检测噻虫啉的elisa试剂盒及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于检测技术领域，具体设及一种用于定量检测唾虫咐残留量的酶联免疫 试剂盒及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 酶联免疫分析法（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)作为新兴的农药 残留检测方法，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、检测快速、投入少、测定结果可靠等优 点。美国化学学会（A0AC)已将免疫分析与气相色谱、液相色谱同列为农药残留检测的S大 支柱技术。美国环境保护署扣SEPA)、美国农业部食品安全检验司（FSIS-USDA)和美国化 学学会制定了农药残留免疫检验商品试剂盒评定和认可的建议准则，明确了测定结果的法 律效应。自从Hammock等首次将免疫技术用于农药残留分析W来，已有几十余种农药建立 了酶联免疫分析方法，几乎包括了杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物（昆虫）生长调节剂等所有 农药类别，其中杀虫剂有对硫磯、亚胺硫磯、甲基对硫磯、杀惧硫磯、甲基毒死婢、=挫磯、毒 死婢、甲胺磯、西维因、快喃丹、氯戊菊醋、灭多威等；杀菌剂有S挫酬、唾菌灵、克菌丹、异菌 眯、硝苯挫、福美双等；除草剂有草甘麟、百草枯、2, 4-D、阿特拉津、麦草畏、西玛津、化草胺、 扑草净、精嗟禾灵、氯横隆等；植物（昆虫）生长调节剂有抑芽丹、氣虫脈、甲氧保幼激素等。
[0003] 唾虫咐是德国拜耳农用化学品公司开发的新型氯代烟碱类杀虫剂，主要作用于昆 虫神经接合后膜，通过与烟碱己酷胆碱受体结合，干扰昆虫神经系统正常传导，引起神经通 道的阻塞，造成己酷胆碱的大量积累，从而使昆虫异常兴奋，全身疫李、麻搏而死。该种农药 作用特点是；具有较强的内吸、触杀和胃毒作用，既可用于茎叶处理，也可用于±壤、种子处 理。能够防治水稻、蔬菜、果树、棉花和马铃馨等作物上的大多数害虫，对稻萄马、稻飞風等 害虫有较好的防治效果。随着唾虫咐使用范围和用量的增大，其在水体、±壤乃至农产品 中检出频率和检出浓度越来越高。发展环境中痕量唾虫咐的分析方法，是研究唾虫咐的环 境行为和科学评估唾虫咐环境风险的前提。目前对唾虫咐的分析主要使用高效液相色谱 法（HPLC)，如韩振泰等采用HPLC法检测白蜡枝叶中唾虫咐的含量方法回收率达到95. 7~ 97. 8%，检测限为0.Olmgm。，该方法具有很强的代表性，可行性很强；胡敏等使用反向 HPLC测定蔬果中的唾虫咐含量，该方法稳定，变异系数小于0. 201 %，回收率高达99. 89%。 但是，仪器检测方法还存在诸多不足，如测试成本高、分析时间长、前处理步骤繁琐及对操 作人员要求较高等，不能满足环境水体、±壤、农产品等中唾虫咐残留的快速检测的需要。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种检测唾虫咐的化ISA试剂盒，其 检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。
[0005] 本发明还要解决的技术问题是提供上述化ISA试剂盒的制备方法。
[0006] 本发明最后要解决的技术问题是提供上述化ISA试剂盒的应用。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0008] -种检测唾虫咐的ELISA试剂盒，它包括；用唾虫咐包被抗原包被的酶标板、唾虫 咐标准品、唾虫咐多克隆抗体工作液、唾虫咐酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液 和浓缩洗漆液。
[0009] 其中，所述的唾虫咐包被抗原包被的酶标板按如下方法制备得到；将唾虫咐半抗 原与卵清白蛋白（OVA)偶联得到唾虫咐包被抗原附着于酶标板中。
