼠伤寒沙门氏菌时，食源性病原菌特异性核酸适配体采用鼠伤寒沙门氏菌特异性核酸适配体；当检测大肠杆菌o157:h7时，食源性病原菌特异性核酸适配体采用大肠杆菌o157:h7特异性核酸适配体，以此类推。所使用的食源性病原菌特异性核酸适配体均为现有技术。

本发明的以乙醛脱氢酶作为信号转导系统检测食源性病原菌的生物传感器的制备方法，主要包括以下步骤：

步骤一、合成fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物(fac)：

(1)将fe3o4和食源性病原菌特异性核酸适配体加入到pbs缓冲液中；

(2)加入氯化钙溶液，用超纯水定容，震荡混匀，室温下孵育15～21h；

(3)用磁铁吸附黑色产物，pbs洗涤，去除上清，即得fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物；

步骤二、合成aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物(aac)：

(1)将kcl和β-巯基乙醇加入到pbs缓冲液中；

(2)将乙醛脱氢酶和食源性病原菌特异性核酸适配体加入到步骤(1)所得溶液中；

(3)加入氯化钙溶液，用超纯水定，混合均匀，室温下孵育9～15h；

(4)经离心后产生白色沉淀物，纯水洗涤，去除上清，即得aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物。

本发明的以乙醛脱氢酶作为信号转导系统检测食源性病原菌的生物传感器的检测方法，主要包括以下步骤：

步骤一、合成fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物(fac)：

(1)将fe3o4和食源性病原菌特异性核酸适配体加入到pbs缓冲液中；

(2)加入氯化钙溶液，用超纯水定容，震荡混匀，室温下孵育15～21h；

(3)用磁铁吸附黑色产物，pbs洗涤，去除上清，即得fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物；

步骤二、合成aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物(aac)：

(1)将kcl和β-巯基乙醇加入到pbs缓冲液中；

(2)将乙醛脱氢酶和食源性病原菌特异性核酸适配体加入到步骤(1)所得溶液中；

(3)加入氯化钙溶液，用超纯水定，混合均匀，室温下孵育9～15h；

(4)经离心后产生白色沉淀物，纯水洗涤，去除上清，即得aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物；

步骤三、将待测样品加入pbs缓冲液中，加入fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物和aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物混合均匀，经孵育后形成三明治夹心免疫复合物；用pbs洗涤，磁铁分离以除去未结合的靶标；加入100μl的反应底物(含有2mm的乙醛、10mm的β-巯基乙醇、500mm的氯化钾、10mm的nadh)进行反应，测量反应液上清的ph，计算ph变化量对应的食源性病原菌的浓度。

优选的，步骤三中，待测样品、fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物和aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物的体积比为10:1:4。

优选的，步骤三中，反应底物中，乙醛浓度为2mm，β-巯基乙醇浓度为10mm，氯化钾浓度为100mm。

本发明首次将乙醛脱氢酶(aldh)开发为生物传感器的酶信号系统，用于食源性病原菌即时检测(poc)。aldh和食源性病原菌特异性核酸适配体作为有机成分被嵌入有机-无机纳米复合物中作为生物传感器信号标记，整合了目标识别和信号放大的功能。aldh可以催化乙醛快速氧化为乙酸，从而导致ph值变化，ph值变化可以用便携式ph计直接读取，ph值变化与食源性病原菌的对数呈线性关系(10²-10⁸cfu/ml)，检出限为46cfu/ml。

本发明将乙醛脱氢酶作为信号放大载体用于食源性病原菌的检测，具有检测时间短、操作简单、成本低、灵敏性高、特异性强的优点，在食源性病原菌诊断中具有潜在的应用价值。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物(fac)的合成

(1)将40μl、50mg/ml的fe3o4和8μl、10μm的鼠伤寒沙门氏菌特异性核酸适配体加入到800μl、10mm的pbs(ph7.4)缓冲液中；

(2)加入20μl、100mm的氯化钙溶液，使用超纯水定容至1ml，震荡混匀，在室温下孵育18h；

(3)用磁铁吸附黑色产物，用1mmpbs(ph7.4)洗涤两次，磁铁吸附法移除上清，即得fac。

所制备的fac的低分辨率sem图像如图1a所示，fac是直径约2μm的均匀多孔球体，所制备的fac的高分辨率sem图像如图1b所示，图像中显示出交错的牡丹样花形，可以有效增加比表面积。从fac的局部放大图像中可以观察到大量的fe3o4纳米颗粒。

如图2a所示，fac主要由fe、ca、p、c、n和o元素组成，fe和n分别来自fe3o4和鼠伤寒沙门氏菌特异性核酸适配体。

fac的xrd图谱如图3a所示，与ca3(po4)2(jcpds00-018-0303)和fe3o4(jcpds01-077-1545)吻合，这证实了fe3o4@aptamer磷酸钙纳米复合物中的无机成分为磷酸钙和四氧化三铁。

实施例2aldh@aptamer磷酸钙纳米复合物(aac)的合成

(1)将50μl、100mm的kcl和10μl、1m的β-巯基乙醇加入到800μl、10mm的pbs(ph8.5)缓冲液中；

(2)将80μl、5mg/ml的aldh和20μl、10μm的鼠伤寒沙门氏菌特异性核酸适配体加入到上述缓冲溶液中；

(3)加入20μl、100mm的氯化钙溶液，使用超纯水定容至1ml，混合均匀，在室温下孵育12h；

(4)10000转/分离心5min产生白色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清，即得aac。

所制备的aac的低分辨率sem图像如图1c所示，aac是直径约2μm的均匀多孔球体，所制备的aac的高分辨率sem图像如图1d所示，图像中显示出交错的牡丹花形。

如图2b所示，aac中包括ca、s、p、c、n和o六个典型元素，这些元素来源于ca3(po4)2、aldh和鼠伤寒沙门氏菌特异性核酸适配体。

aac的xrd图谱如图3b所示，aac与ca3(po4)2衍射峰的相对强度和位置对应，这证明aac的无机成分为磷酸钙。

实施例3鼠伤寒沙门氏菌的检测

利用实施例1制备的fac和实施例2制备的aac对鼠伤寒沙门氏菌进行检测。检测原理如图4所示，具体包括以下步骤：

(1)将鼠伤寒沙门氏菌菌株在luria-bertani肉汤培养液中于37℃孵育过夜，4500转/分离心10min，1mmpbs(ph7.4)洗涤两次，重悬、稀释于1mmpbs(ph7.4)中；

(2)将50μl不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌悬浮液加入到离心管中，1mmpbs(ph7.4)缓冲液作阴性对照；

(3)将含有不同浓度鼠伤寒沙门氏菌的1mmpbs(ph7.4)与5μl的fac和20μl的aac混合均匀，37℃孵育20min后形成fac-沙门氏菌-aac三明治夹心免疫复合物；

(4)用1mmpbs(ph8.5)洗涤两次，采用磁铁分离，以除去未结合的靶标；

(5)加入100μl反应底物(含有2mm的乙醛、10mm的β-巯基乙醇、500mm的氯化钾、10mm的nadh)，45℃下反应30min；用便携式ph计测量反应液上清的ph，计算ph变化量(δph值)，从而计算出对应的鼠伤寒沙门氏菌的浓度。ph变化量(δph值)表示：在有目标细菌存在的情况下ph计记录的ph值与无目标细菌存在的情况下ph计记录的ph值之间的差异。

如图5所示，δph值与鼠伤寒沙门氏菌浓度的对数呈线性关系(10²-10⁸cfu/ml)。线性回归方程为y＝0.252x-0.287(r²＝0.9856)，其中y、x和r²分别代表δph值、鼠伤寒沙门氏菌浓度(对数)和相关系数。计算的检出限(lod)为46cfu/ml。结果表明，通过本发明的方法所建立的生物传感器具有灵敏度高、线性范围大和lod低的优势。此外，与现有技术相比，本发明开发的生物传感器性能优越，检测仅需50分钟即可完成。

实施例4特异性实验

使用鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)、大肠杆菌o157:h7两种格兰仕阴性菌和金黄葡萄球菌(sta)、李斯特菌(lis)两种格兰仕阳性菌测试本发明的特异性，具体检测步骤同实施例3，其区别在于将实施例3中所使用的不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌分别换成：

①“10⁷cfu/ml的大肠杆菌o157:h7悬浮液”；

②“10⁷cfu/ml的李斯特菌(lis)悬浮液”；

③“10⁷cfu/ml的金黄葡萄球菌(sta)悬浮液”。

实验结果如图6所示，在相同的实验条件下，与其他病原细菌相比，鼠伤寒沙门氏菌的δph值变化最大。结果证明本发明所建立的检测方法的特异性良好。

实施例5准确性试验

为了进一步研究其检测病原菌的能力，使用本发明的生物传感器来检测真实的食物样品。将不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌分别添加到无菌牛奶样品中，然后使用本发明的检测方法测定回收率，结果如表1所示，分析回收率的范围为91.4％至106.6％。

表1牛奶样品中鼠伤寒沙门氏菌检测结果

本发明公开了一种以乙醛脱氢酶作为信号转导系统检测食源性病原菌的生物传感器及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。