小反刍兽疫检测试剂盒的制作方法

本发明涉及小反刍兽疫检测试剂盒。属于兽用生物制品领域。

背景技术：

小反刍兽疫(pestedespetitsruminants，ppr)俗称“羊瘟”，又名小反刍兽假性牛瘟(pseudorinderpest)、肺肠炎(pneumoenteritis)、口炎肺肠炎复合症(stomatitis-pneumoenteritiscomplex)，是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性病毒性传染病，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征。是世界动物卫生组织(oie)规定的必须报告动物疫病，严重危害小反刍类动物及家畜，据fao推测，全球约有62.5％的小反刍动物受到兽疫威胁。畜牧业是我国农村经济的支柱产业，年均养羊量达5.6亿只。小反刍兽疫是严重危害我国养羊业的一类烈性传染病，于2007年首次传入我国西藏阿里地区，2013-2014年先后在我国22个省261个县暴发250余起小反刍兽疫情，发病率100％，死亡率80％以上，由于防控技术和产品匮乏，造成巨大的经济损失。截至目前，我国尚无成熟的小反刍兽疫诊断试剂申报注册，基本依靠进口诊断试剂。

面对ppr流行和蔓延的严峻形势，针对ppr病原诊断检测技术等关键技术问题进行了联合技术攻关，技术上取得了突破，获得单克隆抗体杂交瘤细胞，并以其为基础开发出了经济实用、特异性强、敏感性高的抗原和抗体试剂盒，将有助于改善当前小反刍兽疫检测技术缺乏的问题，并带来为我国养羊业带来显著的经济和社会效益。

技术实现要素：

根据上述本领域的需求和不足，本发明的目的在于提供一种灵敏度好、特异性强、效价高的小反刍兽疫病毒h蛋白的单克隆抗体，将其与相关试剂组装成检测试剂盒用于检测小反刍兽疫病毒抗原或小反刍兽疫病毒抗体。

本发明的技术方案

1.小反刍兽疫检测试剂盒，其特征在于该试剂盒是由小反刍兽疫病毒h蛋白的单克隆抗体及其配套试剂组装而成；

所述小反刍兽疫病毒h蛋白的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株分泌而得，该细胞株被命名为小反刍兽疫病毒h蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，并已于2020年04月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmccno.19663。

2.本发明所述小反刍兽疫检测试剂盒，其特征在于所述的小反刍兽疫病毒h蛋白的单克隆抗体和酶标板及其配套试剂组装成用于检测小反刍兽疫病毒。

3.所述小反刍兽疫检测试剂盒，其特征在于所述的小反刍兽疫病毒h蛋白的单克隆抗体和酶标板及其配套试剂组装成用于检测小反刍兽疫病毒抗体。

4.本发明所述小反刍兽疫检测试剂盒，其特征在于所述的小反刍兽疫病毒h蛋白的单克隆抗体经胶体金标记后包被在金标纤维垫上，检测区包被有兔抗小反刍兽疫病毒多抗，检测时，当样本中存在小反刍兽疫病毒时，则与单克隆抗体形成抗原抗体复合物，进而与检测区的兔抗小反刍兽疫病毒多抗结合、显色。

5.本发明所述小反刍兽疫检测试剂盒，其特征在于所述的小反刍兽疫病毒h蛋白的单克隆抗体经胶体金标记后包被在金标纤维垫上，检测区包被有小反刍兽疫病毒纯化抗原，对照区包被羊抗鼠二抗。检测时，当样本中存在小反刍兽疫病毒抗体，则小反刍兽疫病毒抗体可抑制胶体金标记的单克隆抗体与小反刍兽疫病毒纯化抗原的结合，显色变浅或消失。

本发明是通过以下步骤实施的。

1.小反刍兽疫病毒的h蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的培育

本发明是以原核表达小反刍兽疫病毒h蛋白，纯化后作为免疫抗原，免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，再使用小反刍兽疫病毒vero细胞培养物经差速离心浓缩灭活后，作为检测抗原用于筛选单克隆抗体的策略。再通过进一步亚克隆，筛选出一株针对小反刍兽疫病毒的h蛋白单克隆抗体，及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞被命名为小反刍兽疫病毒h蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，并已于2020年04月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为cgmccno.19663。

