一种新的抑郁症生物标志物及其应用的制作方法
本公开属于生物技术领域，具体涉及一种肠道微生物、粪便代谢产物和/或其组合在抑郁症诊断中的应用，以及筛选抑郁症患者肠道生物标志物和/或抑郁症患者肠道生物标志物组的方法。
背景技术：
抑郁症是一种基因与环境交互影响的常见精神疾病。以显著而持久的心境低落与兴趣减少为主要临床特征，严重的甚至有自杀倾向。流行病学资料显示全球抑郁症的患病率约为4.4％，共有3.22亿抑郁症患者。在中国，抑郁症已经成为仅次于心脏病的第二大疾患。因此，加强抑郁症防治以及发病机制的研究迫在眉睫。既往抑郁症发病机制研究主要聚焦于各类脑内异常学说。这些脑内异常学说为揭示抑郁症的病理生理机制提供了重要的理论依据，但大都只能解释某些方面的原因。因此，抑郁症发病机制研究不应仅局限于丰富现有学说，需拓展研究思路，挖掘新的潜在机制。
人体肠道内有大量的共生微生物，其携带的基因信息总量是人自身基因组信息的50-100倍，即“肠道微生物组(gutmicorbiome)”，也被称为人类的“第二基因组”。肠道微生物组是人体最大、最直接的外环境，对维持人体健康发挥着不可或缺的作用。从2007年美国国立卫生研究院(nih)提出人体微生物组计划，到2016年美国政府斥资1.21亿美元启动“国家微生物组计划(nationalmicrobiomeinitiative，nmi)”，美国引领了肠道微生物组在营养障碍、代谢异常及复杂疾病(比如肥胖、糖尿病、炎性肠病及肿瘤等)的研究。
由于中枢神经系统与外周间存在血脑屏障，早期肠道微生物组是否影响脑功能与疾病存在争议，导致对其研究滞后其它系统疾病。2012年，cryan,j.f撰文指出肠道微生物组可通过微生物源代谢产物、细胞因子及免疫、迷走神经通路等反向影响脑的功能与行为，即“微生物-肠-脑轴”。这一概念的提出，不仅仅是对既往“脑-肠-微生物”轴的丰富与发展，更为揭示精神疾病的发病机制，筛选新的诊治靶点提供全新的切入点。其临床价值在于，一旦锁定导致精神疾病的关键肠道微生物(比如肠道细菌菌株，病毒及真菌)，可针对这些微生物及效应分子，开发出早期、靶向的诊治新策略，有望成为精神疾病防治的分水岭。
技术实现要素：
本公开要解决的技术问题是，如何提供一种抑郁症的生物标志物，以预测抑郁症发病以及发展的趋势，并应用于疾病病理分型的试剂盒的制备应用。
为了解决上述技术问题，需要筛选抑郁症相关的生物标志物，从而有助于揭示其潜在的病理生理机制，开发出早期、靶向的诊治方法。
本公开展示了一种新的抑郁症诊断生物标志物，并展现了这种标志物的应用方式。本公开通过将抑郁症患者以及健康对照的粪便进行高通量(全基因组)宏基因组测序及非靶向代谢组学检测，在抑郁症患者及正常人群的粪便中发现了一系列具有特异性的微生物(包括细菌、病毒)及代谢产物，并借助随机森林算法证实这种新的抑郁症生物标志物具有相当的鉴别诊断抑郁症的潜力。
基于上述研究发现，本公开提出了如下技术方案：
本公开提供一种抑郁症肠道生物标志物，所述肠道生物标志物包括肠道微生物和/或粪便代谢产物。
优选地，所述肠道微生物包括肠道细菌和/或肠道噬菌体。
优选地，所述肠道生物标志物包括肠道细菌、肠道噬菌体、粪便代谢物中的一种或多种，更优选地，所述肠道生物标志物包括肠道细菌、肠道噬菌体和粪便代谢物；
优选地，所述肠道细菌属于毛螺菌科(lachnospiraceae)、梭菌科(clostridiaceae)、类杆菌科(bacteroidaceae)、双歧杆菌科(bifidobacteriaceae)、韦荣氏球菌科(veillonellaceae)、真杆菌科(eubacteriaceae)、瘤球菌科(ruminococcaceae)、拟杆菌科(bacteroidaceae)、肠球菌科(enterococcaceae)、酸氨基球菌科(acidaminococcaceae)、颤螺旋菌科(oscillospiraceae)、肠杆菌科(enterobacteriaceae)、紫菜科(porphyromonadaceae)中一种或多种菌科的细菌；
优选地，所述肠道细菌属于blautia、梭菌属(clostridium)、拟杆菌属(bacteroides)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、韦荣球菌属(veillonella)、真杆菌属(eubacterium)、粪细菌属(faecalibacterium)、粪球菌属(coprococcus)、厌氧菌属(anaerostipes)、unclassified_o_bacteroidales、adlercreutzia、硬壁菌属(unclassified_p_firmicutes)、杆菌属(unclassified_c_bacilli)、瘤胃球菌属(ruminococcus)、dorea、肠球菌属(enterococcus)、phascolarctobacterium、faecalibacterium、subdoligranulum、oscillibacter、柠檬酸杆菌属(citrobacter)、克雷伯菌属(klebsiella)、副拟杆菌(parabacteroides)中一种或多种菌属的细菌；优选地，所述肠道细菌选自blautia_obeum、梭状芽孢杆菌cag:217(clostridium_sp._cag:217)、泰氏拟杆菌(bacteroides_thetaiotaomicron)、长双歧杆菌(bifidobacterium_longum)、veillonella_sp._cag:933、真细菌cag:202(eubacterium_sp._cag:202)、粪大肠杆菌cag:74(faecalibacterium_sp._cag:74)、真性粪球菌(coprococcus_eutactus)、厌氧菌(anaerostipes_hadrus)、unclassified_o_bacteroidales、粪类杆菌(bacteroides_stercoris)、粪类杆菌cag:120(bacteroides_stercoris_cag:120)、unclassified_g__bacteroides、adlercreutzia_equolifaciens、硬壁菌cag:227(firmicutes_bacterium_cag:227)、脆弱类杆菌(bacteroides_fragilis)、unclassified_c_bacilli、真菌cag:156(eubacterium_sp._cag:156)、blautia_sp._gd8、瘤胃球菌5_1_39bfaa(ruminococcus_sp._5_1_39bfaa)、dorea_sp._cag:105、unclassified_g_bifidobacterium、真杆菌(eubacterium_hallii)、粪肠球菌(enterococcus_faecalis)、phascolarctobacterium_sp._cag:207、真杆菌cag:12(eubacterium_hallii_cag:12)、bacteroides_massiliensis、多雷拟杆菌(bacteroides_dorei)、blautia_wexlerae、大便杆菌(faecalibacterium_prausnitzii)、subdoligranulum_variabile、blautia_sp._marseille-p2398、奥氏杆菌er4(oscillibacter_sp._er4)、柠檬酸杆菌(citrobacter_freundii)、外阴类杆菌(bacteroides_vulgatus)、unclassified_g__klebsiella、梭状芽孢杆菌cag:510(clostridium_sp._cag:510)、梭状芽孢杆菌cag:62(clostridium_sp._cag:62)、卵拟杆菌(bacteroides_ovatus)、eubacterium_ventriosum、双孢拟杆菌(parabacteroides_distasonis)、真杆菌cag:146(eubacterium_sp._cag:146)、肺炎克雷伯菌(klebsiella_pneumoniae)、真杆菌cag:180(eubacterium_sp._cag:180)、硬壁杆菌cag:41(firmicutes_bacterium_cag:41)、blautia_sp._cag:237、鸡类杆菌(bacteroides_eggerthii)菌种中的一种或多种；
更优选地，所述肠道细菌优选自克雷伯菌属(klebsiella)细菌、真细菌属cag:146(eubacterium_sp._cag:146)细菌中的一种或多种；
优选地，所述噬菌体属于长尾病毒科(siphoviridae)、短尾病毒科(podoviridae)中一种或多种病毒科的噬菌体；
优选地，所述肠道噬菌体选自噬菌体梭菌phi8074-b1(clostridium_phage_phi8074-b1)、大肠杆菌噬菌体(escherichia_phage_ecbp5)、克雷伯菌噬菌体(klebsiella_phage_vb_kpnp_su552a)中的一种或多种；
优选地，所述粪便代谢产物是哌啶酸(pipecolicacid)、亮氨酸(leucine)、磷酸盐(phosphate)、红酸内酯(erythronicacidlactone)、三醋酸甘油酯(triacetin)、高丝氨酸(l-homoserine)、氨乙基磷酸(ciliatine)、正缬氨酸(norvaline)、胸腺嘧啶(thymine)、己糖(zhexose)、异丁苯丙酸(ibuprofen)、n-乙酰鸟氨酸(n-acetylornithine)、脯氨酸(proline)、阿卓糖(altrose)、氨基磺酸(amidosulfonicacid)、依地酸(edeticacid)、2-十二烷基-1,4-二羟基苯(2-dodecyl-1,4-dihydroxy-benzene)、喹啉酸(quinolinicacid)、β-甘露醇甘油酯(beta-mannosylglycerate)、胱氨酸(cystine)、邻磷酸乙醇胺(o-phosphoethanolamine)、氧脯氨酸(oxoproline)、癸二酸(sebacicacid)、异柠檬酸(isocitricacid)、棕榈酸(palmiticacid)、谷胱甘肽(glutathione)、d-果糖(d-fructose)、2-哌啶氮腈(2-piperidinobenzonitrile)、α-d-葡萄糖(alpha-d-glucose)、反式-4-羟基-l-脯氨酸(trans-4-hydroxy-l-proline)、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyricacid)、双酚a(bisphenola)、肌苷-5'-单磷酸(inosine-5'-monophosphate)、4-甲基苯磺酰胺(4-methylbenzenesulfonamide)、反式-4-羟脯氨酸(trans-4-hydroxyproline)、n-{2-羟乙基}十四烷-1-胺(n-{2-hydroxyethyl}tetradecan-1-amine)、色氨酸(tryptophol)、对苯二甲酸(terephthalicacid)、高香草酸(homovanillicacid)、联苯(biphenyl)、4-甲基-5-噻唑乙烷(4-methyl-5-thiazoleethanol)、衣康酸(itaconicacid)、熊果苷(arbutin)、5-单磷酸腺苷(adenosine-5-monophosphate)、2-吲哚甲酸(2-indolecarboxylicacid)、氢化肉桂酸(hydrocinnamicacid)、2,2'-联苯二醇(2,2'-biphenyldiol)、1,3,5-苯三醇(1,3,5-benzetriol)5,7-二甲基[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-胺(5,7-dimethyl[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyrimidin-2-ylamine)、苄胺(benzylamine)中的一种或多种；