[0010] 其中，所述的唾虫咐半抗原的制备方法记载于中国专利2015103352632中，专利 名称是一种唾虫咐半抗原的合成方法。具体方式是：在氮气保护下将唾虫咐、琉基丙酸 (3-MPA)和氨氧化钟化0H)混合，然后加入二甲亚讽值MS0)，揽拌至全部溶解；缓慢升温至 95~100°C，在95~100°C保温反应2~化；将反应体系降温至20~25°C，向该反应体系 中加水，随后使用盐酸调节反应体系的抑值至3~4 ;向反应体系中加S氯甲烧进行萃取， 收集下层有机层；用盐酸调节有机层液体的抑值至5~6,抽滤，滤液减压脱干得到的固体 用甲醇打浆溶解，过滤，滤液减压脱干得到产物；产物过硅胶柱，旋蒸，得到唾虫咐半抗原纯 品。
[0011] 其中，所述的唾虫咐标准品，其溶质唾虫咐的浓度为4. 096yg/ml，溶剂为水。
[0012] 其中，所述的唾虫咐多克隆抗体工作液是采用唾虫咐人工抗原免疫兔制得唾虫咐 多克隆抗体，再将唾虫咐多克隆抗体用稀释液按体积比稀释成1:3200的比例，所述的稀释 液为含5mg/mlBSA的PBS溶液。
[0013] 其中，所述的唾虫咐酶标二抗工作液是将酶标二抗用稀释液按体积比稀释成 1:5000的比例，所述的稀释液为含5mg/mlBSA的PBS溶液。
[0014] 其中，所述的底物液A为含有0. 5mmol/L的过氧化氨脈的巧樣酸-磯酸氨二钢缓 冲溶液（P册.0~5. 4);所述的底物液B为2mg/ml的四甲基联苯二胺的己醇溶液；所述的 终止液为2mol/L的硫酸水溶液；所述浓缩洗漆液是10倍浓缩洗漆液，所述浓缩洗漆液为 0.Olmol/L、抑 7. 0 ~7. 5 的PBST(注；lOOmLPBST中含 0. 5血吐温-20)。
[0015] 上述检测唾虫咐的化ISA试剂盒的制备方法，它包括如下步骤：
[0016] (1)用唾虫咐包被抗原包被的酶标板的制备：
[0017] 将唾虫咐半抗原与卵清白蛋白偶联得到唾虫咐包被抗原，将唾虫咐包被抗原稀释 成0. 25yg/ml，100化/孔在酶标板上点样，4, °C过夜；取出酶标板甩掉板内液体，用10倍 稀释后的浓缩洗漆液300yL/孔洗板3次，30s/次；然后加入含5mg/mlBSA的PBS溶液封 闭，380yL/孔在上述酶标板上点样，37°C放置化，用10倍稀释后的浓缩洗漆液300yL/孔 洗板3次，30s/次，拍干；将酶标板真空密封后置4°C下保存；
[0018] 其中，将唾虫咐半抗原与卵清白蛋白偶联得到唾虫咐包被抗原，具体步骤为：取 0. 2mmol唾虫咐半抗原，溶于3血无水N,N-二甲基甲酯胺值MF)，加入46mgN-哲基了二酷 亚胺（N服）和78mg1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亚胺盐酸盐巧DC) ?肥L。室温避 光揽拌反应过夜。取44mg卵清白蛋白（OVA)溶于15mL棚酸盐缓冲液（0. 2mol/L，p服.7)。 然后在比内将上述过夜活化的半抗原溶液加入OVA溶液中，使半抗原与OVA的摩尔比约为 30:1，室温揽拌反应化后，于4°C反应过夜。用蒸馈水透析3d，每天换水3次，透析液冷冻 干燥即得唾虫咐包被抗原（T肥-OVA)。
[0019] (2)唾虫咐标准品的制备；
[0020] 称取0. 0004g唾虫咐标准品，用蒸馈水定容至100血，得到浓度为4096ng/mL的 母液，依次按二倍比稀释，分别得到浓度为2048ng/血、1024ng/血、512ng/血、256ng/血、 128ng/血、64ng/血、3化g/血、16ng/mL、8ng/血、4ng/mL、化g/血、Ing/血的标准品溶液，同时 补充空白Ong/mL的柄;准品洛浓。
[0021] (3)唾虫咐多克隆抗体工作液的制备；
[0022] 采用唾虫咐人工抗原免疫兔制得唾虫咐多克隆抗体，将唾虫咐多克隆抗体用稀释 液按体积比稀释成1:3200的比例即得，所述的稀释液为含5mg/mlBSA的PBS溶液；
[0023] 其中，采用唾虫咐人工抗原免疫兔制得唾虫咐多克隆抗体，具体步骤为：选用3月 龄健康大白兔，通过S次免疫，第1周给家兔注射卡介苗0. 2mL/只（约15mg)，采耳血，备 用。首次免疫用完全佐剂〇.5mL加抗原Img，充分混匀，背部皮内多点注射。2周后进行加 强免疫，不完全佐剂0. 5mL加抗原0. 5mg，充分混匀，背部皮内多点注射。4周后进行二次加 强免疫，不完全佐剂0. 5mL加抗原0. 5mg，充分混匀