检测四环素类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及水产品检测的技术领域，尤其涉及一种检测四环素类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002]我国是一个海洋与淡水资源比较丰富的国家，水产品也就自然而然的成为我国居民日常生活中不可缺少的食物。由于我国养殖业的不断发展，我国的水产品对外贸易额也逐年增加。然而，最近几年，我国水产品的年均出口增长率却表现为忽高忽低。在2002年，欧盟更是禁止进口我国的动物源性食品，使我国遭受了近I亿元人民币的经济损失，宄其原因，主要是药物残留超标。
[0003]近年来，随着各方面技术的发展，越来越多的药物被应用于水产养殖，严重威胁着消费者的身体健康，也限制着我国在水产品等方面的出口贸易，建立健全并提高相关方面的检测手段与方法就显得格外重要。在被广泛应用在水产养殖方面的各类药物中，抗生素的使用量就超过了总量的一半。在我国，四环素类药物的使用量占抗生素总使用量的57%。同时，一些发达国家四环素类药物的使用一样比较普遍。例如美国，所有兽药的使用总量中有一半就是四环素类药物。四环素类药物能被普遍使用主要由于它自身具有广谱高效的杀菌功效、价格便宜，并且既能够用来预防和治疗水产养殖过程中动物所患疾病，又能作为促进养殖动物生长的饲料添加剂。然而，使用者在使用该类药物时，又存在着大量使用该类药物、长时间使用该类药物等一系列滥用现象，造成了严重的药物残留。
[0004]现阶段，国内外主要利用高效液相色谱法、毛细管电泳法、微生物法、酶联免疫法、电化学分析法等来对四环素类药物等进行定性和定量检测。高效液相色谱法具有较强的自动化程度程度、精确度也相对较高，但也存在着仪器价格高昂、前处理过程复杂、专业性要求高等不利于广泛使用的缺点；毛细管电泳法操作简便、分析速度快但实验过程中所使用的仪器设备和试剂药品较多，对环境要求也较高，不适用于现场测试等；微生物法对样品本身的要求不高但却存在着特异性差、易受其它药物影响的缺点；酶联免疫法一次性可以处理多个样品、特异性强、灵敏度高但对操作者本身的专业性要求较高，不适于普及使用；化学发光法的检测灵敏度高、容易实现自动化但却存在着对环境要求高的缺点，不适于现场测试。针对目前各类方法的缺点，急需一种能够快速准确适合现场检测并对环境和操作者本身要求较低的四环素类药物残留的检测方法。
[0005]有鉴于此，本发明人研宄和设计了一种检测四环素类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，本案由此产生。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、操作简便，检测快速、准确并适合现场使用的专门检测四环素类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，填补目前尚未有水产品中四环素类药物的胶体金免疫层析试纸条的空白。
[0007]为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是:
一种检测四环素类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水垫依次搭接在所述PVC底板上，所述结合垫包被设有四环素类单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有四环素类药物抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
[0008]一种检测四环素类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法的制备方法，包括以下步骤:
步骤一、胶体金的制备:取I个250 mL烧杯，加入100 mL 0.01%氯金酸溶液，于恒温磁力搅拌器上使用温度档400 °C对其进行加热，加热至沸腾状态后，沸腾时的实际温度为100 °C，保持沸腾30 s后，将温度档变为200 °C，同时转速档调至200 r/min，向烧杯中快速加入500 μ? 4%柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变为红色后再加热10 min，即制得胶体金;
步骤二、金标抗体的制备及纯化:取调好PH为7.9的所述胶体金I mL于1.5 mL离心管中，向离心管中加入9.6 Pg/ml，稀释倍数为6的四环素类单克隆抗体，用涡旋仪涡旋2 min后静置30 min;向离心管中加入100 μ? 10% BSA溶液，用涡旋仪涡旋2 min，静置30 min,制得金标抗体，即四环素类单克隆抗体-胶体金标记物；
同时，将制得的金标抗体溶液于4 0C 2500 r/min，离心20 min，去除下层沉淀，将上清液转到另一离心管中，于4 0C 12000 r/min，离心30 min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释溶液稀释至原体积的1/10，于4 ^保存备用；
步骤三、试纸条的组装:(I)将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC底板上，吸水垫压住NC膜上方1-2 mm ; (2)将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上切割成4 _宽的试纸条；(3)将样品垫和结合垫切成4 mm宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗体溶液中，并于37°C烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫剪成I cm长的小块并贴于PVC底板上，金标垫压住NC膜下方1-2 mm，同时用样品垫压住金标垫下方1-2 mm，根据试纸条长度修剪样品垫；(5)在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被四环素类药物抗原和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线，其中，四环素类药物抗原包被浓度为1.0 mg/mL ;羊抗鼠IgG包被浓度为0.75 mg/mL。