优选地，所述粪便代谢产物优选自癸二酸、2-吲哚甲酸中的一种或多种；
更优选地，所述肠道生物标志物包括克雷伯菌属(klebsiella)细菌、真细菌属cag:146(eubacterium_sp._cag:146)细菌、梭状芽胞杆菌噬菌体phi8074-b1(clostridium_phage_phi8074-b1)、大肠杆菌噬菌体ecbp5(escherichia_phage_ecbp5)、癸二酸、2-吲哚甲酸中的一种或多种，
更优选地，所述肠道生物标志物包括克雷伯菌属(klebsiella)细菌和真细菌属cag:146(eubacterium_sp._cag:146)细菌，
更优选地，所述肠道生物标志物包括梭状芽胞杆菌噬菌体phi8074-b1(clostridium_phage_phi8074-b1)和大肠杆菌噬菌体ecbp5(escherichia_phage_ecbp5)，更优选地，所述肠道生物标志物包括癸二酸和2-吲哚甲酸，
更优选地，所述肠道生物标志物包括克雷伯菌属(klebsiella)细菌、真细菌属cag:146(eubacterium_sp._cag:146)细菌、梭状芽胞杆菌噬菌体phi8074-b1(clostridium_phage_phi8074-b1)、大肠杆菌噬菌体ecbp5(escherichia_phage_ecbp5)、癸二酸和2-吲哚甲酸。
在一方面，本公开还提供一种用于诊断抑郁症的试剂盒，所述试剂盒包含所述肠道生物标志物和/或所述肠道生物标志物的检测试剂，优选地，所述试剂盒还包括抑郁症诊断评价表，优选地，所述抑郁症诊断评价表包括各版美国精神疾病诊断与统计手册、汉密尔顿抑郁量表-17项(hamd-17)中的一种或多种；任选地，所述试剂盒为生化诊断试剂盒、免疫诊断试剂盒、或分子诊断试剂盒中的一种或多种，优选免疫诊断试剂盒，优选地，所述试剂盒为western印迹试剂盒、酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒、放射免疫测定(ria)试剂盒、放射免疫扩散试剂盒、ouchterlony免疫扩散试剂盒、火箭免疫电泳试剂盒、免疫组织化学染色试剂盒、免疫沉淀测定试剂盒、补体结合测定试剂盒、荧光激活细胞分选(facs)试剂盒、适体芯片试剂盒、微阵列试剂盒、蛋白质芯片试剂盒中的一种或多种。
在一方面，本公开还提供所述肠道生物标志物，和/或所述肠道生物标志物的检测试剂，和/或所述试剂盒，在诊断抑郁症中的用途。
在一方面，本公开还提供所述肠道生物标志物在制备抑郁症的检测试剂中的用途，或所述肠道生物标志物的检测试剂在制备诊断抑郁症的试剂盒中的用途。
在另一方面，本公开还提供一种抑郁症患者肠道生物标志物的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
将受试者分为抑郁症患者组与健康对照组；
检测受试者的候选肠道生物标志物水平，所述肠道生物标志物来自受试者粪便样品中肠道微生物、粪便代谢产物和/或其组合；
判断抑郁症患者与健康对照之间的所述候选肠道生物标志物的差异度和/或相似性，得到差异肠道生物标志物，即所述抑郁症患者肠道生物标志物。
优选地，所述检测受试者的候选肠道生物标志物水平通过基因组测序和/或非靶向代谢组学等方法，所述基因组测序优选高通量全基因宏基因组测序(whole-genomeshotgunmetagenomicsanalysis)、所述非靶向代谢组学优选质谱代谢组学检测，例如液相色谱/气象色谱-质谱联用(lc/gc-ms)；
优选地，所述判断抑郁症患者与健康对照之间的所述候选肠道生物标志物的差异度和/或相似性，包括通过例如偏最小二乘判别分析(pls-da)等方法预测抑郁症患者与健康对照之间的所述候选肠道生物标志物的差异度和/或相似性，以得到差异候选肠道生物标志物的步骤，更优选地，还包括通过例如lefse(线性判别分析)等方法由差异候选肠道生物标志物确认差异肠道生物标志物的步骤；
任选地，所述筛选方法还可以包括以下步骤：
验证所述抑郁症患者肠道生物标志物的诊断率，优选地，所述验证所述抑郁症患者肠道生物标志物的诊断率通过机器学习模型的分析方法，优选随机森林分析方法。
在一方面，本公开还提供前述的筛选方法在确定抑郁症患者肠道生物标志物中的用途，或在制备诊断抑郁症的试剂/或试剂盒中的用途。
在一方面，本公开还提供前述的筛选方法所得的抑郁症患者肠道生物标志物，所述抑郁症患者肠道生物标志物用于诊断抑郁症。
本公开的有益效果包括：
本公开通过检测肠道微生物、粪便代谢产物和/或其组合作为抑郁症诊断的依据，并提供了相应的诊断和试剂，其相较于传统的依靠症状描述及持续时间并排除其他疾病后才能凭临床经验判断的诊断方法，对抑郁症诊断有较高的灵敏度和特异性，还能在发病前期预测抑郁症，达到早期、靶向诊断抑郁症的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本公开的技术方案，下面对所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1a是分别以肠道细菌、肠道噬菌体、粪便代谢产物作为生物标志物，由抑郁症患者和健康对照组成的训练集和验证集的接收者操作特征(receiveroperatingcharacteristic，roc)曲线和曲线下面积(areaundercurve，auc)图
