SARS-CoV-2检测芯片及其应用的制作方法

本发明涉及体外免疫检测
技术领域：
，尤其是涉及一种sars-cov-2检测芯片及其应用。
背景技术：
：新型冠状病毒sars-cov-2属于β属的冠状病毒，其与急性呼吸综合征相关的冠状病毒(sars)病毒有很强的同源性，但是基因特征也存在一些区别。该病毒可以引起新型冠状病毒肺炎，可导致严重急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克，多功能衰竭甚至死亡。目前对该病毒的检测方法包括：采用荧光定量pcr的方法进行核酸检测，和采用免疫检测方法对患者样本中的新冠病毒igm和igg抗体检测。核酸检测时间长，对实验室生物安全等级要求高，不便于各基层医院实施。与之相比抗体检测操作简便，价格低廉，便于广泛实施。但是，目前抗体检测产品检测灵敏度较低，特异性不高，难以实现准确判断新冠感染情况，有可能导致误诊漏诊情况出现。因此，一种能够有效检测新型冠状病毒sars-cov-2的产品是目前需要的。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种sars-cov-2检测芯片，缓解了现有技术中sars-cov-2的igm和igg检测灵敏度低，特异性差的问题。本发明的第二目的在于提供一种非诊断和治疗目的的检测sars-cov-2的方法。本发明的第三目的在于提供一种所述sars-cov-2检测芯片在制备用于检测sars-cov-2的产品中的应用。为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：根据本发明的一个方面，本发明提供了一种sars-cov-2检测芯片，所述sars-cov-2检测芯片包括试剂存储区和检测区；所述检测区包括分区一、分区二和分区三；所述试剂存储区位于进样孔和检测区之间；所述分区一固定有抗igm抗体；所述分区二固定有抗igg抗体；所述分区三固定有sars-cov-2抗原；所述试剂存储区中贮存有经标记物标记的sars-cov-2抗原。可选地，分区三固定的sars-cov-2抗原和试剂存储区中贮存的经标记物标记的sars-cov-2抗原分别独立的包括棘突蛋白、核衣壳蛋白、包膜蛋白和膜蛋白中的一种或多种。可选地，所述抗igm抗体来源和所述抗igg抗体来源分别独立包括人、猫、牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、猴、大鼠、小鼠、狗、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭或鹅。可选地，所述抗igm抗体和所述抗igg抗体分别独立的包括抗哺乳动物源抗原抗体；可选地，所述哺乳动物源包括人源、猴源、狗源、猫源、大鼠源或小鼠源。可选地，所述抗igm抗体和所述抗igg抗体的来源分别独立的包括抗人源抗原抗体；抗人igm抗体包括鼠抗人igm抗体、羊抗人igm抗体、兔抗人igm抗体或牛抗人igm抗体；和/或，抗人igg抗体包括鼠抗人igg抗体、羊抗人igg抗体、兔抗人igg抗体或牛抗人igg抗体。可选地，所述标记物包括纳米金颗粒、纳米磁颗粒、荧光素、荧光微球、量子点、生物素、酶类标记物或化学发光基团；可选地，所述酶类标记物包括辣根过氧化物酶或碱式磷酸酶。可选地，所述sars-cov-2检测芯片按照如下方式判读结果：所述检测芯片依据分区一固定的抗igm抗体和分区二固定的抗igg抗体分别独立的与抗原的结合情况判定检测结果，所述分区三用于辅助判定检测结果。可选地，所述抗igm抗体以阵列式分布于分区一；和/或，所述抗igg抗体以列阵式分布于分区二；和/或，所述sars-cov-2抗原以阵列式分布于分区三；可选地，固定抗体和sars-cov-2抗原的载体材料包括单晶硅、玻璃、金膜、硝化纤维、亲水性聚合物薄膜、多孔材料或树脂；可选地，所述树脂包括聚苯乙烯、氟化聚乙烯、聚阳离子树脂或硝化纤维树脂；可选地，在检测区域的流出方向还设置有废液区和排气孔。根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种非诊断和治疗目的的检测sars-cov-2的方法，包括使用所述sars-cov-2检测芯片检测待测样本。