前使抗阳G抗体与可溶性阳G-起预温育。为了测试第一聚合物/配体相互作用的 可逆性，在加入可溶性PEG或Pluronic F68(释放）之前使抗体与PEG化的颗粒一起温育。 该些数据表明，在超过ImM的浓度时，PEG IkDa、阳G 5kDa和Pluronic F68均能有效地完全 抑制或逆转相互作用（0%百分比信号）。观察到存在浓度依赖性效应并且对于抑制，IC50 值对于阳G IkDa、阳G 5kDa 和 Pluronic F68 分别为 0. 0485mM、0. 0077mM 和 0. 0017mM。对 于释放情况，IC50 值对于阳G IkDa、阳G 5kDa 和 Pluronic F68 分别为 0. 0625mM、0. 0136mM 和0.0035mM。b)相同数据如a),不同之处在于聚合物的浓度转化为质量百分率（w/v)。总 的来说，该些结果表明，在摩尔基础上，可逆标记的效率随着第二聚合物分子量的增加而提 局。
[004引 图7示出使用抗阳G/CD19TAC、20kDa阳G缀合的微粒和磁性洗涂，随后颗粒释放 并加入可溶性Pluronic F68(-种PEG衍生物）来从PBMC中阳性选择人CD19细胞。CD19+ 细胞在起始样品中的百分率是10. 0%。a)颗粒释放之前，所选的CD19细胞的流式细胞术 表现出高纯度，但由于细胞表面上的颗粒而具有高的侧向散射（左）。显微分析证实了细胞 表面上?lum颗粒的存在（右）。b)在使用1% (w/v)Pluronic F68进行颗粒释放并去除 W及磁性洗涂后，侧向散射位移消失（左）并且显微分析表明颗粒完全去除。在颗粒释放 后由于消除与颗粒非特异结合的细胞而使所选细胞的纯度略有增加。纯度的增加是颗粒释 放对抗阳G/PEG相互作用的特异性的结果。显微镜图像为20um的正方形。
[0047] 图8示出使用适当的TAC和阳G缀合的磁性颗粒从PBMC中阳性选择人类CD56和 CD8细胞的流式细胞术数据。对于两种细胞标记物，用阳G衍生物Pluronic F68释放颗 粒，突出此方法对于不同的细胞类型的普遍适用性。a)在CD56实验中，PBMC的起始样品 是18. 4% CD56+。使用抗阳G/CD56TAC和20kDa PEG缀合的微粒，所选的CD56细胞纯度 为93. 8%。一旦使用Pluronic F68去除颗粒，则纯度提高到96. 8%，总的细胞回收率为 18.6%。在释放步骤后回收最初由微粒选择的细胞的93% W上，该展示了所述方法的高效 性。b)在CD8选择实验中，起始细胞的10. 2%是CD8+。使用抗阳G/CD8TAC和lOkDa阳G 缀合的纳米颗粒，所选细胞的纯度为87. 4%。颗粒释放后的纯度提高至91. 1%，同时保持 77.0%的高回收率。该些结果强调了在颗粒释放后如何提高所选细胞的纯度。产生该种 情况的原因是，在温育步骤后一些吞瞻细胞类型非特异性结合至颗粒（流式细胞图上的星 号）。在分离释放仅通过特异性第一聚合物/配体相互作用结合的细胞后加入可溶性第二 聚合物，一旦游离颗粒和非特异性捕获的细胞被磁性去除提供所需细胞的进一步富集。
[0048] 图9是在颗粒系统中抗体亲抗原性效应的示意图。a)示出与祀细胞表面上的受体 相互作用的官能化的颗粒标记的情况。所述颗粒具有包含高密度官能团的表面涂层并且第 一聚合物已W高密度缀合至所述表面。当细胞受体已经被高密度的配体（TAC，例如）标记 时，在标记和祀细胞之间存在大量的潜在结合位点（连接）。抗体亲抗原性的增强效果使该 种相互作用难W通过与游离的第二聚合物竞争来逆转。b)示出低的抗体亲抗原性的情况， 其中所述标记具有低密度的第一聚合物并且祀细胞具有低密度的配体-标记的受体。根据 本发明的方法和组合物，该种相互作用是可逆的。
