描述。 阳19引 连施例4
[0199] 描述使用阳G化的聚苯己帰颗粒和抗阳G配体的可逆标记测定的工序（结果示于 图5)。使用实施例1中的方法将6. Oum N肥官能化的聚苯己帰颗粒炬ang's L油S)缀合至 20曲a 阳G(Ra卵 Polymere)。接着，将0. 15ug抗阳G抗体（克隆3F12-l，Life Dia即ostics) 加至在补充有2%胎牛血清（FB巧的0. 1血PBS缓冲液中的0,1mg阳G缀合的聚苯己帰颗粒 中。在室温下15分钟的温育期后，通过离也在PBS-FBS中洗涂颗粒。为测试相互作用的可 逆性而制备样品，其中加入1% (w/v)Pluronic F685分钟，接着在PBS-FBS中洗涂。作为对 照来测试结合和释放的特异性而制备另外的样品，其中第二聚合物为取代了 Pluronic F68 的1 % w/v的5kDA葡聚糖（Pharmacosmos)，或者抗阳G取代抗葡聚糖（克隆DX1，STEMCE化 Technologies)。为了检测颗粒表面上结合的抗体的量，在室温下加入0. 4ug大鼠抗小鼠 阳（克隆Ml-14D12，eBioscience)20分钟，并通过离也去除过量的。通过流式细胞术炬D Accuri C6)来测量样品并且从PE(Fk2)道数的强度直方图的几何平均值来估计特异性结 合和释放的程度。 阳200] 连施例5
[0201] 用于第一聚合物-缀合的磁性颗粒、抗聚合物配体和各种大小的第二聚合物 进行的可逆标记测定的方法W及用于定量第二聚合物抑制和释放效力的工序。根据实 施例4和几种变化方法来进行此方法。根据实施例1将0. 5um磁性颗粒缀合至30kDa 阳G(Laysan Bio)、40kDa 葡聚糖（Xife Technologies)或抑IS 肤（AnaSpec)。根据供应 商的说明书用AlexaFluor 488(Life Technologies)来标记抗-聚合物配体抗阳G(克 隆 9B5-6-25-7，Life Dia即ostics)、抗葡聚糖（克隆 DX1，STEMCE化 Technologies)和抗 pHIS (克隆J099B12, Biolegend)。W相同的抗体与颗粒质量比来完成所有抑制和释放测 量。所使用的缓冲液是PBS中的2%胎牛血清（FB巧。在圆底、未处理的聚苯己帰96孔板 (Costar 3788)和 EasySep?板磁铁（STEMCE化 Technologies)上处理样品。
[0202] W 0. 〇5mg颗粒和0. 25ug抗体的比率使第一聚合物缀合的颗粒与抗聚合物配体一 起混合在lOOuL的总体积中。产生从10% (w/v)开始的稀释系列的11个浓度的第二聚合 物。在抑制实验中，将第二聚合物加至配体中5分钟，并将所得的复合物加至聚合物-缀合 的颗粒中20分钟。在释放实验中，将聚合物-缀合的颗粒和配体温育20分钟，并随后再加 入第二聚合物5分钟。在温育期后，用缓冲液对样品进行磁性洗涂，并重息于200UL缓冲液 中。
[020引通过流式细胞术炬D Accuri C6)来测量不同样品并且从化-1道数的强度直方 图的几何平均值来估计特异性结合和释放的程度。使用不含第二聚合物的对照样品作为 100%将滴定数据标准化。在X轴上进行对数转换。使用非线性回归将每个滴定曲线拟合 到S形剂量-响应曲线W确定IC50值。 阳204] 连施例6
[0205] 按照图1中所描绘的方法使用聚合物/抗-聚合物系统和磁性颗粒来纯化人类细 胞的工序。所述方法描述了 PEG缀合的颗粒和含有抗PEG抗体和针对所期望的细胞表面抗 原的抗体的TAC的用途（典型的结果示于图7、图8、图10和表5)。当适当的第一聚合物和 抗-聚合物配体被取代时，将相同的方法应用于葡聚糖/抗葡聚糖（典型的结果示于图27 和表8)或抑IS/抗抑IS系统（典型的结果示于图28和表8)。可能需要使用其它细胞类 型或来源来滴定TAC和颗粒的量W获得最佳结果。此方法描述CD19+细胞的分离，但可W 使用TAC中的不同抗体来分离不同的细胞类型。方法时长为?40分钟。
[0206] 1.根据实施例2中的方法使用先前制备的含有抗CD19 (STEMC化L Technologies)和抗阳G(Silverlake Research)的 TAC。
[0207] 2.用移液管吸取0. 2-1血在EasySep?缓冲液（STEMCE化Technologies)中浓度 为IxlO8个细胞/血的单核细胞息液放入5血试管中。将TAC W lOOuL/mL (1. 5ug/mL抗体） 的浓度加至细胞中，并在室温下温育10分钟。
[0208] 3.接着，将阳G缀合的纳米颗粒（Img/mL)或微粒（lOmg/mL) W 50-150uL/mL的浓 度加至混合物中，并在室温下温育10分钟。对于待分离的每种细胞类型，应滴定颗粒浓度 W获得最佳结果。
[0209] 4.使用EasyS^?缓冲液将样品体积增加至2. 5血。将试管放入EasySep ?磁铁 (STEMCE化Technologies)中5分钟。5分钟后，倒出上清液，而试管仍然在磁铁中。在磁 力下磁性标记的细胞仍结合到管的一侧。从磁铁取出试管。