2种肠道细菌(克雷伯菌属和真细菌属cag:14)对训练集、验证集样本的判别效能分别为auc＝0.89、auc＝0.81；
2种肠道噬菌体(梭状芽孢杆菌噬菌体phi8074-b1和大肠杆菌噬菌体ecbp5)对训练集、验证集样本的判别效能分别为auc＝0.77、auc＝0.65；
2种粪便代谢产物(癸二酸和2-吲哚甲酸)对训练集、验证集样本的判别效能分别为auc＝0.93，auc＝0.83。
图1b是以肠道细菌、肠道噬菌体、粪便代谢产物作为联合生物标志物，由抑郁症患者和健康对照组成的训练集和验证集的接收者操作特征(receiveroperatingcharacteristic，roc)曲线和曲线下面积(areaundercurve，auc)图
将2种肠道细菌(克雷伯菌属和真细菌属cag:14)、2种肠道噬菌体(梭状芽孢杆菌噬菌体phi8074-b1和大肠杆菌噬菌体ecbp5)、2种粪便代谢产物(癸二酸和2-吲哚甲酸)联合对训练集、验证集样本的判别效能分别为auc＝0.98、auc＝0.90。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本公开的方案，下面将结合本公开附图，对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本公开中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。
i.定义
术语“抑郁症”又称抑郁障碍，以显著而持久的心境低落为主要临床特征，是心境障碍的主要类型。
术语“诊断”是指症状出现之后，检测和/或识别受试者的病理状态，鉴别和/或确定受试者是否患有给定的疾病或紊乱的过程，估计或者确定受试者未来的临床进展的方法。
术语“肠道微生物”指人体肠道中存在的数量庞大的微生物，这样的微生物依靠动物的肠道生活，同时帮助寄主完成多种生理生化功能。肠道不仅是人体消化吸收的重要场所，同时也是最大的免疫器官，在维持正常免疫防御功能中发挥着极其重要的作用。所述“肠道微生物”包括肠道菌群、肠道病毒例如噬菌体等。
术语“肠道微生物代谢产物”、“肠道微生物代谢物”或称“粪便代谢产物”指肠道微生物在代谢过程中，产生的多种代谢产物。
术语“生物标志物”，也称为“生物学标志物”，是指个体的生物状态的可测量指标。这样的生物标志物可以是在个体中的任何物质，只要它们与被检个体的特定生物状态(例如，疾病)有关系，其可以为一个标志物也可以是一组标志物。在本公开的生物标志物表示为“肠道生物标志物”，因为所发现的与抑郁症相关的生物标志物均存在于受试者的肠道内。生物标志物经过测量和评估，经常用以检查正常生物过程，致病过程，或治疗干预药物响应，而且在许多科学领域都是有用的。
所述“训练集”、“训练数据集”、“验证集”、“验证数据集”指在本公开的机器学习模型建立过程中，可将样本分成独立的训练集、验证集。其中训练集用来训练模型，验证集用来检验模型的性能。
ii.具体实施方式
本公开提供用于诊断抑郁症的肠道生物标志物，所述肠道生物标志物包括肠道微生物、粪便代谢产物中的一种或多种。
本公开还提供用于检测所述生物标志物和/或诊断抑郁症的所述肠道生物标志物的检测试剂和/或试剂盒，用于检测所述生物标志物和/或诊断抑郁症。
在一方面，本公开提供所述肠道生物标志物在诊断抑郁症中的用途。
在一方面，本公开提供所述肠道生物标志物的检测试剂在诊断抑郁症中的用途。
在一方面，本公开还提供所述肠道生物标志物在制备诊断检测抑郁症的试剂和/或试剂盒中的用途。
在一方面，本公开还提供所述肠道生物标志物的检测试剂在制备诊断抑郁症的试剂盒中的用途。
在本公开的一个具体实施方式中，所述试剂盒可以为生化诊断试剂盒、免疫诊断试剂盒、或分子诊断试剂盒等，优选制备成所述免疫诊断试剂盒。
所述试剂盒是指采用免疫学、微生物学、分子生物学等原理或方法制备的、在体外用于对人类疾病的诊断、检测及流行病学调查等的试剂盒。
所述试剂盒可以为本领域公知的类型，包括但不限于western印迹试剂盒、酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒、放射免疫测定(ria)试剂盒、放射免疫扩散试剂盒、ouchterlony免疫扩散试剂盒、火箭免疫电泳试剂盒、免疫组织化学染色试剂盒、免疫沉淀测定试剂盒、补体结合测定试剂盒、荧光激活细胞分选(facs)试剂盒、适体芯片试剂盒、微阵列试剂盒、蛋白质芯片试剂盒等。
在本公开的一个具体实施方式中，所述试剂盒中，包括所述肠道生物标志物的检测试剂，所述检测试剂指能够特异性测定所述肠道生物标志物，包括但不限于可以特异性结合于所述肠道微生物、粪便代谢产物和/或其组合的核酸分子、蛋白质、化合物等。
在本公开的一个具体实施方式中，可以选择能够特异性结合所述肠道生物标志物的蛋白质作为所述检测试剂，在本公开的另一个具体实施例中，优选抗体作为所述肠道生物标志物的检测试剂，所述抗体可以是可特异性结合到标志物蛋白的抗体，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体及其抗原结合片段，只要其保留了抗原结合功能即可。
在本公开中，所述肠道生物标志物的检测试剂上可以连接有能够被检测的标记分子。
在本公开的一个实施方式中，本公开的用于诊断抑郁症的肠道生物标志物包括肠道微生物或粪便代谢产物。
在本公开的一个实施方式中，本公开的用于诊断抑郁症的肠道生物标志物包括肠道微生物和粪便代谢产物。
在本公开的一个实施方式中，所述肠道微生物包括肠道细菌或肠道噬菌体。
在本公开的一个实施方式中，所述肠道微生物包括肠道细菌和肠道噬菌体。
在本公开的一个具体实施方式中，所述肠道生物标志物包括肠道细菌、肠道噬菌体、粪便代谢物中的一种。
在本公开的一个具体实施方式中，所述肠道生物标志物包括肠道细菌、肠道噬菌体、粪便代谢物中的二种。
在本公开的一个具体实施方式中，所述肠道生物标志物同时包括肠道细菌、肠道噬菌体和粪便代谢物。