2.单克隆抗体的制备

由上述杂交瘤细胞株分泌的小反刍兽疫病毒h蛋白的单克隆抗体，，经一定工艺纯化得到，该单克隆抗体能特异性的结合小反刍兽疫病毒h蛋白。

3.本发明所述小反刍兽疫病毒h蛋白的单克隆抗体的应用

(1)用于检测小反刍兽疫病毒和/或抗体的检测试剂盒：用本发明所述的小反刍兽疫病毒h蛋白单克隆抗体与酶标板和配套试剂制备组装成检测小反刍兽疫病毒和/或抗体的酶联免疫检测试剂盒。

1)小反刍兽疫病毒抗原酶联免疫检测试剂盒

使用双抗体夹心法检测标本中的小反刍兽疫病毒的抗原。先在试剂盒的聚乙烯微孔板条上预包被羊抗小反刍病毒蛋白的多克隆抗体，当裂解后的小反刍兽疫病毒加到微孔后，预包被的多克隆抗体能将其捕获，随后加入的酶标单克隆抗体与之结合，然后通过酶催化底物的显示程度来判断结果。当标本中不含小反刍兽疫病毒抗原或不是小反刍兽疫病毒时，底物不会显色。该试剂盒可检测的标本包括动物排泄物、口鼻腔分泌物、鸡胚培养的完整病毒或裂解病毒等。

2)小反刍兽疫病毒抗体酶联免疫检测试剂盒

使用竞争法检测血清标本中的小反刍兽疫病毒抗原特异性抗体。先在试剂盒的聚乙烯微孔板上预包被小反刍兽疫病毒纯化抗原。如果加入的血清标本能明显抑制酶标单克隆抗体与抗原的结合，则表明标本中含小反刍兽疫病毒抗原的特异性抗体。当标本中不含小反刍兽疫病毒抗体或不是小反刍兽疫病毒抗体时，就不会抑制酶标单克隆抗体与抗原的结合，显色越深，反之显色越浅。

(2)用于检测小反刍兽疫病毒和/或抗体的胶体金试剂盒：

本发明免疫胶体金试剂盒采用胶体金免疫层析技术研制的新一代诊断试剂，本发明胶体金试剂盒操作简便、可靠、无需仪器设备，自带质控对照，不需要任何附加试剂，显示结果明确，反应迅速，整个操作时间仅需数分钟。

1)病毒检测：将胶体金标记的小反刍兽疫病毒单克隆抗体包被金标纤维垫上，试纸条检测区包被有兔抗小反刍兽疫病毒多抗，组装成用于检测小反刍兽疫病毒的胶体试剂盒。检测时，当样本中存在小反刍兽疫病毒，则与胶体金标记的小反刍兽疫病毒单克隆抗体结合形成抗原抗体复合物，进而与检测区多克隆抗体结合，显色。

本发明检测小反刍兽疫病毒胶体金试剂盒金标法分别在胶体金试纸条的硝酸纤维素膜上检测区包被兔抗小反刍兽疫病毒的多克隆抗体，对照区包被羊抗鼠二抗。检测时样品中小反刍兽疫病毒与胶体金标记的小反刍兽疫病毒单克隆抗体形成抗原抗体复合物，由于层析作用该复合物沿膜移动，与检测区包被的多克隆抗体结合形成复合物，与对照线包被的二抗结合形成二抗复合物。如为阳性样品，则可分别在检测区及对照区各形成一条红色线；如为阴性样品，则只在对照区形成一条红色线。该试剂盒可用于检测小反刍类动物的排泄物、口鼻腔分泌物及粪便中是否含有小反刍兽疫病毒。

