、1024、2048、4096叫/111以在 450/630皿处测量吸光度值。
[0114] 百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度 值的平均值（双孔）除W第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘W100%，即
[011引
[0116] 其中B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B。一化pb标准溶液的平均吸光度 值。
[0117] W标准品百分吸光率为纵坐标，W唾虫咐标准品浓度（ppb)的半对数为横坐标绘 制标准曲线，求出直线方程。标准曲线见附图1。y=- 0. 0489X+0. 4414，R2=0. 9168。将 样本的B/B0值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应样本的浓度，乘W其对应的稀释 倍数即为样本中唾虫咐的实际浓度。
【主权项】
1. 一种检测噻虫啉的ELISA试剂盒，其特征在于，它包括：用噻虫啉包被抗原包被的酶 标板、噻虫啉标准品、噻虫啉多克隆抗体工作液、噻虫啉酶标二抗工作液、底物液A、底物液 B、终止液和浓缩洗涤液。2. 根据权利要求1所述的检测噻虫啉的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的噻虫啉包被 抗原包被的酶标板按如下方法制备得到：将噻虫啉半抗原与卵清白蛋白偶联得到噻虫啉包 被抗原附着于酶标板中。3. 根据权利要求1所述的检测噻虫啉的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的噻虫啉标 准品，其溶质噻虫啉的浓度分别为 4096ng/ml、2048ng/mL、1024ng/mL、512ng/mL、256ng/mL、 128ng/mL、64ng/mL、32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、lng/mL、Ong/mL，溶剂为水。4. 根据权利要求1所述的检测噻虫啉的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的噻虫啉多克 隆抗体工作液是采用噻虫啉人工抗原免疫兔制得噻虫啉多克隆抗体，再将噻虫啉多克隆抗 体用稀释液按体积比稀释成1:3200的比例，所述的稀释液为含5mg/ml BSA的PBS溶液。5. 根据权利要求1所述的检测噻虫啉的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的噻虫啉酶 标二抗工作液是将酶标二抗用稀释液按体积比稀释成1:5000的比例，所述的稀释液为含 5mg/ml BSA 的 PBS 溶液。6. 根据权利要求1所述的检测噻虫啉的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的底物液A为 含有0. 5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述的底物液B为2mg/ml 的四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述的终止液为2mol/L的硫酸水溶液；所述浓缩洗涤液是 10倍浓缩洗涤液，所述浓缩洗涤液为〇. 〇lmol/L、pH 7. 0~7. 5的PBST。7. 权利要求1所述的检测噻虫啉的ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，它包括如下 步骤： (1) 用噻虫啉包被抗原包被的酶标板的制备： 将噻虫啉半抗原与卵清白蛋白偶联得到噻虫啉包被抗原；将噻虫啉包被抗原稀释成 0. 25 μg/ml，IOOy L/孔在酶标板上点样，4, °C过夜；取出酶标板甩掉板内液体，用10倍稀 释后的浓缩洗涤液300 y L/孔洗板3次，30s/次；然后加入含5mg/ml BSA的PBS溶液封闭， 380 y L/孔在上述酶标板上点样，37°C放置2h，用10倍稀释后的浓缩洗涤液300 y L/孔洗 板3次，30s/次，拍干；将酶标板真空密封后置4°C下保存； (2) 嗤虫琳标准品的制备： 称取0. 