优选地，所述肠道细菌属于毛螺菌科(lachnospiraceae)、梭菌科(clostridiaceae)、类杆菌科(bacteroidaceae)、双歧杆菌科(bifidobacteriaceae)、韦荣氏球菌科(veillonellaceae)、真杆菌科(eubacteriaceae)、瘤球菌科(ruminococcaceae)、拟杆菌科(bacteroidaceae)、肠球菌科(enterococcaceae)、酸氨基球菌科(acidaminococcaceae)、颤螺旋菌科(oscillospiraceae)肠杆菌科(enterobacteriaceae)、紫菜科(porphyromonadaceae)中一种或多种菌科的细菌；优选地，所述肠道细菌属于blautia、梭菌属(clostridium)、拟杆菌属(bacteroides)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、韦荣球菌属(veillonella)、真杆菌属(eubacterium)、粪细菌(faecalibacterium)、粪球菌(coprococcus)、厌氧菌属(anaerostipes)、类杆菌(unclassified_o_bacteroidales)、adlercreutzia、硬壁菌属(unclassified_p_firmicutes)、杆菌属(unclassified_c_bacilli)、瘤胃球菌属(ruminococcus)、dorea、肠球菌属(enterococcus)、phascolarctobacterium、faecalibacterium、subdoligranulum、oscillibacter、柠檬酸杆菌属(citrobacter)、克雷伯菌属(klebsiella)、副拟杆菌(parabacteroides)中一种或多种菌属的细菌；优选地，所述肠道细菌选自blautia_obeum、梭状芽孢杆菌cag:217(clostridium_sp._cag:217)、泰氏拟杆菌(bacteroides_thetaiotaomicron)、长双歧杆菌(bifidobacterium_longum)、veillonella_sp._cag:933、真细菌cag:202(eubacterium_sp._cag:202)、粪大肠杆菌cag:74(faecalibacterium_sp._cag:74)、真性粪球菌(coprococcus_eutactus)、厌氧菌(anaerostipes_hadrus)、unclassified_o_bacteroidales、粪类杆菌(bacteroides_stercoris)、粪类杆菌cag:120(bacteroides_stercoris_cag:120)、unclassified_g__bacteroides、adlercreutzia_equolifaciens、硬壁菌cag:227(firmicutes_bacterium_cag:227)、脆弱类杆菌(bacteroides_fragilis)、unclassified_c_bacilli、真菌类cag:156(eubacterium_sp._cag:156)、blautia_sp._gd8、瘤胃球菌5_1_39bfaa(ruminococcus_sp._5_1_39bfaa)、dorea_sp._cag:105、未分类双歧杆菌(unclassified_g_bifidobacterium)、真杆菌(eubacterium_hallii)、粪肠球菌(enterococcus_faecalis)、phascolarctobacterium_sp._cag:207、真杆菌cag:12(eubacterium_hallii_cag:12)、bacteroides_massiliensis、多雷拟杆菌(bacteroides_dorei)、blautia_wexlerae、大便杆菌(faecalibacterium_prausnitzii)、subdoligranulum_variabile、blautia_sp._marseille-p2398、奥氏杆菌er4(oscillibacter_sp._er4)、柠檬酸杆菌(citrobacter_freundii)、外阴类杆菌(bacteroides_vulgatus)、unclassified_g__klebsiella、梭状芽孢杆菌cag:510(clostridium_sp._cag:510)、梭状芽孢杆菌cag:62(clostridium_sp._cag:62)、卵拟杆菌(bacteroides_ovatus)、eubacterium_ventriosum、双孢拟杆菌(parabacteroides_distasonis)、真杆菌cag:146(eubacterium_sp._cag:146)、肺炎克雷伯菌(klebsiella_pneumoniae)、真杆菌(eubacterium_sp._cag:180)、硬壁杆菌cag:41(firmicutes_bacterium_cag:41)、blautia_sp._cag:237、鸡类杆菌(bacteroides_eggerthii)菌种中的一种或多种；更优选地，所述肠道细菌优选自克雷伯菌属(klebsiella)细菌、真细菌属cag:146(eubacterium_sp._cag:146)细菌中的一种或多种。
优选地，所述肠道噬菌体，所述噬菌体属于长尾病毒科(siphoviridae)、短尾病毒科(podoviridae)中一种或多种病毒科的噬菌体，优选地，所述肠道噬菌体选自噬菌体梭菌phi8074-b1(clostridium_phage_phi8074-b1)、大肠杆菌噬菌体(escherichia_phage_ecbp5)、克雷伯菌噬菌体(klebsiella_phage_vb_kpnp_su552a)中的一种或多种。