[0009]作为实施例的优选方式，在所述步骤三(3)中，还包括对样品垫和金标垫进行前处理的步骤，即将样品垫与金标结合垫用切条机分别切成4 mm宽的长条，用含有5%的蔗糖、5% BSA和终体积浓度为0.1%的pH为7.9的0.01 mo I/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后将溶液沥干，在37 °C条件下烘干12 h备用。
[0010]作为实施例的优选方式，还包括步骤一之前对试验所用容器的清洗:首先将试验所用容器在重铬酸钾洗液中浸泡24 h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3次；将清洗干净的容器于二氯甲硅烷含量为5%的氯仿中浸泡I min后进行硅化处理；将经过硅化处理过的容器放置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中37 °C进行干燥处理，备用。
[0011]与现有技术相比，本发明具有下列优点:
1、本发明的检测水产品中四环素类药物的胶体金免疫层析试纸条，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短等优点；
2、本发明的检测试纸条不需要任何特殊仪器、设备，可现场操作，检测成本低；
3、本发明的检测试纸条操作简便，不需要专业人员操作；
4、本发明对样品垫与金标垫进行了前处理，使得样品垫与金标垫具有优异的吸水能力及释放能力，进而大大提尚了检测能力；
5、本发明对试验所用容器都进行清洗，最终增强了金标抗体的稳定性。
[0012]说明书附图
图1为本发明胶体金免疫层析试纸条的结构示意图；
图2为本发明实施例3性能检测的灵敏度测试结果图；
图3为本发明实施例3性能检测的特异性测试结果图；其中，从左至右分别为四环素、金霉素、土霉素、青霉素、氯霉素、链霉素测试；
图4为本发明实施例3性能检测的稳定性测试结果图；其中，I号为在常温下保存，2号为在37°C条件下保存；
图5为本发明实施例3性能检测的重复性测试结果图；
图6为本发明实施例4样本测试的试纸条测试结果图；其中，图中从左至右分别为原样、2倍稀释、4倍稀释、8倍稀释、16倍稀释。
【具体实施方式】
[0013]实施例1
如图1所示，本发明揭示了一种检测四环素类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，包括样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素包被膜3、吸水垫4及PVC底板5，所述样品垫1、所述结合垫2、所述硝酸纤维素包被膜3及所述吸水垫4依次搭接在所述PVC底板5上:所述结合垫2包被设有四环素类单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜3上设有检测线31和质控线32，所述检测线31包被有四环素类药物抗原，所述质控线32包被有羊抗鼠IgG。
[0014]实施例2
一种检测四环素类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法的制备方法，包括以下步骤:
步骤一、胶体金的制备:取I个250 mL烧杯，加入100 mL 0.01%氯金酸溶液，于恒温磁力搅拌器上使用温度档400 °C对其进行加热，加热至沸腾状态后，沸腾时的实际温度为100 °C，保持沸腾30 s后，将温度档变为200 °C，同时转速档调至200 r/min，向烧杯中快速加入500 μ? 4%柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变为红色后再加热10 min，即制得胶体金;
步骤二、金标抗体的制备及纯化:取调好PH为7.9的所述胶体金I mL于1.5 mL离心管中，向离心管中加入9.6 Pg/ml，稀释倍数为6的四环素类单克隆抗体，用涡旋仪涡旋2 min后静置30 min;向离心管中加入100 μ? 10% BSA溶液，用涡旋仪涡旋2 min，静置30 min,制得金标抗体，即四环素类单克隆抗体-胶体金标记物；
同时，将制得的金标抗体溶液于4 0C 2500 r/min，离心20 min，去除下层沉淀，将上清液转到另一离心管中，于4 0C 12000 r/min，离心30 min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释溶液稀释至原体积的1/10，于4 ^保存备用；
步骤三、试纸条的组装:(I)将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC底板上，吸水垫压住NC膜上方1-2 mm ; (2)将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上切割成4 _宽的试纸条；(3)将样品垫和结合垫切成4 mm宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗体溶液中，并于37°C烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫剪成I cm长的小块并贴于PVC底板上，金标垫压住NC膜下方1-2 mm，同时用样品垫压住金标垫下方1-2 mm，根据试纸条长度修剪样品垫；(5)在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被四环素类药物抗原和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线，其中，四环素类药物抗原包被浓度为1.0 mg/mL ;羊抗鼠IgG包被浓度为0.75 mg/mL。
[0015]作为实施例的优选方式，在所述步骤三(3)中，还包括对样品垫和金标垫进行前处理的步骤，即将样品垫与金标结合垫用切条机分别切成4 mm宽的长条，用含有5%的蔗糖、5% BSA和终体积浓度为0.1%的pH为7.9的0.01 mo I/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后将溶液沥干，在37 °C条件下烘干12 h备用。
[0016]作为实施例的优选方式，还包括步骤一之前对试验所用容器的清洗:首先将试验所用容器在重铬酸钾洗液中浸泡24 h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