[0210] 5.重复步骤4,总共4X5分钟的磁性洗涂。
[0211] 6.细胞是阳性选择的，并在其表面含有颗粒。可使用所述细胞并施加原样应用于 下游实验或测定中，或者可W使用本发明的方法和组合物从表面去除该颗粒。 阳21引 连施例7
[0213] 根据图1和图2所描绘的方法使用聚合物/抗-聚合物系统从选定的细胞去除或 释放磁性颗粒的工序。所述方法描述了 PEG/抗PEG的用途（典型的结果示于图7、图8、表 5)。当适当的第一聚合物和抗-聚合物配体被取代并且释放聚合物是可溶性葡聚糖或pHIS 时，将相同的方法应用于葡聚糖/抗葡聚糖和抑IS/抗抑IS系统（典型的结果示于图27、 图28和表8)。方法时长通常为3分钟，该比其它方法更快（表3)。
[0214] 1.将在其表面上含有颗粒的阳性选择的细胞（例如如实施例6中所获得的）重 息于含有合适的第二聚合物（l%Pluronic F68、阳G、葡聚糖或抑IS)的EasySep?缓冲液 中，并用移液管吸取至少5次W确保细胞充分混合。
[0215] 2.在30砂至10分钟（通常为1分钟）的温育期后，将颗粒从细胞表面快速释放。 为了清除游离的颗粒和非特异性结合的细胞，将管放回EasySep?磁铁2-5分钟（通常为2 分钟）。
[0216] 3.小也吸取含有其表面上不含颗粒的阳性选择的细胞的上清液。含有非特异性结 合的颗粒和游离的颗粒的细胞被磁力保持在管的侧面。不含颗粒的细胞准备用于分析、进 一步标记、连续分离步骤或下游测定。 阳217] 连施例8
[021引另外的直接或间接标记和细胞分离的工序（典型的结果示于图10)。
[0219] 1.通过抗体缀合的标记直接标记；根据标准方法将抗CD19抗体（STEMCE化 Technologies)缀合至磁性微粒。然后在室温下将抗CD19颗粒用PBMC W 0. 5mg/mL的浓度 温育10分钟，然后将样品磁性洗涂4次。
[0220] 2.通过生物素/链霉亲和素的间接标记；在室温下将生物素化的抗CD19抗体（克 隆HIB19, Biolegend)用PBMC W 1. 5ug/mL的浓度温育10分钟。接着，W 0. 5mg/mL的浓度 加入链霉亲和素缀合的磁性颗粒（STEMCE化Technologies)并再温育10分钟。然后将样 品磁性洗涂4次。
[02引] 连施例9
[0222] 根据图9的示意图使用PEG/抗阳G系统用于在细胞分离后调节颗粒-细胞抗体 亲抗原性并使颗粒释放最大化的工序。相似的方法可W应用于优化其它第一聚合物、配体 和第二聚合物的组合。首先，使用实施例2的方法制备含有抗PEG抗体和针对期望的细胞 类型（CD45、CD8等）的抗体的TAC。根据实施例1制备缀合至不同大小和/或密度的PEG 的颗粒。接着，使用不同的纳米颗粒或微粒，根据实施例6中的工序进行细胞分离。在此工 序中，使TAC在细胞混合物中的浓度在0. 01-5ug/mL发生变化，并且使颗粒浓度在很宽的范 围内发生变化。在实施例6中所述的颗粒温育和磁性分离步骤后，使用Pluronic F68或不 同大小的PEG使用实施例7所述的方法从细胞释放颗粒。通过评估通过计数的所选细胞的 回收率（产率）、通过用英光抗体染色和流式细胞术的其纯度W及使用W下计算的标记释 放效率来确定用于细胞分离性能的最佳条件：
[0223]
【主权项】
1. 一种将样品中的生物靶标与标记分离的方法，其包括： 1) 通过连接系统使所述生物靶标与所述标记结合，所述连接系统包含第一聚合物和与 所述第一聚合物结合的配体；和 2) 向所述样品中加入第二聚合物以将所述生物靶标与所述标记分离。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物对于所述配体 具有相似的未和力。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述连接系统包含与连接至与第一聚合物结 合的配体的所述生物靶标结合的配体和与所述第一聚合物缀合的标记。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述连接系统包含与连接至第一聚合物的所 述生物靶标结合的配体和与结合到所述第一聚合物的配体缀合的标记。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物 基本上由均聚物区域组成。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物 是亲水性的或两亲性的。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物 由相同或相似的单体组成。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物 独立地选自PEG、PEG衍生物、聚（羧基甜菜碱）、葡聚糖、淀粉、肝素、几丁质、纤维素、肽和 核酸。
9. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一聚合物是PEG、Pluronic F68和吐温20。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述第二聚合物选自由PEG、Pluronic F68和吐 温20组成的组。
11. 根据权利要求9所述的方法，其中所述第二聚合物是Pluronic F68。
12. 根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述第二聚合物的浓度为至少 0? 10% w/v，优选至少0? 25% w/v，最优选至少1. 0% w/v。
13. 根据权利要求8所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物是葡聚糖。
14. 根据权利要求8所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物是多组氨酸 (pHIS)。
15. 根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述标记选自固体载体、荧光蛋白 和染料、抗体、酶、功能蛋白、肽或生长因子和放射性标签或元素标签。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述标记是选自颗粒、表面和柱的固体载体。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述标记是选自纳米颗粒、微粒、微球或珠的颗 粒。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述颗粒是磁性颗粒、致密颗粒或荧光颗粒。
19. 根据权利要求3所述的方法，其中与所述生物靶标结合的所述配体是抗体，并且结 合所述第一聚合物的所述配体是抗体，其中所述抗体连接在一起作为双特异性抗体。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述双特异性抗体是四聚体抗体复合物（TAC)。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述TAC的浓度小于5 yg/ml，优选小于 1. 5 y g/ml 〇
22. 根据权利要求4所述的方法，其中与所述生物靶标结合的所述配体是抗体。
23. 根据权利要求4或22所述的方法，其中与所述第一聚合物结合的所述配体是抗体。
24. 根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述生物靶标选自细胞、细胞器、 病毒、朊病毒、DNA、RNA、抗体、蛋白质、肽和小分子。
25. 根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述生物靶标是细胞。
26. 根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述第一聚合物具有的分子量高 于0. 5kDa，优选商于5kDa。
27. 根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述第二聚合物具有的分子量大 于0. 5kDa，优选大于5kDa，更优选大于8kDa。
28. 根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述第二聚合物施用小于10分 钟，优选小于5分钟，更优选小于1分钟，最优选小于30秒。
29. -种用于分离生物靶标和标记的组合物，其包含： 1) 使所述生物靶标与所述标记结合的连接系统，其中所述连接系统包含第一聚合物和 与所述第一聚合物结合的配体；和 2) 可将所述生物靶标与所述标记分离的第二聚合物。
30. 根据权利要求29所述的组合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物对于所述 配体具有相似的亲和力。
31. 根据权利要求29或30所述的组合物，其中所述连接系统包含与连接至与第一聚合 物结合的配体的所述生物靶标结合的配体和与所述第一聚合物缀合的标记。
32. 根据权利要求29或30所述的组合物，其中所述连接系统包含与连接至第一聚合物 的所述生物靶标结合的配体和与结合到所述第一聚合物的配体缀合的标记。
33. 根据权利要求29至32中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚 合物基本上由均聚物区域组成。
34. 根据权利要求29至33中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚 合物是亲水性的或两亲性的。