[0049] 图10示出通过不同方法、配体（抗体）和标记（颗粒）纯化的细胞的显微比较。a) 使用直接方法来标记并纯化细胞，其中在磁性洗涂后使抗CD19抗体缀合的磁性微粒（MP) 与PBMC-起温育。该图像显示用高密度（〉50)颗粒（暗点）标记的细胞。b)使用间接方 法标记和纯化细胞，所述方法包括与生物素化的抗CD19抗体随后与链霉亲和素缀合的磁 性MP-起温育并磁性洗涂。与a)中的方法相比，在细胞表面上存在较少的颗粒（<25)。C) 使用本发明的间接方法标记和纯化细胞。使细胞与识别CD19和PEG的双特异性四聚体抗 体复合物（TAC) -起温育，然后再与PEG缀合的磁性颗粒一起温育并且磁性洗涂。如在b) 中，细胞表面存在较少颗粒（<25)。主要观察到，相比于直接标记，间接方法导致细胞表面上 较低数量的标记。显微镜图像为20um的正方形。
[0050] 图11证实标记浓度、细胞分离性能和标记释放效率之间的关系。人CD19+细胞是 使用抗PEG/CD19TAC和不同浓度的30kDa PEG缀合的微粒从PBMC中阳性选择的。基于颗 粒释放步骤之前与之后的回收细胞的比率来计算释放效率。a)在磁性洗涂之后，但在颗粒 释放之前，在除了其中细胞回收率显著下降的最低浓度（0.05mg/mL)的整个浓度范围所选 细胞的纯度（H角形）和回收率（圆形）是相似的。有趣的是，加入Pluronic F68后，在 80倍的浓度差异（0.05-4mg/mL颗粒）下颗粒释放效率（菱形）是恒定的。b)通过起始样 品和已标记细胞的流式细胞术在低浓度和高浓度的颗粒下获得散射分布。用颗粒标记的细 胞比开始具有较高的侧向散射，但对于低和高浓度相似。假设侧向散射位移与细胞表面上 的颗粒数量相关，并考虑到恒定的颗粒释放，该些结果表明，标记浓度不显著影响结合到祀 细胞的标记数量或其所得的抗体亲抗原性。
[0051] 图12证实释放效率如何取决于配体标记的细胞受体的密度和标记-细胞相互作 用的相应抗体亲抗原性。a)人CD45+细胞是使用不同浓度的抗PEG/CD45TAC和30kDa PEG 缀合的磁性微粒从PBMC中阳性选择的。在磁标记和分离后，但在颗粒释放前，所选细胞的 纯度和回收率在0. 015至1.加g/mL的TAC浓度下是恒定的。尽管细胞回收率恒定，但在加 入PEG衍生物的Pluronic F68后存在显著的颗粒释放效率趋势。TAC在lug/mL W上，从颗 粒释放?25%的细胞，而TAC浓度为?0.02ug/mL时释放八5%的细胞。b)在分离后，但在 颗粒释放前，通过流式细胞术从来自a)的样品中获得散射分布。侧向散射随TAC浓度显著 增加（箭头）。假设侧向散射位移与细胞表面上的颗粒数量相关并考虑到释放效率，该些 结果表明，配体浓度如何影响结合的标记总数和标记-细胞相互作用的抗体亲抗原性。C) 与a)相似的结果，表明使用抗PEG/CD8TAC和lOkDa阳G缀合的磁性纳米颗粒阳性选择人 CD8+细胞，颗粒释放效率依赖于TAC浓度。
[0052] 图13证实释放效率与缀合至标记PEG的情况下的第一聚合物的大小（分子量， MW)之间的关系。丽在2kDa至30kDa范围内的PEG缀合至0. 2um、0. 5um和1. Oum磁性颗 粒。人CD19+细胞是使用抗PEG/CD19TAC和各种阳G缀合的颗粒从PBMC中阳性选择的。 对于所有样品，颗粒释放之前选定细胞的纯度和回收率是相似的。a)示出在缀合的PEG的 大小上颗粒释放的依赖性的结果。对于0. 2um颗粒，当PEG的大小从2kDa增加至30kDa时 释放效率是相对恒定的。另一方面，对于0. 5um和1. Oum的微粒（MP)，存在强依赖性。当 阳6大小为21^)3时，释放效率<10%。释放效率随阳0丽的增加（最多?80%为201^)3和 30kDa PEG)而增加。b)在分离后，但在颗粒释放前，通过来自a)的0. 5um颗粒样品的流式 细胞术获得散射分布。假设侧向散射位移与细胞表面上的颗粒数量相关，并考虑到颗粒释 放效率，该些结果表明，缀合的PEG的大小不显著改变结合的颗粒的总数。
