用于快速可逆生物分子标记的组合物和方法

用于快速可逆生物分子标记的组合物和方法
【专利说明】用于快速可逆生物分子标记的组合物和方法 发明领域
[0001] 本发明涉及用于将样品中的生物祀标与其标记快速分离的方法和组合物。
[0002] 发明背景
[0003] 生命科学和医学领域中的许多不同应用需要对生物祀标（诸如分子、DNA、蛋白质 或细胞）进行特异性标记。标记提供使用标记的新的功能或物理特性（英光、磁性、密度、 酶活性、放射性等）对来自复杂生物样品内的祀标进行检测或操纵的灵敏方法。例如，英光 标记能够使生物祀标（在某些情况下W分子灵敏的程度）可视化。英光技术正在革新从研 究工作台到临床的许多生物学领域。同样地，磁性标记能够实现使用磁共振成像（MRI)或 医学颗粒成像（MPI)技术（均为当前重要的临床诊断手段）对生物祀标进行成像。磁性标 记的另一个重要应用是用于使用磁场从复杂样品中分离和纯化生物祀标（主要是DNA、蛋 白质或细胞）。
[0004] 磁性标记和分离已被广泛应用，并革新了细胞分离领域。细胞分离涉及在细胞物 理或功能特性基础上从复杂生物样品（血液、组织、骨等）中分离特定细胞类型。英光激活 细胞分选（FAC巧是一种在用英光抗体标记后细胞受体表达的基础上分离所述细胞的流式 细胞术形式。然而，FACS的缺点是分离费时且产量低。对于磁性分离，通常利用蛋白质或 抗体的亲和结合特性（通常称为免疫标记的方法）使磁性微粒或纳米颗粒祀向细胞受体。 缀合到抗体或蛋白质的磁性微粒或纳米颗粒用于选择性地祀向复杂的生物样品内的细胞。 阳性选择是所需细胞类型被颗粒直接标记并通过磁性洗涂分离的常用方法。相反，对于阴 性选择（或贫化/富集），不需要的细胞类型被颗粒标记并通过施加磁场而去除，W未标记 的形式分离所需细胞。阳性选择的优点是分离的细胞通常比阴性选择的纯度更高，但缺点 是它们具有结合到其表面上的颗粒。阴性选择使得所需细胞保持未被标记，但缺点是纯度 通常比阳性选择更低，并且需要混合多个抗体W标记不想要的细胞。阳性和阴性免疫磁性 细胞分离策略是目前众多商用产品支持的完善技术。该些产品通常采用缀合到一级或二次 抗体、缀合到链霉亲和素W与生物素化的抗体一起使用或缀合到葡聚糖W与四聚体抗体复 合物（TAC) -起使用的磁性颗粒。
[0005] 细胞分离领域目前要求更快还更复杂的策略W从相同样品中分离多种细胞类型、 W分离不容易由其受体表达定义的细胞亚群，并且要求改进的策略用于分离非常罕见的细 胞类型，在所有该些的同时保持细胞天然或接近天然状态。对于免疫磁性技术，分离多种细 胞类型或不由单一受体表达定义的细胞类型的方法是采用阳性或阴性选择和正交标记技 术的组合。大多数连续分离应用，特别是涉及多个阳性选择或阳性选择随后阴性选择的那 些应用，要求在第一轮分离后从细胞表面有效去除磁性标记，而不损害细胞的活力或回收 率（产率）。即使对于简单的阳性选择，非常需要W去除颗粒的方式来减轻颗粒对细胞的功 能或活力的干扰。已知的是微粒或纳米颗粒可W通过不同的方法内化到细胞中，该取决于 颗粒表面的物理和化学特性W及具体的细胞类型（Verma and Stellacci 2010)。除了细胞 功能，细胞表面上的颗粒可干扰许多下游测定。例如，在流式细胞术分析过程中，当颗粒存 在时细胞的粒度测量（侧向散射）向较大的值偏移，该使识别特定细胞群变得复杂。在细 胞表面上具有颗粒的另一缺点是，氧化铁可w浑灭英光信号，从而降低了在分离的细胞上 进行免疫英光测定的灵敏度。从临床前和临床观点来看，如果要将分离的细胞用于包括细 胞治疗应用的人类研究中，那么重要的是细胞呈其天然或接近天然形式、不含杂质和颗粒、 具有高功能性和活性。