优选地，所述粪便代谢产物是哌啶酸(pipecolicacid)、亮氨酸(leucine)、磷酸盐(phosphate)、红酸内酯(erythronicacidlactone)、三醋酸甘油酯(triacetin)、高丝氨酸(l-homoserine)、氨乙基磷酸(ciliatine)、正缬氨酸(norvaline)、胸腺嘧啶(thymine)、己糖(zhexose)、异丁苯丙酸(ibuprofen)、n-乙酰鸟氨酸(n-acetylornithine)、脯氨酸(proline)、阿卓糖(altrose)、氨基磺酸(amidosulfonicacid)、依地酸(edeticacid)、2-十二烷基-1,4-二羟基苯(2-dodecyl-1,4-dihydroxy-benzene)、喹啉酸(quinolinicacid)、β-甘露醇甘油酯(beta-mannosylglycerate)、胱氨酸(cystine)、邻磷酸乙醇胺(o-phosphoethanolamine)、氧脯氨酸(oxoproline)、癸二酸(sebacicacid)、异柠檬酸(isocitricacid)、棕榈酸(palmiticacid)、谷胱甘肽(glutathione)、d-果糖(d-fructose)、2-哌啶氮腈(2-piperidinobenzonitrile)、α-d-葡萄糖(alpha-d-glucose)、反式-4-羟基-l-脯氨酸(trans-4-hydroxy-l-proline)、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyricacid)、双酚a(bisphenola)、肌苷-5'-单磷酸(inosine-5'-monophosphate)、4-甲基苯磺酰胺(4-methylbenzenesulfonamide)、反式-4-羟脯氨酸(trans-4-hydroxyproline)、n-{2-羟乙基}十四烷-1-胺(n-{2-hydroxyethyl}tetradecan-1-amine)、色氨酸(tryptophol)、对苯二甲酸(terephthalicacid)、高香草酸(homovanillicacid)、联苯(biphenyl)、4-甲基-5-噻唑乙烷(4-methyl-5-thiazoleethanol)、衣康酸(itaconicacid)、熊果苷(arbutin)、5-单磷酸腺苷(adenosine-5-monophosphate)、2-吲哚甲酸(2-indolecarboxylicacid)、氢化肉桂酸(hydrocinnamicacid)、2,2'-联苯二醇(2,2'-biphenyldiol)、1,3,5-苯三醇(1,3,5-benzetriol)5,7-二甲基[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-胺(5,7-dimethyl[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyrimidin-2-ylamine)、苄胺(benzylamine)中的一种或多种；更优选地，所述粪便代谢产物优选自癸二酸、2-吲哚甲酸中的一种或多种。
应当知晓，本公开所述用于诊断抑郁症的肠道标志物，可以包括上述肠道细菌、肠道噬菌体和/或粪便代谢产物中的任意一种；也可以包括上述肠道细菌、肠道噬菌体和/或粪便代谢产物肠道细菌、肠道噬菌体、粪便代谢物中的任意两种以上，例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种等。
任选地，所述用于诊断抑郁症的肠道标志物可以仅包括所述的一种肠道细菌、或一种肠道噬菌体、或一种粪便代谢产物，也可以仅包括所述的两种以上肠道细菌、或两种以上肠道噬菌体、或两种以上粪便代谢产物。
任选地，所述用于诊断抑郁症的肠道标志物可以包括一种或两种以上的所述肠道细菌以及一种或两种以上的所述肠道噬菌体；或者可以包括一种或两种以上的所述肠道细菌以及一种或两种以上的所述粪便代谢产物；或者可以包括一种或两种以上的所述肠道噬菌体以及一种或两种以上的所述粪便代谢产物。
在本公开的一个具体实施例中，所述肠道生物标志物包括克雷伯菌属(klebsiella)细菌、真细菌属cag:146(eubacterium_sp._cag:146)细菌、梭状芽胞杆菌噬菌体phi8074-b1(clostridium_phage_phi8074-b1)、大肠杆菌噬菌体ecbp5(escherichia_phage_ecbp5)、癸二酸、2-吲哚甲酸中的一种或多种，优选地，所述肠道生物标志物包括克雷伯菌属(klebsiella)细菌、真细菌属cag:146(eubacterium_sp._cag:146)细菌、梭状芽胞杆菌噬菌体phi8074-b1(clostridium_phage_phi8074-b1)、大肠杆菌噬菌体ecbp5(escherichia_phage_ecbp5)、癸二酸和2-吲哚甲酸。
在本公开的一个具体实施例中，所述诊断抑郁症包括如下步骤：
检测受试者的所述肠道生物标志物水平，并依据所述肠道生物标志物水平判断受试者患有抑郁症的风险。
本公开还提供用于诊断抑郁症的试剂盒，所述试剂盒包含所述肠道生物标志物和/或所述肠道生物标志物的检测试剂。
优选地，所述用于诊断抑郁症的试剂盒还包括抑郁症诊断评价表，所述抑郁症诊断评价表包括但不限于美国精神疾病诊断与统计手册第四版(dsm-iv)或第五版(dsm-5)的抑郁障碍诊断标准、汉密尔顿抑郁量表-17项(hamd-17)中的一种或多种。
本公开还提供一种抑郁症患者肠道生物标志物的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
将受试者分为抑郁症患者组与健康对照组；
检测受试者的候选肠道生物标志物水平；
判断抑郁症患者与健康对照之间的所述候选肠道生物标志物的差异度和/或相似性，得到差异肠道生物标志物，即所述抑郁症患者肠道生物标志物。