根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述sars-cov-2检测芯片在制备用于检测sars-cov-2的产品中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的sars-cov-2检测芯片，检测的目标物质包括sars-cov-2的igm抗体和igg抗体。该sars-cov-2检测芯片通过检测芯片上是否结合了标记物，可以确定样本中是否存在sars-cov-2的igm抗体和igg抗体。同时该检测芯片集成了抗体-抗原夹心原理技术和双抗原夹心原理技术对igm抗体和igg抗体进行检测，其中抗体-抗原夹心原理技术检测灵敏度较高，双抗原夹心原理技术检测特异性更强，两者结合可以有效保证检测的灵敏度和特异性。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明提供的sars-cov-2检测芯片检测原理图；图2为本发明实施例1提供的不同抗体浓度的包被斑点形貌图；图3为本发明实施例1提供的sars-cov-2检测芯片结构示意图。图标：200-检测芯片的基体；210-检测区；211-分区一；212-分区二；213-分区三；220-试剂存储区；230-进样孔；240-废液区；250-排气孔。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。根据本发明的一个方面，本发明提供了一种新型冠状病毒(sars-cov-2)检测芯片，所述sars-cov-2检测芯片包括试剂存储区和检测区；所述检测区包括分区一、分区二和分区三；所述试剂存储区位于进样孔和检测区之间。分区一上固定抗igm抗体，可以特异性结合待测样品中的新型冠状病毒igm抗体，并与经标记物标记的新型冠状病毒抗原反应形成夹心结构。分区二上固定抗igg抗体，可以特异性结合待测样品中的新型冠状病毒igg抗体，并与经标记物标记的新型冠状病毒抗原反应形成夹心结构。分区三上固定新型冠状病毒抗原，可以特异性结合待测样品中的新型冠状病毒的igm和igg抗体，然后与修饰有标记物的新型冠状病毒抗原反应形成夹心结构。试剂存储区中贮存经标记物标记的新型冠状病毒抗原，待测样品先流经所述试剂存储区，若待测样本中存在能够与新型冠状病毒抗原结合的抗体，则抗体通过与新型冠状病毒抗原结合被标记物标记，再流经分区一、分区二和分区三，具体的：若待检测的样品中存在新型冠状病毒的igm抗体，则igm抗体与试剂存储区中贮存的经标记物标记的新型冠状病毒抗原结合，然后与分区一中固定的抗igm抗体结合，使分区一中显示出新型冠状病毒抗原上标记的标记物；若存在未与分区一中固定的抗igm抗体充分结合的igm抗体，则余量的igm抗体与分区三中的新冠病毒抗原结合，使分区三显示出型冠状病毒抗原上标记的标记物。若待检测的样品中存在新型冠状病毒的igg抗体，则igg抗体与试剂存储区中贮存的经标记物标记的新型冠状病毒抗原结合，然后与分区二中固定的抗igg抗体结合，使分区二中显示出新型冠状病毒抗原上标记的标记物；若存在未与分区二中固定的抗igg抗体充分结合的igg抗体，则余量的igg抗体与分区三中的新冠病毒抗原结合，使分区三显示出型冠状病毒抗原上标记的标记物。新型冠状病毒检测芯片原理参见图1。通过检测芯片上是否结合了标记物，并对各区域标记物信号分析，可以确定样本中是否存在新型冠状病毒igm和igg抗体。新冠感染前期，机体会产生抗新冠病毒的igm抗体，达到峰值后igm抗体在血液中的含量降低。igg抗体的产生相比igm抗体产生较晚，但是持续时间比较长，因此检测igm抗体和igg抗体具有不同的临床意义。同时检测igm抗体和igg抗体，能够达到检测待测样本是否感染有新型冠状病毒的目的。本发明提供的新型冠状病毒检测芯片，集成了抗体-抗原夹心原理技术和双抗原夹心原理技术对igm和igg抗体进行检测。其中抗体-抗原夹心原理技术检测灵敏度较高，双抗原夹心原理技术检测特异性更强，两者结合可以有效保证检测的灵敏度和特异性。需要说明的是，本文中“新型冠状病毒”、“新冠病毒”和“sars-cov-2”均指severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2。