累积能量，调控浮游植物光合电子传递链的阻塞位置％和QB，将光合作用能流过程分为 二段：
[0029] (1)、光源光强调节至30000ymol/m2/s以上，连续激发，70-120ys内可在阻塞位 置QA处形成电子阻塞，产生单周转饱和荧光ST，然后通过快速荧光通道测量单周转荧光动 力学曲线，解析获得功能吸收截面〇PSn、电荷分离效率n、最大光量子效率△ <2 ;
[0030] (2)、光源设置为10kHz、脉宽5yS、平均光强2000ymol/m2/s的高速光脉冲，打开 后重复激发，60_200ms内可在阻塞位置QB处形成电子阻塞，产生多周转饱和焚光MT，通过 快速荧光通道检测多周转荧光动力学曲线，解析获得阻塞位置％到Q^勺电子转移效率;
[0031] (3)、饱和荧光后，将光源切换成10kHz、脉宽2ys、平均光强不超过2ymol/m2/s 微弱光脉冲，持续激发，同时切换到高灵敏荧光检测通道，检测与光源同频的弛豫荧光，利 用弛豫荧光动力学曲线获得PSI以后的电子传递速率利用反演得到的光合参数，进 一步推算出更多光合作用状态的细节参数。
[0032] 植物光合作用过程是活体细胞对光能吸收、转化和利用的过程。根据图1所示植 物光合作用能流过程，植物光合作用状态与光能吸收效率、电荷分离效率以及qa、qb、pq、psi 和Fd等主要电子受体间的电子传递速率有关。叶绿素荧光是光合作用研宄的探针，能够反 映光能吸收、激发能传递、光化学反应、电子传递、质子梯度建立和ATP合成等几乎所有光 合作用过程。
[0033] 本发明专利基于CN201410465026. 3专利提出浮游植物光合速率测量方法，设计 了如图2所示浮游植物光合作用测量装置。测量装置主要由激发-发射光学结构100、光源 驱动模块200、荧光检测模块300、光源参考光检测模块400和主控模块500组成。
[0034] (1)激发-发射光学结构
[0035] 采用板载4行4列16颗LED芯片作为激发光源10,激发光源的中心波长为 468nm(可根据浮游植物对吸收特性选择），前端放置3mm厚的BG39材料滤光片11，滤除荧 光波段处光源光，然后通过截面l〇_X10_的石英导光柱12,照射到样品池13,激发产生 的荧光在90度方向通过透镜聚焦15,经通过3mm厚HP670材料滤光片16和BP685干涉 滤光片17(中心波长685nm，半高宽20nm)，滤去荧光波段以后的干扰光后，由光电倍增管 (PMT) 18接收、荧光检测模块检测。光源透射光由光电二极管14接收、光源参考光检测模块 检测。这样光路设计具有以下优点：①板载LED阵列结合石英导光柱，使激发光能够均匀辐 射到样品池内，确保光照辐射内浮游植物细胞受激发能量一致性；②激发-发射端的滤光 片系统、90度方向荧光接收能够有效克服光源散射光对荧光探测的干扰。
[0036] (2)激发光源驱动模块
[0037] 激发光源驱动模块由直接数字式频率合成器（DDS) 20、储能单元21和大功率M0S 管22组成。DDS在主控模块的16位数/模转换器（DAC)控制下产生振幅、频率、脉宽可精 确调的可变电脉冲，电脉冲信号控制MOS管驱动激发光源产生可变光脉冲，储能单元为光 源提供能量来源，确保能够产生瞬时稳定的强光脉冲。
[0038] (3)荧光检测模块
[0039] 荧光检测模块主要由双通道模拟开关30、快速荧光检测通道31、锁相荧光检测通 道32组成，两个检测通道与PMT探测器之间通过模拟开关切换。①快速荧光探测通道，探 测器信号通过前置放大，由高速数据采集电路采集（采集速率需达到5Mbps以上），采集数 据通过快速数据传输接口输出至主控模块，该通道可实现Is以内快变荧光过程精确测量； ②锁相荧光检测通道，探测器信号和激发光的DDS驱动信号输入通过锁相检测电路，获得 与激发光同频率的荧光信号，制频带以抑的直流背景和噪声，输出信号由主控模块模/数 转换器（ADC)采集，该通道能够实现特定频率荧光的高灵敏探测。
[0040] (4)光源参考光检测模块
[0041] 光源参考光检测模块检测PIN探测信号，实现激发光源光强探测。该模块与荧光 检测模块相同，具有快速检测和锁相检测两个通道。快速检测通道数据通过快速数据传输 接口输出给主控，锁相检测通道信号由主控模块ADC采集。
[0042] (5)主控模块
[0043] 主控模块的以Cortex-M8处理器为核心，结合RAM和Flash存储器、触摸液晶显示 器及其它外围电路，实现激发光源控制、荧光检测模块数据采集、数据分析与处理、以及整 个装置的输入输出控制。
[0044] 2、光合作用参数测量方法与步骤