2)抗体检测：将胶体金标记的小反刍兽疫病毒单克隆抗体包被金标纤维垫上，检测区包被有小反刍兽疫病毒纯化抗原，对照区包被羊抗鼠二抗，组装成用于检测病毒抗体的胶体试剂盒。检测时，当样本中存在小反刍兽疫病毒抗体，则小反刍兽疫病毒抗体抑制胶体金标记的小反刍兽疫病毒单克隆抗体与小反刍兽疫病毒纯化抗原结合，检测区无色或颜色明显变浅，而对照区对二抗与胶体金标记的小反刍兽疫病毒单克隆抗体结合，显色。

本发明检测小反刍兽疫病毒抗体的胶体金试剂盒金标法分别在胶体金试纸条的硝酸纤维素膜上检测区包被小反刍兽疫病毒纯化抗原，对照区包被羊抗鼠工二抗，检测时，样品中的抗体与胶体金标记的小反刍兽疫病毒单克隆抗体竞争性与检测区包被的小反刍兽疫病毒纯化抗原结合。如果加入的样品能明显抑制胶体金标记的小反刍兽疫病毒单抗与纯化抗原的结合，则表明标品中含小反刍兽疫病毒的特异性抗体。当标本中不含小反刍兽疫病毒抗体或不是小反刍兽疫病毒抗体时，就不会抑制这种的结合，检测线的颜色越深，反之颜色越浅。即检测样品为阳性，则只在对照区形成一条红色线；如为阴性样品，则可分别在检测区及对照区各形成一条红色线。该试剂盒可用于检测羊等小反刍动物血清中是否含有小反刍兽疫病毒抗体。

本发明新的技术效果

本发明涉及小反刍兽疫检测试剂盒，其检测试剂盒中的主要组分——单克隆抗体为针对小反刍兽疫病毒h蛋白的抗体，具有特异性好、敏感性强、效价高等优点。所述小反刍兽疫病毒单克隆抗体与其不同配套试剂组装成的可用于研制和生产小反刍兽疫病毒或其抗体检测用免疫学检测试剂盒，如酶联、胶体金免疫试纸条等。本发明涉及的试剂盒可以用于检测样品中是否存在小反刍兽疫病毒或小反刍兽疫病毒抗体、用于鉴定待测病毒是否为小反刍兽疫病毒、待检测动物是否感染小反刍兽疫病毒或者鉴定血清中是否含有小反刍兽疫病毒抗体等。本发明所试剂盒灵敏特异，快速方便经济实惠，易于推广普及可用于大规模的监测系统中应用和现场检测。

附图说明

图1小反刍兽疫病毒h蛋白的表达与纯化图中1.marker，2.ppr-hsq，3.ppr-h沉淀，4.ppr-h第一次尿素洗脱上清，6.ppr-h第二次尿素洗脱上清，8ppr-h第三次尿素洗脱上清。

图2小反刍兽疫病毒胶体金检测试纸条检测结果判定示意图

图3小反刍兽疫病毒抗体胶体金检测试纸条检测结果判定示意图

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品，均落在本发明的保护范围之内。

本发明的试剂的浓度、温度和其他变量的值只是举例说明本发明的应用，而不构成对本发明的限制。

本发明实验材料的来源

生物材料

免疫抗原为小反刍兽疫病毒h蛋白，参照ncbi的公布的小反刍兽疫病毒h蛋白抗原的核苷酸序列，由本实验室选取其中n末端抗原决定簇较为集中区域，经密码子优化后人工合成序列(序列1)，克隆到pet28a(+)表达载体后，转化大肠杆菌transettade3进行表达，将表达产物纯化后，作为免疫抗原。

检测抗原为小反刍兽疫病毒浓缩抗原，选用的毒种为clone9疫苗株，简称疫苗株，由中国兽医微生物菌种保藏中心提供(该株病毒已于2016年12月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号分别为：cgmccno.13388)。选用疫苗株主要出于生物安全风险考虑，同时也具有很好的代表性，并在检测效果中得到良好证明。