本文中涉及的“分区一”、“分区二”和“分区三”只是用于将不同的分区加以区分，不能理解为对不同的分区的位置或重要程度的排序。可以理解的是，所述sars-cov-2检测芯片除去上述三个分区，还可以设置其他分区，例如固定有抗其他种类抗体的抗体，例如固定抗iga抗体，以结合待测样品中的iga抗体等，本发明对此不作限制。分区一、分区二和分区三可以按照顺序排列，也可以不按照顺序排列，在一些具体的实施方式中，按照远离试剂存储区的方向依次为分区一、分区二和分区三。分区三固定的sars-cov-2抗原和试剂存储区中贮存的经标记物标记的sars-cov-2抗原可以为但不限于为来源于sars-cov-2的天然蛋白或多肽，或经过本领域可接受的经分子生物学改造的重组蛋白或多肽，或含有蛋白或多肽成分的具有抗原作用的物质。在一些可选的实施方式中，分区三固定的sars-cov-2抗原和试剂存储区中贮存的经标记物标记的sars-cov-2抗原分别独立的包括棘突蛋白(s蛋白)、核衣壳蛋白(n蛋白)、包膜蛋白(e蛋白)和膜蛋白(m蛋白)中的一种或多种。在一些可选的实施方式中，所述抗igm抗体来源和所述抗igg抗体来源分别独立包括人、猫、牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、猴、大鼠、小鼠、狗、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭或鹅。在一些可选的实施方式中，所述抗igm抗体和所述抗igg抗体分别独立的包括抗哺乳动物源抗原抗体，其中哺乳动物源包括但不限于人源、猴源、狗源、猫源、大鼠源或小鼠源等。可以理解的是，用于检测不同物种的sars-cov-2检测芯片，其固定的抗igm抗体和抗igg抗体相应的为抗待检测物种抗体。在一些具体的实施例中，检测芯片的待测样品的物种来源为人，例如当检测芯片用于检测人是否被sars-cov-2感染时，则检测芯片上固定的抗igm抗体和抗igg抗体为抗人源抗体。在另一些实施例中，当检测芯片用于在实验室中检测实验小鼠或大鼠是否产生sars-cov-2抗体时，则检测芯片上固定的抗igm抗体和抗igg抗体为抗鼠源抗体。在一些优选的实施方式中，所述sars-cov-2检测芯片用于检测人源待测样品，所述抗igm抗体和所述抗igg抗体的来源分别独立的包括抗人源抗原抗体。抗人igm抗体包括但不限于鼠抗人igm抗体、羊抗人igm抗体、兔抗人igm抗体或牛抗人igm抗体。抗人igg抗体包括但不限于鼠抗人igg抗体、羊抗人igg抗体、兔抗人igg抗体或牛抗人igg抗体。试剂存储区中贮存有标记的sars-cov-2抗原，标记的标记物包括本领域可接受的用于标记在抗原上的可被检测的物质，包括但不限于纳米金颗粒、纳米磁颗粒、荧光素、荧光微球、量子点、生物素、酶类标记物或化学发光基团，其中酶类标记物的实例包括但不限于包括辣根过氧化物酶或碱式磷酸酶。抗igm抗体、抗igg抗体和sars-cov-2抗原固定于相应的分区时，可采用本领域常规的固定方式，例如将上述几种试剂喷涂在载体上，或在载体上采用划线的方式固定抗体和抗原。在一些优选的实施方式中，所述抗igm抗体以阵列式分布于分区一；和/或，所述抗igg抗体以列阵式分布于分区二；和/或，所述sars-cov-2抗原以阵列式分布于分区三。其中“阵列式”指的是将各试剂喷涂于载体上形成斑点，各斑点排列成阵列。“斑点”的形状可以为规则的形状或不规则的形状，阵列中的行和列的数量为大于等于1的正整数。在一些可选的实施方式中，所述抗igm抗体和所述抗igg抗体分别独立的以至少100μg/ml的浓度固定于检测区，优选为100～200μg/ml，例如可以为但不限于为100μg/ml、120μg/ml、150μg/ml、170μg/ml或200μg/ml。所述sars-cov-2检测芯片中除去主要起到检测作用的分区一、分区二、分区三和试剂存储区，还包括本领域中检测芯片的其他常规部分，包括但不限于进样孔、废液区、排气孔、检测芯片的支撑结构和盖体等的至少一种。