[0006] 温和地从细胞表面去除颗粒仍然是一个挑战，因为免疫细胞分离领域的技术人员 知道，高亲和力抗体/抗原或蛋白质相互作用（Kd?1-lOOnM)需要将颗粒和细胞连接一起。 此类高亲和力相互作用能够在若干轮磁性洗涂下W高纯度和产率分离细胞，但通常仅在对 细胞有破坏性的溶液条件下逆转。在过去的20年中，已经提出许多不同方法W从细胞中去 除颗粒，但许多方法损伤细胞、降低活力、改变功能特性或者它们过于复杂和费时。
[0007] 该些策略中的一些包括将细胞在培养基中过夜温育、改变抑、温度、盐、加入还原 剂来裂解抗体，或使用机械剪切力来破坏来自细胞表面的颗粒。
[0008] 美国专利号5, 081，030描述了使用消化酶如木瓜蛋白酶从细胞去除颗粒的方法。 同样，欧洲专利号EP0819250B1描述了使用糖巧酶来释放颗粒的方法。一旦抗体缀合的颗 粒已经祀向细胞并且细胞被磁性纯化，则将酶加至细胞息液中W消化参与颗粒细胞连接的 蛋白质、抗体或多糖。此方法的缺点是，酶的成本高昂，它们在储存过程中容易分解，所述方 法是费时的，而且某些酶通过消化细胞表面蛋白而改变细胞功能。
[0009] Werther等（Werther, Normark等2000)描述了链霉亲和素-生物素系统与裂解 DNA接头的联合使用。为去除来自选定细胞的颗粒，将息浮液用面ase酶温育。此构思是 来自Dynal的磁性细胞分离的CE化ection产品线的基础。所述方法的优点在于，所述酶对 DNA接头具有特异性，但它具有先前提到的基于酶的系统的缺点。
[0010] 美国专利号5, 429, 927描述了使用二次抗体来破坏抗体缀合的颗粒与其细胞表 面的受体的相互作用W从细胞去除颗粒的方法。在一种形式中，所述二次抗体是直接与 一次抗体结合从而诱导构象改变并释放所述颗粒的多克隆抗Fab。此方法是来自Dynal 的DETACHa邸AD颗粒去除系统的基础，并且也已被Rasmussen等（Rasmussen, Smeland等 1992)和Geretti等（Geretti,Van Els等1993)描述。此方法的缺点是，它对于最终使用 者是费时的（?45-60分钟方法），对于高效颗粒释放要求高浓度的二次抗体，并且根据一 次抗体的克隆和种类需要独特的二次抗体。
[0011] 美国专利号5, 773, 224描述了肝素/抗凝血酶HI用于W列形式的阳性选择和细 胞洗脱。所述方法使用与肝素缀合的固相柱，装载生物素化的抗凝血酶III，并随后通过抗 生物素蛋白交联。使用所需细胞类型的一次抗体和生物素化的二次抗体来选择细胞。通过 增加固相细胞相互作用的抗体亲抗原性（avidity)的抗生物素蛋白交联来提高抗凝血酶 III对于肝素的中等亲和力。当在分离结束加入游离的可溶性肝素时，它竞争抗凝血酶III 结合位点并从柱释放细胞。逆转是有效的，因为单个肝素/抗凝血酶III相互作用弱到足 W被直接竞争破坏。所述方法的缺点是，需要交联剂来提高标记的性能，因为它使细胞分离 过程变得复杂。另一个缺点是，此方法限于肝素/抗凝血酶III，因为肝素是血液中常见的 抗凝血剂，所述方法不包括处理该些类型的样品。
[0012] 美国专利号5, 985, 658描述了使用巧调蛋白和巧调蛋白结合肤之间的可逆相互 作用从细胞中去除颗粒的方法。将细胞用所需细胞类型的一次抗体、随后用肤缀合的二次 抗体和巧调蛋白缀合的颗粒标记。蛋白和肤通过巧离子桥结合。颗粒去除通过加入去除离 子并逆转结合的EGTA馨合剂而触发。
[0013] 美国专利号6, 017, 719描述了使用工程化的肤来置换来自细胞表面的抗体缀合 的磁性颗粒的方法。肤结合至祀向抗体，并且通过竞争结合位点或引起抗体构象变化而从 细胞表面置换它们。所述方法的主要缺点是必须合理设计并选择用于将颗粒祀向细胞的每 个抗体的独特的肤。