实施例

以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。

实施例1——小反刍兽疫病毒h蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞的制备

1.小反刍兽疫病毒h蛋白的表达与纯化

参照ncbi的公布的小反刍兽疫病毒h蛋白抗原的核苷酸序列，由本实验室选取其中n末端抗原决定簇较为集中区域，经密码子优化后人工合成序列(序列1)，经双酶切定向克隆到pet28a(+)表达载体的目标位点后，转化大肠杆菌transettade3进行原核表达。h蛋白的表达方式为包涵体形式表达，对包涵体提纯和洗涤纯化后，4％尿素复溶后，再梯度透析，得到可溶性的h蛋白。经浓度测定后，用于免疫小鼠。

序列1

2.小反刍兽疫病毒繁殖与纯化

小反刍兽疫病毒clone9疫苗株接种生长良好的vero细胞，5％co2，37℃培养2～3天后，约50％细胞发生病变时收获病毒。冻融两次后，经超声波间歇裂解3min，采用差速离心法纯化病毒，即先8000r/min离心5min后，取上清30000r/min高速离心3h，收集沉淀，即为小反刍兽疫病毒浓缩液。使用含40％蔗糖的te溶液复溶后，2～8℃震荡1h充分复溶，再次30000r/min高速离心3h，收集沉淀，即为病毒纯化液。

3.多克隆抗体的制备

将小反刍兽疫病毒纯化液经适度稀释后，与seppic1313佐剂等体积混合高速匀浆乳化成免疫抗原，采用背部皮下多点注射和腿部肌肉免疫相结合的方法免疫家兔。第一次免疫采用背部皮下多点免疫，免疫2周后采用前腿肌肉注射加强。此后间隔一周，采用后退肌肉注射免疫。最后一次免疫后10～13日采血检测，多克隆抗体效价采用琼脂扩散试验进行测定，琼扩效价达到1:4以上，即可心脏采血提取血清，用于试剂盒的制备。

4.单抗杂交瘤的制备

小鼠免疫：将h蛋白表达抗原纯化液与quickantibody佐剂混合乳化，经小鼠四肢肌肉多点注射，免疫剂量为每次0.1ml/只。首次免疫后21日采用相同剂量进行二次免疫，之后间隔1周免疫一次。第三次免疫后采血用h蛋白表达纯化抗原包被的elisa板检测抗体效价，取效价达到1:20000以上的小鼠用于细胞融合。

细胞融合：用不加佐剂的h蛋白表达抗原纯化液经腹腔注射对小鼠进行加强免疫。免疫后3～5日取小鼠脾脏细胞与sp20细胞进行融合。先把脾脏研磨得到脾细胞悬液，与培养良好的小鼠骨髓瘤细胞分别进行细胞计数，调整到适当浓度后按比例混合，经peg1500缓慢加入到细胞混合液中进行细胞融合，融合后的细胞重悬于含1％hat和20％fbs的dmem培养基，铺96孔细胞板，每只小鼠3～4块。于5％co2的二氧化碳培养箱37℃静置培养。融合后第4天，用含1％hat和20％fbs的dmem培养基半量换液；融合后第8天，用含1％ht和20％fbs的dmem培养基半量换液。

细胞筛选：融合后第10天，对细胞板逐孔进行细胞观察，取含有细胞的孔吸取上清，用于筛选检测。筛选方法为用小反刍兽疫病毒clone9株纯化病毒液进行包板，对细胞上清液进行elsia检测。将检出的阳性孔再次克隆和亚克隆,每次克隆后均取样进行elsia检测检测，直到细胞株分泌的抗体elisa滴度保持稳定即可。

筛选结果：获得一株可稳定分泌针对小反刍兽疫病毒h蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞。经扩大培养后，用细胞冻存液悬浮，分装冻存管，标记后置液氮中冻存，该细胞被命名为小反刍兽疫病毒h蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，并已于2020年04月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为cgmccno.19663。