[0053] 图14证实释放效率与缀合至标记阳G的情况下的第一聚合物的大小（分子量， MW)之间的关系。丽在2kDa至30kDa范围内的PEG缀合至0. 2um和1. Oum磁性颗粒。人 CD56+细胞是使用抗PEG/CD56TAC和各种阳G缀合的颗粒从PBMC中阳性选择的。对于所有 样品，颗粒释放之前选定细胞的纯度和回收率是相似的。a)示出在缀合的PEG的大小上颗 粒释放的依赖性的结果。当观察总的CD56+群体时，对于0. 2um纳米颗粒释放效率是相对 恒定的并且随阳G的MW增加至30kDa而增加至?50-100%。b)CD56通过在CD56的表达 方面相差一个数量级的明亮群体和暗淡群体来表征。对于1. Oum颗粒，在该些亚群内释放 效率存在显著差异。特别是，颗粒不能有效地W低丽的PEG从明亮群体释放。C)流式细 胞术示出b)中描述的效应。在颗粒释放之前，当2kDA或30kDa的PEG缀合至颗粒表面时 CD56细胞的染色分布是相同的。颗粒被Pluronic F68释放后，染色分布在30kDa PEG的情 况下保持相同，但当2kDA的PEG缀合至颗粒表面时明亮群体缺失。d)对于0. 2um纳米颗 粒数据与b)相似。与1. Oum微粒相比，在明亮的和总的CD56+群体之间并且在缀合的PEG 的MW的宽范围内，释放效率是相似的。观察到在祀细胞的明亮和暗淡亚群内标记释放的不 同与抗体亲抗原性的构思一致，因为高表达群体将具有更多的配体标记的受体并因此在标 记-细胞相互作用中有更高的抗体亲抗原性。通过使用高MW的第一聚合物，对于所有的细 胞群体可W实现高释放效率。
[0054] 图15证实对于阳G和磁性颗粒的情况，释放效率对缀合至标记的第一聚合物的浓 度（密度）的依赖性。MW为30kDa的PEG W不同密度缀合至磁性颗粒通过将反应性PEG与 颗粒的比例从大量过量化mg阳G/mg颗粒）改变至亚化学计量的量（47ug阳G/mg颗粒）。 人CD19+细胞是用抗PEG/CD19TAC和不同颗粒从PBMC中阳性选择的。纯度（H角形）和 回收率（圆形）是相对恒定的，因为颗粒表面上的PEG浓度向下滴定超过>100倍的范围。 与此相反，所述颗粒释放效率（菱形）在较低的密度显著降低。BCA蛋白定量测定被用作支 持测定，W确认颗粒表面上的阳G密度的差异。在用2%胎牛血清（FB巧温育后，在颗粒上 所吸收的蛋白量随PEG(正方形）浓度的降低而增加。PEG化的表面通常与降低的蛋白吸收 (防污）有关，因此该样的结果证实，所述PEG密度得到了有效的调控。
[005引图16示出PEG化的颗粒的性质的示意图。当PEG通过官能团和缀合化学结合到 颗粒表面时，其构象依赖于尺寸和表面密度。a)示出高表面密度下的较大MW的PEG(例如 30kDa)，该将被归类为刷结构化rush regime)。Rp是PEG分子的弗洛里（Flory)半径，D是 相邻的PEG之间的距离并且L是延伸的长度。b)当表面密度降低时，PEG分子采用磨茹构 象，因此D〉Rp并且结果是，与刷结构相比L降低。C)当PEG的高表面密度维持但其大小降 低（例如从30kDa至2kDa)时，结果L也降低。据推测由于在标记-细胞相互作用中的空 间位阻，L在PEG化的颗粒从祀细胞的释放效率中起作用。