[0014] 生物素和链霉亲和素或抗生物素蛋白具有极高的亲和力（?fM)，并且通过生物 素化的抗体和链霉亲和素或抗生物素蛋白缀合的颗粒方式已被广泛用于细胞分离。鉴于其 高亲和力，所述相互作用通常仅在蛋白变性和细胞破坏的条件下是可逆的。美国专利申请 2008/0255004描述了重组修饰的链霉亲和素和修饰的生物素（脱硫生物素）的用途，其与 天然链霉亲和素/生物素相比共同具有显著降低的亲和力。通过加入置换较低亲和力脱硫 生物素的天然生物素来逆转该种相互作用。为使细胞分离，使脱硫生物素与一次抗体缀合 并且使磁性颗粒与突变形式的链霉亲和素缀合。此方法现在是来自Dynal的磁性细胞分离 的FlowComp产品线的基础。此方法的一个限制是，与脱硫生物素缀合的抗体不能广泛用于 许多细胞类型，并且需要由最终使用者来制备。
[0015] 美国专利号7, 776, 562和WIP0专利申请W02013/011011还描述了重组工程系统 用于可逆磁性细胞分离（和/或英光标记）的用途。此方法是基于抗原特异性MHC分子或 表达融合肤诸如streptag的F油片段的弱亲和力。Streptag结合streptactin，一种保留 其对生物素特异性的链霉亲和素的突变形式。当streptactin缀合的磁性颗粒装载MHC分 子或Fab片段时，在颗粒-细胞相互作用中有足够的抗体亲抗原性W能够特异性祀向和分 离所需细胞类型。在分离结束时加入游离的可溶性生物素从streptag置换streptactin并 释放颗粒。在细胞表面上弱结合的血1C分子或Fab片段也被去除，因为随着颗粒释放抗体 亲抗原性丧失。此方法具有对于每个不同细胞类型都需要融合至streptag的重组抗体的 主要缺点，并且如美国专利号5, 773, 224,需要另外的交联剂W增加结合伴侣的亲合性（抗 体亲抗原性）。此构思现在是由IBA GmbH提供的Streptamer磁性细胞分离试剂的基础。
[0016] 在免疫磁性细胞分离中用于可逆标记的该些方法的发展已经朝着对细胞更温和 但增加了标记试剂（重组工程化的蛋白质/抗体、交联剂）和细胞分离方法（许多标记步 骤、长持续时间）的复杂性的方法进行。因此，仍然存在对于改进的可逆标记技术的重要需 求，其更快、使用更简单的试剂并且在不同细胞类型和种类之间广泛起作用。在细胞分离领 域，改进的方法和组合物在临床前、临床和细胞治疗市场是需要的，并且用于要求呈接近天 然形式的高功能和活力细胞（包括通过连续分离而分离的特定细胞亚群）的基础研究应 用。在细胞分离领域W外，快速可逆标记对于许多应用（包括基于分子、DNA和蛋白质的纯 化、生物样品的英光成像）是需要的。
[0017] 考虑到随着医学和生命科学应用，对于改进的可逆标记系统的理想要求包括；1) 标记与其生物祀标（细胞受体的颗粒）的高亲和性结合，2)使用温和释放试剂（对细胞温 和）快速和高效去除标记（颗粒），3)对不同祀标（包括细胞类型和种类）和应用（包括 英光）的广泛适用性，4)与正交标记（用于连续或同时分离）兼容，5)可获得的、廉价的和 稳定的试剂W及6)容易进行自动化（简单和快速过程）。
[001引发明概述
[0019] 本发明提供了用于实现在生理条件下快速可逆的低抗体亲抗原性、高亲和力和高 特异性的生物分子相互作用的组合物和方法。所述方法包括使生物祀标（诸如分子、蛋白 质、DNA、细胞等）与聚合物和抗聚合物配体连接W及使用生理上相容的聚合化合物来逆转 它们结合的方法。所述方法还包括对用于正交标记的不同聚合物/抗聚合物系统进行组合 的方法。所述组合物包含包括与聚合物缀合的颗粒（英光、磁性、致密等）的标记或与抗聚 合物抗体缀合的标记。所述组合物还包含与所述聚合物缀合的生物分子（蛋白质、抗体、 DNA等）。该些方法和组合物展示出对现有技术的重大改进。它们特别可用于使用颗粒来 分离和隔离生物祀标，对包括英光成像在内的其它领域具有重要应用。