分区一、分区二和分区三组成了检测芯片的检测区域，检测区域中固定抗体和sars-cov-2抗原的载体材料包括但不限于单晶硅、玻璃、金膜、硝化纤维、亲水性聚合物薄膜、多孔材料或树脂，树脂材料的实例包括但不限于聚苯乙烯、氟化聚乙烯、聚阳离子树脂或硝化纤维树脂。所述检测芯片依据分区一固定的抗igm抗体和分区二固定的抗igg抗体分别独立的与抗原的结合情况判定检测结果，所述分区三用于辅助判定检测结果。在一些优选的实施方式中，参照如下方式对检测结果进行判定：当sars-cov-2检测芯片用于检测待测样本是否感染sars-cov-2时，根据标记物产生的信号强弱情况，三个分区分别会出现三种结果，强阳性(++)，弱阳性(+)，阴性(-)，总共有可能会出现27种检测结果。针对这27种检测结果，可参照下表对结果进行判读：表1其中，分区一、分区二和分区三的三栏中的“+”表示弱阳性，“++”表示强阳性，“-”为阴性；感染判断一栏中“+”表示阳性，即待检测样品感染sars-cov-2；“-”表示阴性，即待检测样品未感染sars-cov-2。弱阳性和强阳性的判断标准如下：若采用检测抗原上的标记物的信号强度来判断是否存在标记物，则弱阳性指斑点信号小于饱和信号的10％强度，强阳性指斑点信号大于饱和信号的10％强度；若采用通过颜色判断是否存在标记物，则通过颜色深浅区分强阳性和弱阳性，例如对于胶体金斑点，弱阳性指淡红色斑点，强阳性指深红色斑点。igm和igg联合检测在临床上具有重要意义。对于新冠核酸检测阴性的患者：若igm、igg抗体检测均阴性，提示无感染者或感染潜伏期，需询问接触史；若igm抗体检测阳性，igg抗体检测阴性，提示存在干扰致结果假阳性或感染急性期，核酸结果假阴性，需结合胸部ct诊断；若igm抗体检测弱阳性，igg抗体检测阴性，提示干扰致结果假阳性或初次感染病毒载量极低并处于早期，结合胸部ct诊断；若igm抗体检测阴性，igg抗体检测阳性，提示既往感染，病毒已清除，处于恢复期或已康复，igg可在体内长期存在，结合胸部ct排除；若igm、igg抗体检测均阳性，提示近期感染，核酸结果假阴性，结合胸部ct诊断或提示处于恢复期，igm尚未消失。对于新冠核酸检测阳性的患者：若igm、igg抗体检测均阴性，提示感染“窗口期”，体内尚未产生抗体，或免疫抑制剂治疗、免疫缺陷性疾病导致不产生抗体；若igm抗体检测阳性，igg抗体检测阴性，提示感染早期，igm可以在症状发生3～5天后产生；若igm抗体检测阴性，igg抗体检测阳性，提示感染中晚期且病毒尚未清除；若igm、igg抗体检测均阳性，提示感染症状期，或感染活跃期，或再次复发感染。在一些可选的实施方式中，所述sars-cov-2检测芯片可以实现上述判读，对临床新型冠状病毒的诊断具有重要意义。根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种非诊断和治疗目的的检测sars-cov-2的方法，该方法包括使用所述sars-cov-2检测芯片检测待测样品。本发明所述的非诊断和治疗目的的检测sars-cov-2，包括但不限于实验室中检测待测样本中是否存在sars-cov-2或sars-cov-2的抗原，例如在制备sars-cov-2感染动物模型时，使用sars-cov-2检测芯片判断动物模型是否感染；或当使用小鼠或大鼠制备sars-cov-2抗体时，检测动物体内是否产生sars-cov-2抗体等。采用sars-cov-2检测芯片检测待测样本，特异性和灵敏度高，且操作简单，用时短。根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述sars-cov-2检测芯片在制备用于检测sars-cov-2的产品中的应用。所述用于检测sars-cov-2的产品除去含有sars-cov-2检测芯片，还可以包括但不限于配套试剂或检测仪器等。下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。实施例1本实施例提供了一种sars-cov-2检测芯片。制备材料包括：鼠抗人igm抗体，采购于松天盛科生物有限公司，货号为s-11gm1。鼠抗人igg抗体，采购于松天盛科生物有限公司，货号为s-11gg1。重组新型冠状病核衣壳蛋白(n蛋白)，采购于菲鹏生物科技生物有限公司，货号为ncov-ps-ag7。