[0056] 图17示出对于PEG的情况，释放效率对第二聚合物的浓度和丽的依赖性。人CD19 细胞是使用抗PEG/CD19TAC和30kDa PEG缀合的微粒然后用不同浓度的第二聚合物进行颗 粒释放从PBMC中阳性选择的。a)550Da，Pluronic F68(8. 35kDa)和30kDa和在很宽的浓 度范围进行滴定并且评估相应的释放效率。a)在摩尔基础上，第二聚合物的大小越大，最大 释放（>60% )所需的浓度越低。550Da PEG在?2. 3mM达到最大释放，Pluronic F68在? 0. 3mM并且30kDA在?0. 08mM达到最大释放。b)示出来自a)的数据，W及在质量百分比 (w/v)基础上的浓度。该些结果表明，无论第二聚合物的丽大小，需要相似的质量（从? 0. 125-0. 25% w/v) W实现最大的释放效率。
[0057] 图18示出对于PEG及其衍生物的情况，标记释放对第二聚合物的不同大小和结构 的一般性。人CD19细胞是使用抗PEG/CD19TAC和30kDa PEG缀合的磁性微粒然后进行颗 粒释放从PBMC中阳性选择的。a)当第二聚合物的浓度固定为1% (w/v)时，测试的所有 丽（从550Da至30kDA的范围）的阳G具有高的释放效率（〉75% )，包括阳G衍生物Pluronic F68 (箭头）。b)示出阳G和几种含有阳G的衍生物包括Pluronic F68和吐温20的化学结 构。该些结果强调标记释放对于不同MW和结构的第二聚合物的一般性。在Pluronic F68 的情况下，1 % w/v表示?1. 2mM的浓度，该是在细胞培养应用中用作添加剂时典型的和无 毒的浓度。
[0058] 图19示出当祀细胞的浓度在宽范围内变化时标记释放的效力。人CD19和CD3细 胞是使用合适的抗PEG TAC和30kDa PEG缀合的磁性微粒从PBMC中阳性选择的。最初，将 TAC浓度固定为1. 5ug/mL并且将细胞浓度固定为1 X 108个细胞/血用于磁性标记和纯化 步骤。对于颗粒释放，固定的1 % (w/v)浓度的Pluronic F68施用于祀细胞的不同稀释液。 数据表明，当祀细胞浓度在?lxl〇S-5xl07个细胞/mL范围内，释放效率没有显著差异。
[0059] 图20示出标记和释放对于抗-聚合物抗体配体的不同克隆的一般性。人CD19 细胞是使用不同的抗PEG克隆和lOkDa PEG缀合的磁性纳米颗粒然后进行颗粒释放 从PBMC中阳性选择的。通过用抗CD19克隆1D3(STEMCE化Technologies)和抗PEG克 隆 CH2074(Silverlake Research)、10B4-2、3F12-l、10E3-1-4、9B5-6-27-7、lD9-6(Life Dia即ostics)和Ell (Academia Sinica)制备双特异性TAC来评估走个不同的抗PEG抗体 克隆。在标记和磁性纯化后，细胞的a)纯度和b)回收率对于所有克隆是相似的，表明它们 适合用于特异性标记祀细胞。C)使用第二聚合物Pluronic F68并通过磁性洗涂去除来释 放颗粒。对于抗PEG抗体配体的所有不同克隆，释放效率是相似的（通常八0%)。
[0060] 图21突出了使用磁性颗粒作为标记、阳G作为第一聚合物、抗阳G抗体作为配体 和Pluronic F68作为第二聚合物如何可W实现重复的可逆标记。人类细胞预富集CD4+细 胞，然后使用抗阳G/CD25TAC和lOkDa阳G缀合的磁性纳米颗粒然后用Pluronic F68进行 颗粒释放从PBMC中阳性选择CD25+细胞。在初始阳性选择和颗粒释放后（左），回收纯度 为?93%的?l.OxlO 5个细胞。通过两轮离也来洗涂分离的细胞，由于另外的处理（中间） 损失一些细胞。当PEG缀合的纳米颗粒被重新加至分离的细胞并且进行第二磁性分离和颗 粒释放步骤（右）时，纯度稍有增加，同时基本上所有的祀细胞被重新捕获和释放。该些发 现强调了在细胞表面上的配体如何可W被利用用于第二轮的标记和释放。