5.单克隆抗体的制备与纯化

取液氮保存的稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，化冻后离心，用含20％fbs的dmem培养基重悬接种到48孔细胞板，5％co2的二氧化碳培养箱37℃静置培养。生长良好后，再转移至24孔板，再经45cm²细胞瓶扩大培养。收集细胞瓶内的细胞，经细胞计数后，调整细胞浓度，注射到小鼠腹腔内，10～14后从小鼠腹腔中吸取腹水。

上述腹水经10000r/min高速离心10min后，取上清，再用50％的硫酸铵沉淀，离心去上清，沉淀用20mm的磷酸盐缓冲液(ph＝7.2)重悬。再使用sephadexg25柱纯化脱盐和去脂，得到纯化后的单克隆抗体。

6.单克隆抗体效价的测定

由于目前还没有小反刍兽疫病毒的标准血清和标准抗原，本发明采用小反刍兽疫病毒clone9株纯化抗原液作为标准抗原，以10μg/ml浓度包被酶标板，用于测定单克隆抗体效价，结果显示小反刍兽疫病毒h蛋白单克隆抗体效价为2¹¹。

实施例2——小反刍兽疫病毒抗原酶联免疫检测试剂盒

1.酶标板的制备

使用包被液(碳酸盐缓冲液，ph＝9.6)将兔抗小反刍兽疫病毒的多克隆抗体进行适度稀释后，进行包板，每个样孔100μl，2～8℃包被12～24h，用洗涤液(0.01mol//l的pbs，ph＝7.4，含0.1％tween-20)洗涤两次后，再加入含3％bsa的pbs(0.01mol//l，ph＝7.4)封闭液37℃封闭2h。用5％的蔗糖的样品稀释液覆盖后晾干。抽空封装，置2～8℃保存。

2.配套试剂配制

(1)样品处理液

裂解液a(lb-a)：6％chaps，含2％tween20和1％tween80。

裂解液b(lb-b)：100mmpmsf的异丙醇溶液，使用时用pbs(0.01mol//l，ph＝7.4)稀释至工作终浓度(2mm)。

样品稀释液：0.01mol/l的pbs，ph＝7.4。

(2)酶标试剂

本研究采用过碘酸钠氧化法制备酶标单抗，具体步骤如下：称取5mghrp完全溶解于纯水中，溶液呈棕色，加入新鲜配制的0.06mol/l的naio4溶液，室温下避光搅拌30min，此时溶液由棕色变为深绿色；加入1ml新配的0.08mol/l乙二醇溶液[乙二醇:水(v/v)＝9:11]，室温下避光间歇震荡30min，溶液淡棕色。加入1ml含有5mg的纯化单克隆抗体溶液，室温避光搅拌2～3h。再加入0.2ml新鲜配制的硼氢化钠溶液(5mg/ml),混匀后置2～8℃静置2h。将制备好的酶标单抗溶液装入透析袋，于pbs(0.01mol/l，ph＝7.2)中透析过夜，即得到hrp标记的小反刍兽疫单克隆抗体，加入等体积甘油后，分装标记后，置-15℃以下保存备用。

(3)阳性对照，使用合适滴度的小反刍兽疫病毒作为阳性对照。

(4)阴性对照：以裂解液a为阴性对照。

(5)浓缩洗涤液(20×)：0.2mol/l的pbs，ph＝7.4，含2％tween-20。

(6)显示液：市售的显色a和显色b液(购自美国kpl)。

(7)终止液：1mol/lh2so4溶液。

3.检测步骤

(1)检测前准备

取20ml浓缩洗涤液用去离子水稀释至工作浓度，即400ml备用。对待检样品进行编号，并标记相应的检测孔，每次检测需应设阴、阳性对照孔和空白对照孔。

(2)样品处理与加样

当样品为液体时，如血液、组织液或分泌液等，取100μl的lb-a和4μl的lb-b混合均匀后，加入100μl的待检样品，充分混合后，取100μl加入到反应孔中。

当样品为固体(如组织块、粪便等)或棉拭子时，取1ml的lb-a和40μl的lb-b混合均匀后，再加入1ml样品稀释液，将0.1～0.2g碾碎的固体样品或棉拭子置于溶液中，室温间歇震荡30min后，8000r/min离心3min，取100μl上清液加入到反应孔中。