[0020] 因此，本发明提供一种将样品中的生物祀标与标记分离的方法，其包括：
[0021] 1)通过连接系统使所述生物祀标与所述标记结合，所述连接系统包含第一聚合物 和与所述第一聚合物结合的配体；和
[0022] 2)向所述样品中加入第二聚合物W将所述生物祀标与所述标记分离。
[0023] 在一个实施方案中，本发明提供一种将样品中的生物祀标与标记分离的方法，其 包括：
[0024] 1)使用连接系统使所述生物祀标与所述标记结合，所述连接系统包含与连接至与 第一聚合物结合的配体的生物祀标结合的配体和与所述第一聚合物缀合的标记；和
[00巧]2)向所述样品中加入第二聚合物W将所述生物祀标与所述标记分离。
[0026] 在另一个实施方案中，本发明提供一种将样品中的生物祀标与标记分离的方法， 其包括：
[0027] 1)使用连接系统使生物祀标与标记结合，所述连接系统包含与连接至第一聚合物 的生物祀标结合的配体和与结合到所述第一聚合物的配体缀合的标记；和
[0028] 2)向所述样品中加入第二聚合物W将所述生物祀标与所述标记分离。
[0029] 本发明还提供一种将生物祀标和标记分离的组合物，其包含：
[0030] 1)使所述生物祀标与所述标记结合的连接系统，其中所述连接系统包含第一聚合 物和与所述第一聚合物结合的配体；和
[0031] 2)可将所述生物祀标与所述标记分离的第二聚合物。
[0032] 在一个实施方案中，本发明还提供一种用于将生物祀标和与第一聚合物缀合的标 记分离的组合物，其包含：
[0033] 1)用于使所述生物祀标与所述标记结合的连接系统，所述连接系统包含与所述生 物祀标结合的配体，所述生物祀标连接至与缀合至所述标记的聚合物结合的配体；和
[0034] 2)用于分离所述生物祀标与所述标记的第二聚合物。
[00巧]在另一个实施方案中，本发明还提供一种用于将生物祀标和与结合到第一聚合物 的配体连接的标记分离的组合物，其包含：
[0036] 1)用于使所述生物祀标与所述标记结合的连接系统，所述连接系统包含与所述生 物祀标结合的配体，所述生物祀标连接至与缀合至所述标记的配体结合的第一聚合物；和
[0037] 2)用于分离所述生物祀标与所述标记的第二聚合物。
[0038] 本发明的其它特征和优点通过下列详述将变得明显。然而应该理解，虽然详述和 具体实施例示出本发明的优选实施方案，但它们仅通过说明的方式给出，因为通过此详述， 本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得明显。
[0039] 附图简述
[0040] 图1是应用于可逆标记细胞祀标（或其它生物分子）的本发明的使用方法的示意 图示。a)在此型式中，使诸如含有针对祀细胞受体的抗体和第一聚合物的双特异性四聚体 抗体复合物（TAC)的连接配体与细胞和第一聚合物缀合的标记一起温育。b)在标记和纯 化或检测后，通过加入游离的可溶性第二聚合物或衍生物来去除（释放）聚合物缀合的标 记。可洗掉释放的标记，并且可通过正交技术使祀细胞经受进一步（连续）的标记或用于 下游测定和应用中。不同类型的标记尤其包括英光基团（flourophore)、磁性颗粒、酶或同 位素。
[0041] 图2是应用于可逆标记细胞祀标（或其它生物分子）的本发明的使用方法的示意 图示。a)在此型式中，使针对祀细胞受体的第一聚合物缀合的抗体与细胞和缀合至抗聚合 物抗体配体的标记一起温育。b)通过加入游离的可溶性第二聚合物或衍生物从祀细胞中去 除标记。
