3次；将清洗干净的容器于二氯甲硅烷含量为5%的氯仿中浸泡I min后进行硅化处理；将经过硅化处理过的容器放置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中37°C进行干燥处理，备用。在本试验中所用到的容器干净与否，最终获得的胶体金溶液的质量有着很大的差别。假如容器存在杂质或灰尘，那么它们就能够在一定程度上影响金颗粒的形成，最终影响胶体金溶液中颗粒的均一性，同时也会造成后续试验中获得的金标抗体的稳定性变差，所以容器使用前需经过上述一系列处理。
[0017]实施例3 性能检测
3.1灵敏度测试
[0018]用pH为7.9的0.01mol/L的PBS溶液将四环素、金霉素、土霉素的标准品配制为100 Pg/kg、50 Pg/kg、25 Pg/kg、15 Kg/kg等不同的浓度梯度，然后用已经组装好的四环素类药物胶体金免疫层析试纸条进行检测，结果如图2所示。
[0019]由图2可知，四环素标准品的含量是15 Pg/L的情况下，通过肉眼观察，试纸条的T线处有一条淡淡的红色，而当四环素标准品的含量是20 μ§/1的情况下，试纸条显一条线(质控线)，所以试纸条对于四环素标准品的检测下限是20 Pg/L ;金霉素标准品的含量是15Kg/L的情况下，通过肉眼观察，试纸条T线处也有一条淡淡的红色，比进行四环素检测时要深，而当标准品的浓度为20 μ§/1时，试纸条显一条线，所以试纸条对于金霉素的检测灵敏度为20 Pg/L;土霉素标准品的含量是15、20 Pg/L的情况下，通过肉眼观察，试纸条显两条线，而当土霉素标准品的含量是25 Pg/L的情况下，试纸条显一条线，所以本试验制得的试纸条对于土霉素的测定下限是25 Pg/L。
3.2特异性测试
[0020]用结构与四环素类药物相类似的青霉素、氯霉素、链霉素等对试纸条的特异性进行测试。用pH为7.9的0.01 mol/L的PBS溶液将各标准品稀释至不同的浓度梯度，阴性用PBS溶液测试，用同一批试纸条进行测试，观察结果，结果如图3所示。
[0021]由图3可知，试纸条在四环素浓度大于20 Pg/L、金霉素浓度大于15 Pg/L、土霉素浓度大于25 Pg/L时均显阳性。而当类似物浓度小于200 Pg/L时，四环素类药物胶体金免疫层析试纸条对于青霉素、氯霉素、链霉素等类似物均无明显的交叉反应，证明制得的试纸条的特异性较好。
3.3稳定性测试
[0022]将组装好的试纸条放置于不同的塑料袋中(内置干燥剂)，封口密闭分别于室温及37°C条件下进行保存，放置15 d后，选用不同放置条件下保存的试纸条用标准品和阴性样品进行测试，验证四环素类药物胶体金免疫层析试纸条的稳定性，结果如图4所示。
[0023]试验中发现，在常温条件下保存15 d，试纸条检测线与质控线的颜色没有太大变化。从图4可以看出，在37 °C条件下保存的试纸条，测试时检测线与质控线的颜色比在常温条件下存放的要深。出现这种现象的原因主要是由于在37 °C条件下保存的试纸条中的抗原抗体在一定时间段内保持着较高的免疫活性并由于温度的提高获得了更多的活化能使抗原与抗体的特异性反应更容易进行。
3.4重复性测试
[0024]用同一批次的试纸条检测不同批次的样品；再用不同批次的试纸条对同一批次的样品进行检测，观察结果，结果如图5所示。
[0025]从图5中可以看出，同一批次内进行重复性试验的8条试纸条，2条用于检测阴性样品(包括小于试纸条检测限的阳性样品)，试纸条均显示两条线，为阴性；6条用于测定阳性样品，试纸条都只有一条线显色(只显示质控线)，为阳性。证明同一批次内，试纸条的重复性较好。
[0026]同时，采用3批次共计12条试纸条(每一批次4条)检测已知浓度样品，最终三批的测定结果一致，证明不同批次的试纸条的重复性较好。
[0027]实施例4样品测试
样品处理:用天平10 g左右已经切碎的虾肉组织样本，用均质机对该组织样本进行均质，均质完成用电子天平取得I g左右，将其放入5 mL离心管中；用移液枪向其中加入2 mLpH为4.0的Mclvaine-EDTA溶液，用漩涡仪涡旋3分钟后，温度低于15°C的情况下，用离心机在4000 r/min转速下离心15 min ;用移液枪取ImL上述离心后的上清液加入5 mL离心管中，向其中加入0.1 mL 4 mol/L的NaOH溶液，用漩涡仪涡旋2 min，然后向其中加入2 mL正己烷，用漩涡仪涡旋2 min，静置等其分层后将下层溶液移出等待检测。
4.1试纸条测试
[0028]选取市场上出售的对虾作为试验对象，称取2份10 g左右的该虾肉组织，标号1、2，两份样品作为平行试验，两份样品均按照如前所述的样品处理方法进行处理，取提取液用制备的试纸条进行检测，结果如图6所示。
[0029]从图6可以看出，经过提取得到的样品原液经检测显示为阳性，而该试纸条的灵敏度为混标时为10 μ§/1 (即三类药物的含量均为10 Pg/L)，可以初步判定本试验中所使用的虾肉中的四环素类药物含量60 Pg/kg以上。为进一步确定该样品中四环素类药物的含量，对该样品原液进行了 2倍、4倍、8倍、16倍稀释，从图6中可以看出当稀释倍数为16倍时会出现明显的两条线即此时的检测结果为阴性。综上，初步判定该虾肉的四环素类药物含量在480?960 Pg/kg附近。
4.2液质联用测试
[0030]按照GB/T 21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留检测方法中液质联用的前处理方法进行处理，上机时色谱柱采用Inertsil C8-3，流动相采用色谱纯的甲醇及
0.2%的甲酸溶液，流速为300 PL/min，柱温为30 °C，进样量为30 μ?。
[0031]本试验利用液质联用对虾肉中的四环素类药物残留进行测试时，取样量为I g，提取液使用量是15 mL，加标量是混标500 Pg/kg，样品及加标试验中的提取液均稀释4倍，最后定容至2 mL。经测试得知，上机所用试样中的含量为38.53 Pg/kg，加标回收率为72.1%，经过计算最终得出样品中的四环素类药物的含量为641.3 Pg/kg，与试纸条法测得的结果一致。