优选地，所述候选肠道生物标志物来自受试者粪便样品中肠道微生物、粪便代谢产物和/或其组合。
优选地，所述将受试者分为抑郁症患者组与健康对照组依据本领域公知的常规诊断方法，包括但不限于诊断评价表，例如美国精神疾病诊断与统计手册第四版(dsm-iv)或第五版(dsm-5)的抑郁障碍诊断标准、汉密尔顿抑郁量表-17项(hamd-17)等。
优选地，所述检测受试者的候选肠道生物标志物水平通过基因组测序和/或非靶向代谢组学等方法，具体地，所述基因组测序例如高通量全基因宏基因组测序(whole-genomeshotgunmetagenomicsanalysis)、所述非靶向代谢组学优选质谱代谢组学检测，例如液相色谱/气象色谱-质谱联用(lc/gc-ms)等。
优选地，所述判断抑郁症患者与健康对照之间的所述候选肠道生物标志物的差异度和/或相似性，包括通过偏最小二乘判别分析(pls-da)等方法预测抑郁症患者与健康对照之间的所述候选肠道生物标志物的差异度和/或相似性的步骤；更优选地，所述判断抑郁症患者与健康对照之间的所述候选肠道生物标志物的差异度和/或相似性，还包括通过lefse(线性判别分析)等方法由差异候选肠道生物标志物确认差异肠道生物标志物。
在本公开的一个实施方式中，所述筛选方法还包括以下步骤：
验证所述抑郁症患者肠道生物标志物的诊断率。
优选地，所述验证所述抑郁症患者肠道生物标志物的诊断率通过机器学习模型的分析方法，优选随机森林分析方法。
在本公开的一个实施方式中，所述筛选方法，包括以下步骤：
受试者接受美国精神疾病诊断与统计手册测试，以此作为抑郁症患者组与健康对照组的分组依据；
采用高通量全基因宏基因组测序(whole-genomeshotgunmetagenomicsanalysis)及非靶向代谢组学(lc/gc-ms)的方法对受试者的候选肠道生物标志物水平进行检测，所述候选肠道生物标志物来自受试者粪便样品进行肠道微生物、粪便代谢产物和/或其组合；
通过偏最小二乘判别分析(pls-da)预测抑郁症患者与健康对照之间所述候选肠道生物标志物的差异度与相似性，得到差异候选肠道生物标志物，并通过lefse(线性判别分析)由差异候选肠道生物标志物确定差异肠道微生物，得到所述抑郁症患者肠道生物标志物。
优选地，所述筛选方法还包括以下步骤：
利用随机森林分析方法，得到所述抑郁症患者肠道生物标志物诊断得分，验证诊断率。
本公开还涉及上述任一种筛选方法在确定抑郁症患者肠道生物标志物中的用途。
本公开还涉及上述任一种筛选方法在诊断抑郁症中的用途。
本公开还涉及上述任一种筛选方法在制备诊断抑郁症的试剂盒/或试剂盒中的用途。
本公开还涉及上述任一种筛选方法所筛选得到的抑郁症患者肠道生物标志物，所述抑郁症患者肠道生物标志物用于诊断抑郁症。
iii.实施例
实施例1、用于诊断抑郁症的肠道生物标志物的筛选
方法
1、样品来源
招募北京安定医院就诊的门诊患者及社区健康志愿者采集粪便样本，纳入标准如下：
1.1抑郁症患者纳入标准：
(1)年龄18-65岁，性别不限，符合精神疾病诊断与统计手册第四版(dsm-iv)抑郁障碍诊断标准的患者；
(2)汉密尔顿抑郁量表-17项(hamd-17)评分≥14分；
(3)有一定文化程度，能够配合完成评估及随访；
(4)患者签署知情同意书。
1.2健康对照纳入标准：
(1)性别、年龄、教育程度、居住地等与病例组匹配，诊断评估不符合抑郁障碍诊断；
(2)经dsm-iv临床定式访谈评定无精神疾病。
(3)签署知情同意书。
1.3排除标准:
(1)共患精神科其他疾病的患者；
(2)共患严重的躯体疾病且目前治疗不稳定的患者；
(3)妊娠及哺乳期妇女；
(4)受试者正在参加其他临床试验。
本公开最终招募抑郁症患者156例，其中男56例，女100例；健康对照155例，其中男64例，女91例。
2、粪便样本采集与dna提取
采集粪便样品后冷冻运输并迅速转移到-80℃保存，进行dna提取，得到提取的dna样本。所有粪便标本收集完后采用美国
3、高通量全基因宏基因组测序(whole-genomeshotgunmetagenomicsanalysis)：
利用所提取的dna样本使用
4、测定抑郁症患者与健康对照之间肠道微生物、粪便代谢产物的差异度与相似性，并验证：基因组比对与丰度计算，并进行基因预测和构建非冗余基因集。
采用blastp(blastversion2.2.28+，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)对高质量测序数据进行微生物分类归属，其丰度计算步骤如下：
1)将高质量测序片段比对到参考的标记基因上；
2)根据比对结果统计插入片段的数量；
3)将插入片段的数量对标记基因的长度进行标准化(按平均基因长度进行标准化，并按照向下取整的方式得到对应物种的丰度)得到对应的丰度。通过偏最小二乘判别分析(pls-da)预测抑郁症患者与健康对照之间肠道微生物的差异度与相似性，并通过lefse(线性判别分析)设定阈值(lda>2.5，p<0.05)来确定差异肠道微生物。
5.粪便代谢产物谱
提取粪便代谢产物，基于非靶向代谢组学(lc/gc-ms)的研究平台采集全物质谱图，将归一化的谱图导入simca-p12.0(umetrics,sweden)进行偏最小二乘判别分析(pls-da)和lefse(线性判别分析)，筛选出差异代谢物质(lda>2.5，p<0.05)。
结果
1.抑郁症患者和健康人群两组中肠道菌群种类差异
为了找到差异显著的细菌，首先对菌种测序数据标准化后，用lefse(线性判别分析)方法，得到lda>2.5且p值小于0.05的抑郁症患者和健康对照差异菌群。结果显示，共有47中细菌在抑郁症和对照组间存在明显差异(表1)。
表1、抑郁症患者和健康对照间的粪便差异菌种。
2.抑郁症患者和健康人群两组中粪便噬菌体差异