标记有胶体金的重组新型冠状病核衣壳蛋白(n蛋白)。常规试剂均为市售品。(1)包被抗体浓度选择采用点样仪在聚苯乙烯基材的微通道中的检测区进行点样包被不同浓度鼠抗人igm抗体，抗体浓度分别为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml和25μg/ml，然后通过显微镜观察包被点的形貌，如图2所示。200μg/ml和100μg/ml浓度的抗体的形貌可以呈现比较好的圆斑。而当包被抗体浓度降低，点样点圆斑会逐渐的收缩，形成不规则的图案。主要原因是包被液中的抗体含量不足时，由于水溶液的表面张力，导致点样点基材表面发生收缩。因此，选择200μg/ml作为抗体的包被浓度。(2)生物芯片表面修饰采用微量点样仪，在聚苯乙烯基材的微通道中的检测区210的分区一211表面点上采用碳酸盐缓冲液配制的鼠抗人igm抗体溶液(200μg/ml)4×4斑点阵列；分区二212表面点上采用碳酸盐缓冲液配制的鼠抗人igg抗体溶液(200μg/ml)4×4斑点阵列；分区三213表面点上采用碳酸盐缓冲液配制的重组新型冠状病毒n蛋白(200μg/ml)4×4斑点阵列。然后放置于2-8℃的干燥环境中，存储2个小时。然后采用含有5％的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液进行封闭，之后用含有0.1％吐温20的磷酸盐缓冲液把封闭液冲洗掉，最终基材放置在2-8℃干燥环境保存。(3)芯片组装分区一211、分区二212和分区三213构成检测芯片的检测区210，将标记有胶体金的重组新型冠状病毒n蛋白的干粉，添加到微通道的进样孔230旁的试剂存储区220，添加量为20μg。然后基材上覆盖一层聚苯乙烯盖片，并与基材粘贴为一体，形成两端开口，中间封闭的微通道结构，构成检测芯片的基体200，微通道结构原理进样孔230的一侧还设置有废液区240和排气孔250，如图3所示。实施例2新型冠状病毒样本检测(sars-cov-2)检测。收集10例新型冠状病毒样本，其中7例样本为阳性样本，3例样本为阴性样本，采用实施例1提供的sars-cov-2检测芯片进行检测。取150μl样本溶液加入到芯片的进样孔230，依靠毛细作用，样本溶液会流经试剂存储区220，溶解试剂存储区的标记有胶体金的重组新型冠状病毒n蛋白的冻干粉。之后，溶液继续沿着微通道向前流动，依次进入检测区210的分区一211、分区二212和分区三213。当样本中同时含有新型冠状病毒igm和igg抗体时，则会在三个分区留下红色斑点阵列；当样本中只含有新型冠状病毒igm抗体时，则只会在检测区210的分区一211和分区三213留下红色斑点阵列；当样本中只含有新型冠状病毒igg抗体时，则只会在检测区210的分区二212和分区三213留下红色斑点阵列；当样本中不含有新型冠状病毒igm和igg抗体时，则检测区的三个分区不会留下红色斑点阵列。根据斑点阵列的颜色强弱，可以分为强阳性(++)和弱阳性(+)。10例样本的分区检测结果和感染判定如表2所示。从检测结果可以看出，感染判定结果和样本实际情况相符度为100％，也就说检测的灵敏度和特异性都为100％。对于样本5，其分区二212(新型冠状病毒igg抗体)检测为弱阳性，如果不参考分区三213的检测，那么很有可能判定为感染阳性，这与实际情况不相符。对于样本9，其分区一211(新型冠状病毒igm抗体)检测为弱阳性，如果不参考分区三213的检测，那么很有可能判定为感染阳性，这与实际情况不相符。所以，通过对三个分区的综合判定，可以有效提升检测的准确。表2样本编号样本类型分区一分区二分区三感染判定1阳性+++++++2阳性+-+++3阳性+++++++4阴性----5阴性-+--6阳性-+++7阳性++-++8阳性++++-+9阳性+++++10阴性+---其中，分区一、分区二和分区三的三栏中的“+”表示弱阳性，“++”表示强阳性，“-”为阴性；感染判定一栏中“+”表示阳性，即待检测样品感染sars-cov-2；“-”表示阴性，即待检测样品未感染sars-cov-2。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12