[0032]本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种检测四环素类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水垫依次搭接在所述PVC底板上，其特征在于:所述结合垫包被设有四环素类单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有四环素类药物抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。2.一种检测四环素类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤一、胶体金的制备:取I个250 mL烧杯，加入100 mL 0.01%氯金酸溶液，于恒温磁力搅拌器上使用温度档400 °C对其进行加热，加热至沸腾状态后，沸腾时的实际温度为100 °C，保持沸腾30 s后，将温度档变为200 °C，同时转速档调至200 r/min，向烧杯中快速加入500 μ? 4%柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变为红色后再加热10 min，即制得胶体金; 步骤二、金标抗体的制备及纯化:取调好PH为7.9的所述胶体金I mL于1.5 mL离心管中，向离心管中加入9.6 Pg/ml，稀释倍数为6的四环素类单克隆抗体，用涡旋仪涡旋2 min后静置30 min;向离心管中加入100 μ? 10% BSA溶液，用涡旋仪涡旋2 min，静置30 min,制得金标抗体，即四环素类单克隆抗体-胶体金标记物； 同时，将制得的金标抗体溶液于4 0C 2500 r/min，离心20 min，去除下层沉淀，将上清液转到另一离心管中，于4 0C 12000 r/min，离心30 min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释溶液稀释至原体积的1/10，于4 ^保存备用； 步骤三、试纸条的组装:(I)将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC底板上，吸水垫压住NC膜上方1-2 mm ; (2)将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上切割成4 _宽的试纸条；(3)将样品垫和结合垫切成4 mm宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗体溶液中，并于37°C烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫剪成I cm长的小块并贴于PVC底板上，金标垫压住NC膜下方1-2 mm，同时用样品垫压住金标垫下方1-2 mm，根据试纸条长度修剪样品垫；(5)在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被四环素类药物抗原和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线，其中，四环素类药物抗原包被浓度为1.0 mg/mL ;羊抗鼠IgG包被浓度为0.75 mg/mL。3.如权利要求2所述的一种检测四环素类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法的制备方法，其特征在于:在所述步骤三(3)中，还包括对样品垫和金标垫进行前处理的步骤，即将样品垫与金标结合垫用切条机分别切成4 mm宽的长条，用含有5%的蔗糖、5%BSA和终体积浓度为0.1%的pH为7.9的0.01 mo I/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后将溶液沥干，在37 °C条件下烘干12 h备用。4.如权利要求2所述的一种检测四环素类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法的制备方法，其特征在于:还包括步骤一之前对试验所用容器的清洗:首先将试验所用容器在重铬酸钾洗液中浸泡24 h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3次；将清洗干净的容器于二氯甲硅烷含量为5%的氯仿中浸泡I min后进行硅化处理；将经过硅化处理过的容器放置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中37°C进行干燥处理，备用。
【专利摘要】本发明公开了一种检测四环素类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水垫依次搭接在所述PVC底板上，所述结合垫包被设有四环素类单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有四环素类药物抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG；本发明同时公开了上述胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括胶体金的制备、金标抗体的制备及纯化及试纸条的组装步骤。本发明的胶体金免疫层析试纸条具有特异性强、灵敏度高、操作简便，检测快速、准确并适合现场使用的特点。
【IPC分类】G01N33/558
【公开号】CN104977407
【申请号】CN201510257683
【发明人】苏国成, 苏文金, 周常义, 李健, 郭然
【申请人】集美大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年5月20日