利用lefse分析，我们发现3种噬菌体在两组之间表达不同，包括噬菌体梭菌phi8074-b1、大肠杆菌噬菌体以及克雷伯菌噬菌体(表2)。
表2、抑郁症患者和健康对照间的粪便噬菌体差异
3.抑郁症患者和健康人群两组中粪便代谢产物差异
应用代谢组学分析比较抑郁症和对照两组粪便代谢产物差异。与对照组相比，抑郁症组显示16种代谢物富集，34种代谢物减少(表3)。这些变化的代谢物主要参与氨基酸代谢(哌啶酸、高丝氨酸、n-乙酰鸟氨酸、脯氨酸、喹啉酸、胱氨酸、氧丙烷、γ-氨基丁酸、色氨酸、高香兰素酸、氢化肉桂酸、亮氨酸、反式-4-羟基-l-脯氨酸)、核苷酸代谢、碳水化合物代谢，以及脂质代谢。
表3、抑郁症患者和健康对照间的粪便代谢产物差异
实施例2、利用随机森林(randomforest,rf)验证抑郁症肠道生物标志物
为进一步验证疾病肠道生物标志物，本实施例构建了抑郁症受试者和健康对照的生物标志物的训练集，并以此为基准，对待测样本的生物标志物含量值进行评估。其中，在本公开中，所述训练集和所述验证集具有本领域所公知的含义。在本公开的实施方案中，训练集是指包含一定样本数的抑郁症受试者和健康对照待测样本中的各生物标志物的含量的数据集合。验证集是用来测试训练集性能的独立数据集合。本公开从311个样品(156个抑郁症病人和155个健康人)中，选取118个近一个月内未使用抗抑郁药的抑郁症病人和118个匹配的健康人作为训练集，其余样品作为验证集(38个抑郁症病人和37个健康人)。
方法
1.利用训练集数据筛选得到生物标志物
首先，按照4描述的方法计算训练集中每个样本中物种的相对丰度；按照5描述的方法得到肠道微生物代谢产物谱。然后将训练集的物种输入随机森林(randomforestanalysis，python’sscikit-learnpackage)分类器。对分类器进行5次5折交叉验证，利用rf模型筛选的物种相对丰度或代谢产物对每一个体计算其抑郁症患病风险，绘制roc曲线，并计算出auc作为判别模型效能评价参数。选取标志物组合数＜30，且判别效能最佳的组合为本公开组合。在模型中输出每个物种的重要性指数，重要性指数越高，代表该标志物用来判别抑郁症和非抑郁症的重要性越高。
2.利用验证集数据验证筛选得到的生物标志物
本公开随即使用独立人群对该模型进行验证，患病概率≥0.5预测个体具有抑郁症患疾病风险或者患有抑郁症。首先，按照4和5描述的方法计算训练集中每个样本中各生物标志物的相对丰度。然后按照6.1的方法利用随机森林模型对验证集数据进行验证。
结果：噬菌体、细菌种类和粪便代谢物联合标志物在抑郁症诊断中的价值
1.按照第1步的方法利用rf模型筛选的噬菌体、细菌种类和粪便代谢物绘制roc曲线，并计算出auc作为判别模型效能评价参数，以评估肠道宏基因组和代谢组学标志物在抑郁症诊断中的潜在价值。考虑到基于少量参数量化的诊断工具在临床实践中更为可行和经济，使用五折交叉验证方法来确定代表性变异，这些变异可以描述抑郁症患者和健康对照之间最显著的偏差。图1示出了基于随机森林模型由抑郁症患者和健康对照组成的训练集的roc曲线和auc，其中特异性表征的是对于不患病判对的概率，敏感性指的是对于患病判对的概率，以评估该生物标志物对抑郁症的诊断价值。
本公开所得rf分类器包含了2种细菌、2类噬菌体和2种粪便代谢产物，这6种肠道微生物标志物对训练集样本的判别效能见表4。其中，筛选出的2种细菌，克雷伯菌属(klebsiella)和真细菌属cag:146(eubacterium_sp._cag:146)，对训练集样本的判别效能为：auc＝0.89(95％ci:0.86-0.93)；筛选出2类噬菌体，梭状芽胞杆菌噬菌体phi8074-b1(clostridium_phage_phi8074-b1)和大肠杆菌噬菌体ecbp5(escherichia_phage_ecbp5)，对训练集样本的判别效能为：auc＝0.77(95％ci:0.72-0.84)；筛选出2种粪便代谢产物，癸二酸(sebacicacid)和2-吲哚甲酸(2-indolecarboxylicacid)，对训练集样本的判别效能为：auc＝0.93(95％ci:0.90-0.96)(图1a)。
将以上六种指标作为联合标志物，对训练集样本的判别效能为：auc＝0.98(95％ci:0.97-0.99)(图1b)，表明这六种指标组合可作为区分抑郁症与健康人的潜在生物标志物。
2.按照第2步的方法利用rf模型验证上述六种指标或组合(克雷伯菌属和真细菌属cag:14、梭状芽孢杆菌噬菌体phi8074-b1和大肠杆菌噬菌体ecbp5、癸二酸和2-吲哚甲酸)并绘制roc曲线，并计算出auc作为判别模型效能评价参数，以评估肠道宏基因组和代谢组学标志物在抑郁症诊断中的潜在价值。
这六种肠道微生物标志物对验证集样本的判别效能见表4。图1示出了基于随机森林模型(6个生物标志物组合)由抑郁症患者和健康对照组成的验证集的roc曲线和auc。其中，如图1所示，2种细菌(克雷伯菌属和真细菌属cag:14)对验证集样本的的判别效能：auc＝0.81(95％ci:0.71-0.91)；2种噬菌体(梭状芽孢杆菌噬菌体phi8074-b1和大肠杆菌噬菌体ecbp5)对验证集样本的的判别效能：auc＝0.65(95％ci:0.52-0.78)；2种代谢产物(癸二酸和2-吲哚甲酸)对验证集样本的的判别效能：auc＝0.83(95％ci:0.73-0.93)(图1a)。将以上六种指标作为联合标志物，对验证集样本的的判别效能：auc＝0.90(95％ci:0.82-0.98)(图1b)，表明这六种粪便指标组合具有相当的诊断抑郁症的潜力。
表4、利用受试者工作特征曲线评估筛选出的生物标志物对抑郁症的判别效能
以上结果表明，本公开公开的生物标志物具有较高的准确度和特异性，具有良好的开发为诊断方法的前景，从而为抑郁症的患病风险评估、诊断以及寻找潜在药物靶点提供依据。
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