35. 根据权利要求29至34中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚 合物由相同或相似的单体组成。
36. 根据权利要求29至35中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚 合物独立地选自PEG、PEG衍生物、聚（羧基甜菜碱）、葡聚糖、淀粉、肝素、几丁质、纤维素、 肽和核酸。 3 7.根据权利要求2 9至3 5中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物是PEG、 Pluronic F68 和吐温 20。
38. 根据权利要求37所述的组合物，其中所述第二聚合物选自由PEG、Pluronic F68和 吐温20组成的组。
39. 根据权利要求37所述的组合物，其中所述第二聚合物是Pluronic F68。
40. 根据权利要求36至39中任一项所述的组合物，其中所述第二聚合物的浓度为至少 0? 10% w/v，优选至少0? 25% w/v，最优选至少1. 0% w/v。
41. 根据权利要求36所述的组合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物是葡聚 糖。
42. 根据权利要求36所述的组合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物是多组氨 酸（PHIS)。
43. 根据权利要求29至42中任一项所述的组合物，其中所述标记选自固体载体、荧光 蛋白和染料、抗体、酶、功能蛋白、肽或生长因子和放射性标签或元素标签。
44. 根据权利要求43所述的组合物，其中所述标记是选自颗粒、表面和柱的固体载体。
45. 根据权利要求44所述的组合物，其中所述标记是选自纳米颗粒、微粒、微球或珠的 颗粒。
46. 根据权利要求45所述的组合物，其中所述颗粒是磁性颗粒、致密颗粒或荧光颗粒。
47. 根据权利要求31所述的组合物，其中与所述生物靶标结合的所述配体是抗体，并 且结合所述第一聚合物的所述配体是抗体，其中所述抗体连接在一起作为双特异性抗体。
48. 根据权利要求47所述的组合物，其中所述双特异性抗体是四聚体抗体复合物 (TAC)。
49. 根据权利要求48所述的组合物，其中所述TAC的浓度小于5 y g/ml，优选小于 1. 5 y g/ml〇
50. 根据权利要求32所述的组合物，其中与所述生物靶标结合的所述配体是抗体。
51. 根据权利要求32或50所述的组合物，其中与所述第一聚合物结合的所述配体是抗 体。
52. 根据权利要求29至51中任一项所述的组合物，其中所述生物靶标选自细胞、细胞 器、病毒、朊病毒、DNA、RNA、抗体、蛋白质、肽和小分子。
53. 根据权利要求29至51中任一项所述的组合物，其中所述生物靶标是细胞。
54. 根据权利要求29至53中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物具有的分子量 高于0. 5kDa，优选高于5kDa。
55. 根据权利要求29至54中任一项所述的组合物，其中所述第二聚合物具有的分子量 大于0. 5kDa，优选大于5kDa，更优选大于8kDa。
56. -种细胞分离试剂盒，其包括： a) 含有抗体的TAC，所述抗体与连接至结合PEG的抗体的人⑶25+细胞结合； b) PEG缀合的磁性颗粒；和 c) 由Pluronic F68组成的释放剂。
57. 根据权利要求56所述的试剂盒，其还包括： d) 葡聚糖缀合的磁性颗粒； e) 含有抗体的TAC，所述抗体与连接至结合葡聚糖的抗体的人⑶127+细胞结合；和 f) 含有抗体的TAC混合物，所述抗体靶向连接至结合葡聚糖的抗体的所有人类非CD4+ 细胞。
【专利摘要】本发明提供了用于实现在生理条件下快速可逆的低抗体亲抗原性、高亲和力和高特异性的生物分子相互作用的组合物和方法。所述方法包括使生物靶标(诸如分子、蛋白质、DNA、细胞等)与聚合物和抗聚合物配体连接以及使用生理上相容的聚合化合物来逆转它们结合的方法。所述方法还包括对用于正交标记的不同聚合物/抗聚合物系统进行组合的方法。所述组合物包含包括与聚合物缀合的颗粒(荧光、磁性、致密等)的标记或与抗聚合物抗体缀合的标记。所述组合物还包含与所述聚合物缀合的生物分子(蛋白质、抗体、DNA等)。这些方法和组合物展示出对现有技术的重大改进。它们特别可用于使用颗粒来分离和隔离生物靶标，对包括荧光成像在内的其它领域具有重要应用。
【IPC分类】G01N1-34, B01D15-08
【公开号】CN104620093
【申请号】CN201380047468
【发明人】S·J·克拉克
【申请人】干细胞技术公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2013年8月22日
【公告号】CA2880765A1, EP2888571A1, US20150204857, WO2014029012A1