[0061] 图22示出使用量子点作为标记、PEG作为第一聚合物、抗PEG抗体作为配体和 Pluronic F68作为第二聚合物的细胞的可逆英光标记。使用N服介导的缀合化学将英光量 子点纳米颗粒缀合至lOkDa PEG。用含有针对CD3或CD45的抗体的抗PEG TAC温育，随后 用PEG缀合的量子点温育人PBMC。使用流式细胞仪和英光显微镜洗涂并分析标记的细胞。 a)在CD3的情况下，细胞仪和显微镜表明，?40 %的细胞群体被量子点标记，也就是CD3细 胞的预期发生。6)在〔045的情况下，〉99%的细胞被量子点标记，该与？8版：中的〔045的表 达一致。C)标记是可逆的，因为向标记的CD45细胞中加入PluronicF68去除该信号。总 的来说，该些结果强调了本发明的可逆标记方法和组合物在除了细胞分离（包括细胞受体 的英光成像）W外的应用中的用途。
[0062] 图23证实第一聚合物-缀合的配体和配体-缀合的标记用于CD45+细胞的可逆 英光标记的用途。a)通过用CD45抗体（克隆MEM-28)温育并用大鼠抗小鼠PE(RAM-P巧 染色来标记人PBMC。正如CD45的表达谱预期的那样，?100%的淋己细胞表现出CD45+信 号（左）。作为对照，当用英光抗PEGA1L647标记检测相同细胞时，没有信号（右）。b)当 用30kDa阳G使CD45抗体阳G化并用抗阳G/化647标记检测（左）时，有强烈的阳性信 号（>96%的细胞）。此结果及其与RAM-PE信号的相关性证实PEG化的抗体配体与抗PEG/ 化647标记之间的特异性相互作用。当1 % w/v的Pluronic F68加至细胞中10分钟（右） 时，信号从96%减少至3%，显示使标记可逆（箭头）和释放特异性结合的抗PEGA1L647标 记的效力。通过流式细胞仪进行获取并通过选通上使用标准方案的活淋己细胞群体分析的 测量结果。
[0063] 图24证实第一聚合物-缀合的配体和配体-缀合的标记用于CD3+细胞的可逆英 光标记的用途。a)通过用CD3抗体（克隆UCHT1)温育并用具有87. 8%淋己细胞的RAM-PE 染色来标记人PBMC，示出CD3+信号（左）。作为对照，当用英光抗阳GA1L647标记检测相同 细胞时，没有信号（右）。b)当用30kDa阳G使CD3抗体阳G化并通过抗PEGA1L647标记 检测（左）时，83. 4%的细胞具有阳性信号。此结果及其与RAM-阳信号的相关性证实阳G 化的抗体配体与抗阳G/化647标记之间的特异性相互作用。当1% w/v的Pluronic F68 加至细胞中10分钟（右）时，信号从83. 4%减少至16. 3% (箭头），显示特异性结合的抗 阳GA1L647标记的释放。
[0064] 图25证实第一聚合物-缀合的配体和配体-缀合的标记用于CD3+细胞的纯化和 可逆标记的用途。来自人PBMC，CD3+细胞的起始群体是34. 1%，并有大约41. 8%的单核 细胞（左）。将阳G化的CD3抗体（克隆UCHT1)与细胞一起温育，随后加入缀合至抗阳G 抗体（克隆3F12-1)的磁性微粒。在磁性洗涂后，W 70. 1%纯度和9. 7%回收率获得CD3+ 细胞（中），表明标记祀细胞的特异性，但存在单核细胞至所述颗粒的一些非特异性结合 (16.8%)。将第二聚合物Pluronic F68加至纯化的细胞中W释放颗粒并且磁性去除过量 的标记。所得的CD3+细胞具有93. 0%纯度和7. 0%回收率，相应的颗粒释放效率为?71 % (右）。增加的纯度和降低的单核细胞污染是通过第二聚合物的第一聚合物/配体相互作 用的特异性逆转和通过磁性洗涂去除非特异性结合的细胞的结果。
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