[0045] 该装置采用快速可变光脉冲作为激发光源，通过设计光源的激发策略（调节光脉 冲振幅、频率、脉宽和激发时序），控制激发光的瞬时能量和累积能量，调控浮游植物光合电 子传递链的阻塞位置（QA、QB)，将光合作用能流过程分为三段进行研宄：①光源光强调节至 30000ymol/m2/s以上，连续激发，70-120ys内可在％处形成电子阻塞，产生单周转饱和荧 光（ST)，然后通过快速荧光通道测量单周转荧光动力学曲线，解析获得功能吸收截面〇PSn、 电荷分离效率n、最大光量子效率A(2等光合作用参数；②光源设置为10kHz、脉宽5ys、 平均光强2000ymol/m2/s的高速光脉冲，打开后重复激发，60_200ms内可在QB处形成电子 阻塞，产生多周转饱和荧光（MT)，通过快速荧光通道检测多周转荧光动力学曲线，解析获得 QJQB电子转移效率③饱和荧光后，迅速将光源切换成10kHz、脉宽2ys、平均光强不 超过2ym〇l/m2/s微弱光脉冲，持续激发，同时切换到高灵敏荧光检测通道，检测与光源同 频的弛豫荧光，利用弛豫荧光动力学曲线获得PSI以后的电子传递速率fa、f?*，如图2所 示。利用反演得到的光合参数，进一步推算出更多光合作用状态的细节参数，包括光化学淬 灭qP，非光化学淬灭NPQ，总电子传递速率rETR等。
【主权项】
1. 基于叶绿素荧光的浮游植物光合作用检测装置，其特征在于：包括激发-发射光学 结构、激发光源驱动模块、主控模块、结构相同的荧光检测模块与光源参考光检测模块，其 中： 所述激发-发射光学结构包括样品池、多个阵列排列的LED芯片构成的激发光源，激发 光源设置在样品池正面外，且激发光源光路前端向样品池依次设置有滤光片、石英导光柱， 样品池与正面垂直的一侧外依次设置有聚焦透镜、滤光片、干涉滤光片、光电倍增管PMT，激 发光源的出射光经过滤光片滤光后被石英导光柱导入样品池，在样品池内激发产生的荧光 在90度方向依次通过聚焦透镜、滤光片、干涉滤光片后被光电倍增管接收； 所述激发光源驱动模块包括直接数字式频率合成器DDS、储能单元、大功率MOS管，直 接数字式频率合成器DDS输出端通过大功率MOS管与激发-发射光学结构中激发光源连 接，储能单元亦与激发光源连接。 所述荧光检测模块与光源参考光检测模块分别包括双通道模拟开关、快速荧光检测通 道、锁相荧光检测通道，激发-发射光学结构中光电倍增管通过双通道模拟开关分别与快 速荧光检测通道、锁相荧光检测通道连接，快速荧光检测通道包括前置放大电路、高速数/ 模转换器、FPGA驱动器、快速数据传输接口，前置放大电路输入与双通道模拟开关连接，前 置放大电路输出与高速数/模转换器输入连接，高速数据采集电路输出与FPGA驱动器输入 连接、FPGA驱动器输出与快速数据传输接口输入连接，快速数据传输接口输出与主控模块 的快速数据传输接口连接。锁相荧光检测通道包括输入端放大器、带通滤波器、信号触法 器、移相器、乘法器、低通滤波器、输出放大器，PMT产生的焚光信号传输给输入端放大器、输 入端放大器输出与带通滤波器输入连接、DDS信号作为参考信号传输给信号触法器、信号触 法器输出与移相器输入连接、移相器输出和带通滤波器输出作为乘法器输入、乘法器输出 与低通滤波器输入连接、低通滤波器输出与输出放大器输入连接、输出放大器输出与主控 模块数/模转换器连接。 所述主控模块由Cortex_M8处理器构建而成，主控模块中Cortex_M8处理器分别与焚 光检测模块和光源参考光检测模块中快速数据传输接口输出、锁相检测电路输出连接。
2. 基于权利要求1所述检测装置的浮游植物光合作用检测方法，其特征在于：通过设 计光源的激发策略，控制激发光的瞬时能量和累积能量，调控浮游植物光合电子传递链的 阻塞位置％和Q B，将光合作用能流过程分为三段： (1)、光源光强调节至30000 ymol/m2/s以上，连续激发，70-120 ys内可在阻塞位置Qa 处形成电子阻塞，产生单周转饱和荧光ST，然后通过快速荧光通道测量单周转荧光动力学 曲线，解析获得功能吸收截面〇PSn、电荷分离效率n、最大光量子效率△小； ⑵、光源设置为10kHz、脉宽5 y s、平均光强2000 ymol/m2/s的高速光脉冲，打开后重 复激发，60_200ms内可在阻塞位置Qb处形成电子阻塞，产生多周转饱和焚光MT，通过快速 荧光通道检测多周转荧光动力学曲线，解析获得阻塞位置仏到(^的电子转移效率$ (3)、饱和荧光后，将光源切换成10kHz、脉宽2 y s、平均光强不超过2 ym〇l/m2/s微弱 光脉冲，持续激发，同时切换到高灵敏荧光检测通道，检测与光源同频的弛豫荧光，利用弛 豫荧光动力学曲线获得PSI以后的电子传递速率％、￥*，利用反演得到的光合参数，进一 步推算出更多光合作用状态的细节参数。
【专利摘要】本发明公开了一种基于叶绿素荧光的浮游植物光合作用检测装置与方法，包括激发-发射光学结构、激发光源驱动模块、主控模块、结构相同的荧光检测模块与光源参考光检测模块。本发明采用可变光脉冲光源，结合双通道信号检测模块，实现单周转、多周转和弛豫三种光诱导荧光动力学过程的快速准确测量，通过解析荧光动力学曲线获得光合作用的功能吸收截面、最大光化学量子效率、电子传递速率等诸多表征光合作用状态的细节参数。
【IPC分类】G01N33-58, G01N21-64
【公开号】CN104819968
【申请号】CN201510230569
【发明人】殷高方, 赵南京, 胡丽, 覃志松, 张小玲, 石朝毅, 肖雪, 马明俊, 段静波, 方丽, 刘建国, 刘文清
【申请人】中国科学院合肥物质科学研究院
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月7日