[0042] 图3显示使用聚（己二醇）（PEG)和颗粒标记作为实例来制备第一聚合物缀合的 标记、配体缀合的标记和第一聚合物缀合的配体的几种化学物质。a)具有表面琉基（SH) 基团的标记可W在一个步骤中缀合至含有琉基反应性马来醜亚胺基团的PEG。具有表面胺 (畑2)基团的标记可W在一个步骤中缀合至含有胺反应性N服(N-轻基玻巧醜亚胺）基团的 PEG。可W使用与駿基反应而形成胺反应性中间体的1-己基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳 二亚胺巧DC)使具有表面駿基（C00H)基团的标记一步缀合至含有N&的阳G。b)标准缀 合技术也可W应用于制备缀合至抗聚合物配体（诸如抗PEG抗体）的标记。该尤其包括抗 体与标记表面的非共价吸收，或其使用邸C的共价连接（示出）。C)相似的缀合策略可应 用于使配体（诸如DNA、肤、蛋白质或抗体）与聚合物官能化。示出的是含有NHS的PEG与 蛋白质或抗体的含有胺的赖氨酸残基的缀合。除了 PEG聚合物，该些缀合策略可W扩展至 本发明的其它聚合物。
[0043] 图4示出在PEG作为第一聚合物、抗PEG抗体作为配体并且Pluronic F68作为第 二聚合物的BIAcore 3000表面等离子共振仪上进行的可逆标记测定的结果。a)使用邸C 缀合化学将駿化的CM5传感器芯片用胺化的lOkDA PEG官能化。使用所示浓度故直定流速 将抗PEG抗体（克隆C肥074)注射到表面上保持120砂（缔合）。接着，将hepes缓冲盐水 (皿巧缓冲液注射到表面上保持180砂（解离）。观察到抗PEG对PEG化表面的特异性和 浓度依赖性结合，而未观察到抗CD8抗体对照的结合。b)示出在注射阳G衍生物Pluronic F68的1% (w/v)溶液后快速释放抗PEG抗体。使用甘氨酸-HCL缓冲液使表面再生。此数 据的显著特征是在加入Pluronic F68后快速（<1砂）并高效（>95% )去除表面结合的抗 PEG。使用双分子结合模型并考虑质量传递限制因素估计来自缔合和解离步骤的抗PEG抗 体的亲和力化D)在1. 8-7. 8nM的范围内。
[0044] 图5示出在使用缀合至阳G的颗粒状聚苯己帰标记作为第一聚合物、抗阳G抗体 作为配体和Pluronic F68作为第二聚合物的流式细胞仪上进行的可逆标记测定法的结果。 a)使20kDa阳G缀合至6.0um聚苯己帰（P巧颗粒并且在初始标记和下游逆转（释放）中 评估其与抗PEG抗体（克隆3F12-1)相互作用的特异性。b)当PEG化的PS颗粒与抗PEG 一起温育时，检测到超过背景（灰色填充）的信号（实线）。加入1 % (w/v)的Pluronic F68后，信号被减少到接近背景（虚线），该表明PEG/抗阳G相互作用的有效可逆性。当 Pluronic F68在PS颗粒之前加至抗PEG抗体中时，没有检测到相互作用（虚线），该证实 具有抑制作用。C)作为对照，PS颗粒与抗PEG(实线）一起温育，但第二聚合物是5kDA葡 聚糖。没有信号减少（虚线），该表明Pluronic F68对释放的特异性。当抗葡聚糖（克隆 DX1)取代抗PEG (虚线）与PS颗粒一起温育时未检测到信号，该表明PEG/抗阳G相互作用 的特异性。在所有样品中，使用大鼠抗小鼠PE作为报道分子来检测抗体。
[0045] 图6示出在使用缀合至PEG的颗粒状磁性标记作为第一聚合物、英光抗PEG抗体 作为配体和各种PEG衍生物作为第二聚合物的流式细胞仪上进行的可逆标记测定法的结 果。a)使30kDa阳G缀合的磁性微粒与英光抗PEG抗体一起温育，同时用不同浓度和大小的 PEG来探测相互作用。为了测试第二聚合物对配体的抑制效果，在与PEG化的颗粒混合（抑 巧||)之