0004g噻虫啉标准品，用蒸馏水定容至100mL，得到浓度为4096ng/mL的母液，依 次按二倍比稀释，分别得到浓度为 2048ng/mL、1024ng/mL、512ng/mL、256ng/mL、128ng/mL、 64ng/mL、32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、Ing/mL 的标准品溶液，同时补充空白 Ong/mL的标准品溶液； (3) 噻虫啉多克隆抗体工作液的制备： 采用噻虫啉人工抗原免疫兔制得噻虫啉多克隆抗体，将噻虫啉多克隆抗体用稀释液按 体积比稀释成1:3200的比例即得，所述的稀释液为含5mg/ml BSA的PBS溶液； (4) 噻虫啉酶标二抗工作液的制备： 将酶标二抗用稀释液按体积比稀释成1:5000的比例，所述的稀释液为含5mg/ml BSA 的PBS溶液； (5) 底物液A和底物液B的制备： 所述的底物液A为含有0. 5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液； 所述的底物液B为2mg/ml四甲基联苯二胺的乙醇溶液； (6) 终止液的制备： 2mol/L的硫酸水溶液； (7) 浓缩洗涤液的制备： 0? 01mol/L 的 PBST。8. 权利要求1所述的检测噻虫啉的ELISA试剂盒在检测噻虫啉中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的噻虫啉为存在于土壤中的噻虫啉， 噻虫啉在土壤中的含量为0. 001 y g/ml~4. 096 y g/ml。10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，该方法包括以下步骤： (a) 预处理待测样品，将待测试的样品处理为液体样品，并将其复溶于稀释液中，所述 的稀释液为含5mg/ml BSA的PBS溶液； (b) 将试剂盒中的所有试剂从冷藏环境中取出，置于室温条件下平衡30min以上，每种 试剂使用前须摇匀； (c) 取用噻虫啉包被抗原包被的酶标板，加入预处理后的待测样品或标准品和噻虫啉 多克隆抗体工作液按体积比1:1的预混液，每孔100 U L，37°C保温2h，PBST洗涤3次，拍干； (d) 向步骤（c)得到的酶标板中加入噻虫啉酶标二抗工作液，每孔IOOy L，37°C保温 lh，PBST洗涤3次，拍干； (e) 向步骤（d)得到的酶标板中加入底物液A 50 y L/孔，底物液B 50 y L/孔，轻轻振 荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应5min ; (f) 向步骤（e)得到的酶标板中加入终止液50 y L/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值，在5min内读完数据； (g) 以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计 算样品中噻虫啉的含量。11. 根据权利要求10所述的应用，其特征在于，将待测试的样品处理为液体样品，具体 按照如下步骤处理： (I) 配制浸提液：使用质量比为2:1的浓硫酸和浓硝酸混合液调节蒸馏水的pH值为 3. 20±0. 05 ; (II) 将待测试样品研磨、破碎，过9. 5_筛； (III) 称取经过步骤（II)处理后的样品50~100g置于具盖容器中，于105°C下烘干， 恒重至两次称量值的误差小于±1%，计算样品含水率； (IV) 称取经过步骤（III)处理后的样品150~200g，置于2L具旋盖和内盖的广口瓶 中，根据样品的含水量，按液固比为10L: Ikg计算出所需浸提液的体积，加入浸提液，盖紧 瓶盖后固定在翻转式振荡装置上，调节转速为30 ± 2r/min，于23 ± 2°C下振荡18 ± 2h，振荡 过程中定时打开提取瓶，释放过度的压力； (V) 在压力过滤器上装好0. 45 y m滤膜，用稀硝酸淋洗过滤器和滤膜，弃去淋洗液，过 滤并收集滤液； (VI) 用6mol/L盐酸溶液调节步骤（V)得到的滤液pH值至6. 0±0. 05,待测。
【专利摘要】本发明公开了一种检测噻虫啉的ELISA试剂盒，它包括：用噻虫啉包被抗原包被的酶标板、噻虫啉标准品、噻虫啉多克隆抗体工作液、噻虫啉酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。本发明还公开了上述试剂盒的制备方法与应用。本发明的试剂盒，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。
【IPC分类】G01N33/543, G01N1/28, G01N33/531
【公开号】CN104977403
【申请号】CN201510394552
【发明人】程燕, 焦少俊, 姜锦林, 卜元卿, 周军英, 单正军
【申请人】环境保护部南京环境科学研究所
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年7月7日