阴、阳性对照孔分别加入100μl对照溶液，空白对照孔不加液。

(3)孵育：密封后置微量振荡器上中速室温振荡60min或37℃反应30min后，弃反应液。

(4)洗板：每孔加入350μl洗涤液静置3min，反复洗涤3遍，或用洗板机震荡洗涤3遍。

(5)加酶分别在相应孔中加入酶标试剂。

(6)密封后置微量振荡器上中速室温振荡60min或37℃反应30min后，弃反应液。重复步骤(4)。

(7)显色：将显色a和显色b液等比例混合，每孔加入新鲜配制的显色液100μl，室温避光显色10min。

(8)测定吸光值，每孔加入100μl终止液终止反应，采用450nm(检测波长)/630nm(参考波长)双波长测定各孔od值。

(9)结果判定

当阴性对照孔吸光值≤0.1，阳性对照孔吸光值≥0.5时，试验成立，否则需重新试验。

临界值计算阴性对照孔值+0.15；

od值≥od阴性+0.15，判定样品小反刍兽疫抗原阳性；

od值＜od阴性+0.15，判定样品小反刍兽疫抗原阴性。

该试剂盒可灵敏、特异地检测的动物排泄物、口鼻腔分泌物、病毒培养物等样品中完整或裂解病毒抗原。

实施例3——小反刍兽疫病毒抗体酶联免疫检测试剂盒

1.酶标板的制备

使用包被液(碳酸盐缓冲液，ph＝9.6)将纯化后的小反刍兽疫病毒h蛋白大肠杆菌表达抗原进行适度稀释后包板，每个样孔100μl，2～8℃包被12～24h，用洗涤液(0.01mol/l的pbs，ph＝7.4，含0.1％tween-20)洗涤两次后，再加入含3％bsa的pbs(0.01mol/l，ph＝7.4)封闭液37℃封闭2h。用5％的蔗糖的样品稀释液覆盖后晾干。抽空封装，置2～8℃保存。

2.试剂盒其他成分的配置

(1)样品稀释液：0.01mol/l的pbs，ph＝7.4，含0.05％tween-20和5％马血清。

(3)单抗竞争液：使用样品稀释液，将纯化的单克隆抗体稀释适当浓度。

(3)酶标试剂：用稀释液将羊抗鼠酶标二抗稀释度合适浓度，即得酶标试剂。

(4)对照样品：使用合适滴度的羊抗小反刍兽疫的阳性血清作为阳性对照样品。使用小牛血清作为阴性对照样品。

(5)浓缩洗涤液(20×)：0.2mol/l的pbs，ph＝7.4，含2％tween-20。

(6)显示液：市售的显色a和显色b液(购自美国kpl)。

(7)终止液：1mol/lh2so4溶液。

3.检测步骤

(1)检测前准备

取20ml浓缩洗涤液又用去离子水稀释至工作浓度，即400ml备用。对待检样品进行编号，并标记相应的检测孔，每次检测需应设阴、阳性对照孔。

(2)样品处理与加样

取待检血清60μl，加入60μl的单抗竞争液，充分混合后，取100μl加入到反应孔中。如需测定待检血清滴度，则使用样品稀释液对待检血清一定比例倍比稀释后再进行检测。

将阴、阳性对照样品各取60μl，分别加入60μl的单抗竞争液，混匀后取100μl分别加入阴、阳性对照孔，

(3)孵育：密封后置微量振荡器上中速室温振荡60min或37℃反应30min后，弃反应液。

(4)洗板：每孔加入350μl洗涤液静置3min，反复洗涤3遍，或用洗板机震荡洗涤3遍。

(5)加酶分别在相应孔中加入100μl酶标试剂。

(6)密封后置微量振荡器上中速室温振荡60min或37℃反应30min后，弃反应液。重复步骤(4)。

(7)显色：将显色a和显色b液等比例混合，每孔加入新鲜配制的显色液100μl，室温避光显色10min。

(8)测定吸光值，每孔加入100μl终止液终止反应，采用450nm(检测波长)/630nm(参考波长)双波长测定各孔od值。

(9)结果判定

当阴性对照孔吸光值≥0.5，阳性对照孔吸光值≤0.1时，试验成立，否则需重新试验。

临界值：50％*阴性对照孔od值；

od值＞50％*od阴性，判定样品小反刍兽疫抗体阴性；

od值≤50％*od阴性，判定样品小反刍兽疫抗体阳性。

该试剂盒可灵敏、特异地检测的小反刍类动物血清中小反刍兽疫抗体。

实施例4——检测小反刍兽疫病毒的胶体金试剂盒金标法

本试剂盒分别在硝酸纤维素膜上检测区(t)包被兔抗小反刍兽疫多克隆抗体，对照区(c)包被兔抗鼠二抗。检测时样品中小反刍兽疫病毒与胶体金标记的h蛋白的单克隆抗体(au-mcab)形成抗原抗体复合物(au-mab-ag)，由于层析作用该复合物沿膜移动，与检测线包被的小反刍兽疫多抗(pab)结合形成复合物(au-mab-ag-pab)，与对照线包被的兔抗鼠二抗结合形成复合物(au-mab-ag-二抗或au-mab-二抗)。如为阳性样品，则可分别在检测区及对照区各形成一条红色线；如为阴性样品，则只在对照区形成一条红色线。

1.胶体金的制备

取1ml的1％的haucl4溶液加入盛有100ml去离子水的试剂瓶中，加热至沸腾，迅速加入的5ml柠檬酸三钠溶液，继续加热，待溶液呈现出透明的葡萄酒红色，冷却后并置于2～8℃避光保存备用。

2.胶体金结合物垫的制备

用制备好的胶体金标记小反刍兽疫病毒h蛋白单抗，并均匀地喷在条状的玻璃纤维膜上，待其完全浸湿后，立即放在冻干机内冷冻干燥，取出后加干燥剂密封保存备用。

3.反应膜的制备

用喷膜机在硝酸纤维素膜上按照设定程序分别将兔抗鼠二抗和羊抗小反刍兽疫多抗作为对照线、检测线，并将其放置干燥箱内烘干，取出加干燥剂密封保存备用。

4.样品稀释液的制备

在1000ml的pbs(0.01mol/l,ph＝7.4)中加入1mltween-20，充分混匀后，用滤膜过滤除菌后分装。

5.试纸条制备

将样品垫、胶体金结合物垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在胶性背板上。用bio-dot切割机将粘贴好的胶性背板按照设定程序切成4mm宽的试纸条。将检验合格的试纸条，装入清洗干净的塑料外壳中并压紧，装入铝箔袋内，再放入干燥剂，再用连续封口机密封后，室温保存即可。

注意在组装、分装及封口的整个过程中要控制温度不超过30℃，湿度不超过30％。

6.试剂盒的组成、作用和用途

本试剂盒包括：30条试纸条、30支样品稀释液、30至采样棉签以及说明书1份，用于检测小反刍动物排泄物、口鼻腔分泌物及粪便中是否含有小反刍兽疫病毒。

7.使用方法与结果判定

(1)样品制备

用采样棉签蘸取排泄物、口鼻腔分泌物后，插入样品稀释液管内,充分混匀后静置备用。样品如不能现场检测，应贮藏在-15℃以下，样品的采集、运输需按国家规定进行。

(2)操作步骤

将试纸条从密闭的包装袋中取出，放于水平桌面上；用滴管吸取稀释好的样品，逐滴加入4滴样品到试纸条的样品孔内，静置20min，观察结果。

(3)结果判定

阳性：在c和t区出现平行的紫红色或红色线，表明样品中检测到小反刍兽疫病毒。

阴性：只在c区出现一条的紫红色或红色线，说明样品中未检测到小反刍兽疫病毒。

无效：试纸c区不出现任何线，说明检测失败，请更换新的进行检测。

本试纸条是采用胶体金免疫层析技术研制的新一代诊断试剂，可检测的标本包括动物排泄物、口鼻腔分泌物、细胞培养物中存在的小反刍兽疫完整病毒或裂解病毒。

实施例5——检测小反刍兽疫病毒抗体的胶体金试剂盒

本试剂盒分别在硝酸纤维素膜上检测区(t)包被小反刍兽疫纯化抗原，对照区(c)包被兔抗鼠二抗。检测时，样品中小反刍兽疫病毒抗体与胶体金标记的h蛋白的单克隆抗体(au-mcab)竞争性与检测区包被的小反刍兽疫病毒纯化抗原结合。如果样品能明显抑制胶体金标记单抗与小反刍兽疫病毒纯化抗原结合，则表明样品中含有小反刍兽疫病毒的特异性抗体。当样品中不含小反刍兽疫病毒抗体时，则不会抑制该种结合，检测区的颜色越深，反之颜色越浅。如为阳性样品，则只在对照区形成一条红色线；如为阴性样品，则可分别在检测区及对照区各形成一条红色线。

1.胶体金的制备

取1ml的1％的haucl4溶液加入盛有100ml去离子水的试剂瓶中，加热至沸腾，迅速加入的5ml柠檬酸三钠溶液，继续加热，待溶液呈现出透明的葡萄酒红色，冷却后并置于2～8℃避光保存备用。

2.胶体金结合物垫的制备

用制备好的胶体金标记小反刍兽疫病毒h蛋白单抗，并均匀地喷在条状的玻璃纤维膜上，待其完全浸湿后，立即放在冻干机内冷冻干燥，取出后加干燥剂密封保存备用。

3.反应膜的制备

用喷膜机在硝酸纤维素膜上按照设定程序分别将兔抗鼠二抗和小反刍兽疫病毒抗原作为对照线、检测线，并将其放置干燥箱内烘干，取出加干燥剂密封保存备用。

4.样品稀释液的制备

在1000ml的pbs(0.01mol/l,ph＝7.4)中加入1mltween-20，充分混匀后，用滤膜过滤除菌后分装。

5.试纸条制备

将样品垫、胶体金结合物垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在胶性背板上如图。用bio-dot切割机将粘贴好的胶性背板按照设定程序切成4mm宽的试纸条。将检验合格的试纸条，装入清洗干净的塑料外壳中并压紧，装入铝箔袋内，再放入干燥剂，再用连续封口机密封后，室温保存即可。

注意在组装、分装及封口的整个过程中要控制温度不超过30℃，湿度不超过30％。

6.试剂盒的组成、作用和用途

本试剂盒包括：30条试纸条、30支样品稀释液以及说明书1份，用于检测小反刍动物排泄物、口鼻腔分泌物及粪便中是否含有小反刍兽疫病毒。

7.使用方法与结果判定

(1)样品制备

采集血样，分离血清备用。血清样品如不能现场检测，应贮藏在-15℃以下，样品的采集、运输需按国家规定进行。

(2)操作步骤

将试纸条从密闭的包装袋中取出，放于水平桌面上；用滴管吸取稀释好的样品，逐滴加入4滴样品到试纸条的样品孔内，静置20min，观察结果。

(3)结果判定

阳性：只在c区出现一条的紫红色或红色线，说明样品中检测到小反刍兽疫病毒抗体。

阴性：在c和t区出现平行的紫红色或红色线，表明样品中未检测到小反刍兽疫病毒抗体。

无效：试纸c区不出现任何线，说明检测失败，请更换新的进行检测。

本试纸条是采用胶体金免疫层析技术研制的新一代诊断试剂，可检测的标本包括小反刍动物血清中的小反刍兽疫病毒抗体。

序列表

<110>北京中海生物科技有限公司

<120>小反刍兽疫检测试剂盒

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>541

<212>dna

<213>小反刍兽疫病毒(peste-des-petits-ruminantsvirush蛋白核苷酸序列)

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